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[摘要] 目的 选择6种临床用烤瓷金属材料进行细胞毒性的检测和比较。方法 采用四甲基偶氮唑蓝比色法来测定金属材料析出离子对体外培养细胞的影响，评定6种烤瓷金属材料的毒性作用。 结果 镍铬合金、含钛的镍铬瓷合金、银钯合金抑制细胞增殖明显，纯钛、钴铬合金次之，金合金基本不影响细胞增殖。 结论 应根据临床情况和合金细胞毒性情况合理选用烤瓷金属材料。
[关键词] 烤瓷金属；细胞毒性；MTT比色法
[中图分类号] R783.1；R965 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-171-02
金属烤瓷冠戴用后常出现牙龈变色、红肿、牙龈指数增加等现象。除了口腔内的牙石、菌斑和修复体不密合的边缘会刺激牙龈，有研究发现戴用金属修复体患者的唾液、口腔软组织中可检测到相关金属离子浓度高于正常人水平[1]。体外试验表明，牙科合金释放出的金属离子具有降低细胞代谢、抑制细胞增殖等毒性作用[2]。临床常用的烤瓷金属材料有镍铬合金、含镍钛合金、钴铬合金、纯钛金属、钯银合金、金合金，这些金属生物相容性有无差别，一直是临床口腔医生和患者关心的问题。本实验用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法来评价这6种合金的细胞毒性，为其临床使用安全性提供可靠的生物学依据。
1 资料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 烤瓷金属材料 镍铬烤瓷合金KND/CW-CC （成都科宁达材料有限公司），含钛镍铬合金NEOTITAN（美国Neodontics公司），钴铬烤瓷合金（德国BEGO公司），纯钛TA2（西北有色金属研究院），银钯合金（WIELAND公司），金合金BioPortadur（WIELAND公司）。
1.1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）：加入5%的小牛血清、青霉素钠100 U/mL，硫酸链霉素100 U/mL，调节pH至7. 2；PBS液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.56 g，KH2PO4 0.2 g，蒸馏水1000 mL；胰蛋白酶和MTT（Amresco公司）；DMSO（Sigma公司）。
1.1.3 细胞株 小鼠成纤维细胞株（L929），来自中国科学院细胞库。
1.1.4 仪器 牙科高频自动离心铸造机LZ50-I（天津市利众电子有限公司），KSW温控箱式电阻炉（沈阳市节能电炉厂），BEGO Topstar喷砂机，CO2培养箱（美国Forma公司），Model 2450酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司），96孔细胞培养板，可调微量移液器。
1.2 方法
1.2.1 制备合金试样 用同一模具翻制蜡型，将6种合金铸造成直径5 mm，高3 mm的圆柱体。每种合金10个试样。常规打磨喷砂，将试样进行清洁：用无水乙醇浸泡脱脂，在蒸馏水中超声清洗10 min，然后在 121℃下高压蒸汽灭菌20 min备用。
1.2.2 合金浸提液制备 在装有每个合金试样的Eppendof 管中分别加入0.47 mL 1640培养液（合金暴露面积为86.3 mm2，RPMI 1640培养液与试样表面积之比为0.55 mL/cm2）。在37℃、5%CO2、湿度95%培养箱下保存，浸泡3 d后收集合金浸提液。
1.2.3 MTT实验测定合金细胞毒性 小鼠成纤维细胞L929复苏后，RPMI 1640培养液培养，接种细胞：配成密度为6.0×104/mL的单个细胞悬液，并接种于96孔板，孵育24 h。待细胞贴壁后，弃掉原液，并加入6种金属浸提液及空白对照组（空白对照组用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液）。48 h后，每孔中加入MTT 20 μL，孵育4 h。PBS 150μL洗2次，加入DMSO 150μL，25 min后用酶标仪在490 nm下检测每孔吸光度值（A值）。
