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【摘要】 采用Eclipse XD6-C18柱为分析柱，0.1％磷酸