1.3 评价标准
计算细胞相对增殖率（RGR），RGR=实验组A值/阴性对照组A值×100%。并根据国家标准[3]，把RGR值转换成0~4级以评定材料的细胞毒性：RGR≥100%为0级，80%~99%为1级，50%~79%为2级，30~49%为3级，0~29%为4级。
2 结果
计算6种材料吸光度均值及RGR，可见镍铬合金、含钛的镍铬瓷合金、银钯合金抑制细胞增殖明显，纯钛、钴铬合金次之，金合金基本不影响细胞增殖。见表1。
3 讨论
在生物材料相容性的多种研究方法中，最常用的是体外细胞培养法，它能直接观察生物材料与细胞复合生长的情况。文献中，对非植入部位医疗器械进行的细胞毒性实验中，采用的细胞株以L929鼠成纤维细胞的使用最广泛。L929小鼠成纤维细胞对生长环境因素比较敏感，可以充分反映出细胞生长对毒性物质的反应。MTT比色法是基于对细胞线粒体内脱氢酶的测定而间接判定细胞状况的一种方法[4]。MTT是一种能接受氢原子的四唑盐染料，活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中。MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。因而通过分光光度计测定 MTT结晶形成量可间接反映细胞数量与活力，对该材料的细胞毒性作出可靠的定量评价。
镍铬合金、含钛镍铬合金、钴铬合金、纯钛金属、钯银合金、金合金是口腔修复领域最常用的材料，这6种铸造合金在口腔内析出的金属离子直接与牙龈接触。镍铬烤瓷合金在临床上使用广泛，由于镍和镍化合物都有潜在的毒性和致癌性，越来越多的学者对镍的生物相容性提出质疑。在本试验中也可以看到镍铬烤瓷合金抑制细胞增殖最明显。研究表明，镍可引起过敏，降低细胞增殖率，使白细胞所分泌的炎症因子的量发生改变，改变中性粒细胞的趋化功能[1-2]。含钛镍铬烤瓷合金在临床上已有多年，其含钛量一般为4%～6%，部分研究认为镍铬合金中加入少量的钛可以在合金表面形成致密的氧化钛（TiO2）膜，使合金的抗腐蚀性得到改善，但临床试验认为含钛镍铬合金烤瓷冠在颈缘染色方面未较镍铬合金烤瓷冠取得明显的改善[5]。钴铬合金具备贵金属合金与非贵金属合金的优点，不含镍铍等元素，有优良的生物相容性，并能够与高膨胀性低熔瓷粉结合。银钯合金合金虽然被列为贵金属，优点是延展性好，其耐电化学腐蚀性仅次于金合金[6]。但由于银合金的银元素具有细胞毒性，其生物相容性仅和镍铬合金相似。金合金化学性能稳定，抗腐蚀性能优良，不易氧化变色，铸造性能良好，是应考虑首选的烤瓷合金。纯钛在机械强度，抗腐蚀性和生物性能方面优于镍铬和钴铬合金，但由于高温下表面易形成影响金瓷结合能力的氧化膜，使其在烤瓷方面的使用尚待研究提高。
本资料研究表明：金合金具有良好的生物相容性，钴铬合金、纯钛次之，镍铬合金、含钛镍铬合金、银钯合金的生物相容性基本相似。牙体修复医生应根据临床情况和金属材料细胞毒性合理选用烤瓷金属材料。
[参考文献]
[1] Wataha JC，Malcolm CT，Hanks CT.Correlation Between Cytotoxicity and Elements released by Dental Casting Alloys[J].Int J Prothodont，1995，8（1）：9-14.
[2] Bumgardner JD，Lucas LC.Cellular Response to Metallic Ions Released from Nickel2chromium Dental Alloys[J].J Dent Res，1995，74（8）：1512-1517.
[3] GB/T 14233.2-2005，医用输液、输血、注射器具检验方法[S].北京：中国标准出版社，2005：9.
[4] 吕晓迎，Kappert HF.牙科材料细胞毒性评定的新方法（MT试验）[J].中华口腔医学杂志，1995，30（2）：377-379.
[5] 叶剑涛，常少海，潘朝斌，等.含钛镍铬合金烤瓷冠临床应用效果观察[J].广东牙病防治，2003，11（2）：137-138.
[6] 陈治清.口腔材料学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2008：161.
（收稿日期：2012-02-09）
[关键词] 烤瓷金属；细胞毒性；MTT比色法
[中图分类号] R783.1；R965 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）05-171-02
金属烤瓷冠戴用后常出现牙龈变色、红肿、牙龈指数增加等现象。除了口腔内的牙石、菌斑和修复体不密合的边缘会刺激牙龈，有研究发现戴用金属修复体患者的唾液、口腔软组织中可检测到相关金属离子浓度高于正常人水平[1]。体外试验表明，牙科合金释放出的金属离子具有降低细胞代谢、抑制细胞增殖等毒性作用[2]。临床常用的烤瓷金属材料有镍铬合金、含镍钛合金、钴铬合金、纯钛金属、钯银合金、金合金，这些金属生物相容性有无差别，一直是临床口腔医生和患者关心的问题。本实验用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法来评价这6种合金的细胞毒性，为其临床使用安全性提供可靠的生物学依据。
1 资料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 烤瓷金属材料 镍铬烤瓷合金KND/CW-CC （成都科宁达材料有限公司），含钛镍铬合金NEOTITAN（美国Neodontics公司），钴铬烤瓷合金（德国BEGO公司），纯钛TA2（西北有色金属研究院），银钯合金（WIELAND公司），金合金BioPortadur（WIELAND公司）。
1.1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）：加入5%的小牛血清、青霉素钠100 U/mL，硫酸链霉素100 U/mL，调节pH至7. 2；PBS液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.56 g，KH2PO4 0.2 g，蒸馏水1000 mL；胰蛋白酶和MTT（Amresco公司）；DMSO（Sigma公司）。
1.1.3 细胞株 小鼠成纤维细胞株（L929），来自中国科学院细胞库。
1.1.4 仪器 牙科高频自动离心铸造机LZ50-I（天津市利众电子有限公司），KSW温控箱式电阻炉（沈阳市节能电炉厂），BEGO Topstar喷砂机，CO2培养箱（美国Forma公司），Model 2450酶联免疫检测仪（Bio-Rad公司），96孔细胞培养板，可调微量移液器。
1.2 方法
1.2.1 制备合金试样 用同一模具翻制蜡型，将6种合金铸造成直径5 mm，高3 mm的圆柱体。每种合金10个试样。常规打磨喷砂，将试样进行清洁：用无水乙醇浸泡脱脂，在蒸馏水中超声清洗10 min，然后在 121℃下高压蒸汽灭菌20 min备用。
1.2.2 合金浸提液制备 在装有每个合金试样的Eppendof 管中分别加入0.47 mL 1640培养液（合金暴露面积为86.3 mm2，RPMI 1640培养液与试样表面积之比为0.55 mL/cm2）。在37℃、5%CO2、湿度95%培养箱下保存，浸泡3 d后收集合金浸提液。
1.2.3 MTT实验测定合金细胞毒性 小鼠成纤维细胞L929复苏后，RPMI 1640培养液培养，接种细胞：配成密度为6.0×104/mL的单个细胞悬液，并接种于96孔板，孵育24 h。待细胞贴壁后，弃掉原液，并加入6种金属浸提液及空白对照组（空白对照组用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液）。48 h后，每孔中加入MTT 20 μL，孵育4 h。PBS 150μL洗2次，加入DMSO 150μL，25 min后用酶标仪在490 nm下检测每孔吸光度值（A值）。
1.3 评价标准
计算细胞相对增殖率（RGR），RGR=实验组A值/阴性对照组A值×100%。并根据国家标准[3]，把RGR值转换成0~4级以评定材料的细胞毒性：RGR≥100%为0级，80%~99%为1级，50%~79%为2级，30~49%为3级，0~29%为4级。
2 结果
计算6种材料吸光度均值及RGR，可见镍铬合金、含钛的镍铬瓷合金、银钯合金抑制细胞增殖明显，纯钛、钴铬合金次之，金合金基本不影响细胞增殖。见表1。
3 讨论
在生物材料相容性的多种研究方法中，最常用的是体外细胞培养法，它能直接观察生物材料与细胞复合生长的情况。文献中，对非植入部位医疗器械进行的细胞毒性实验中，采用的细胞株以L929鼠成纤维细胞的使用最广泛。L929小鼠成纤维细胞对生长环境因素比较敏感，可以充分反映出细胞生长对毒性物质的反应。MTT比色法是基于对细胞线粒体内脱氢酶的测定而间接判定细胞状况的一种方法[4]。MTT是一种能接受氢原子的四唑盐染料，活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中。MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。因而通过分光光度计测定 MTT结晶形成量可间接反映细胞数量与活力，对该材料的细胞毒性作出可靠的定量评价。
镍铬合金、含钛镍铬合金、钴铬合金、纯钛金属、钯银合金、金合金是口腔修复领域最常用的材料，这6种铸造合金在口腔内析出的金属离子直接与牙龈接触。镍铬烤瓷合金在临床上使用广泛，由于镍和镍化合物都有潜在的毒性和致癌性，越来越多的学者对镍的生物相容性提出质疑。在本试验中也可以看到镍铬烤瓷合金抑制细胞增殖最明显。研究表明，镍可引起过敏，降低细胞增殖率，使白细胞所分泌的炎症因子的量发生改变，改变中性粒细胞的趋化功能[1-2]。含钛镍铬烤瓷合金在临床上已有多年，其含钛量一般为4%～6%，部分研究认为镍铬合金中加入少量的钛可以在合金表面形成致密的氧化钛（TiO2）膜，使合金的抗腐蚀性得到改善，但临床试验认为含钛镍铬合金烤瓷冠在颈缘染色方面未较镍铬合金烤瓷冠取得明显的改善[5]。钴铬合金具备贵金属合金与非贵金属合金的优点，不含镍铍等元素，有优良的生物相容性，并能够与高膨胀性低熔瓷粉结合。银钯合金合金虽然被列为贵金属，优点是延展性好，其耐电化学腐蚀性仅次于金合金[6]。但由于银合金的银元素具有细胞毒性，其生物相容性仅和镍铬合金相似。金合金化学性能稳定，抗腐蚀性能优良，不易氧化变色，铸造性能良好，是应考虑首选的烤瓷合金。纯钛在机械强度，抗腐蚀性和生物性能方面优于镍铬和钴铬合金，但由于高温下表面易形成影响金瓷结合能力的氧化膜，使其在烤瓷方面的使用尚待研究提高。
本资料研究表明：金合金具有良好的生物相容性，钴铬合金、纯钛次之，镍铬合金、含钛镍铬合金、银钯合金的生物相容性基本相似。牙体修复医生应根据临床情况和金属材料细胞毒性合理选用烤瓷金属材料。
[参考文献]
[1] Wataha JC，Malcolm CT，Hanks CT.Correlation Between Cytotoxicity and Elements released by Dental Casting Alloys[J].Int J Prothodont，1995，8（1）：9-14.
[2] Bumgardner JD，Lucas LC.Cellular Response to Metallic Ions Released from Nickel2chromium Dental Alloys[J].J Dent Res，1995，74（8）：1512-1517.
[3] GB/T 14233.2-2005，医用输液、输血、注射器具检验方法[S].北京：中国标准出版社，2005：9.
[4] 吕晓迎，Kappert HF.牙科材料细胞毒性评定的新方法（MT试验）[J].中华口腔医学杂志，1995，30（2）：377-379.
[5] 叶剑涛，常少海，潘朝斌，等.含钛镍铬合金烤瓷冠临床应用效果观察[J].广东牙病防治，2003，11（2）：137-138.
[6] 陈治清.口腔材料学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2008：161.
（收稿日期：2012-02-09）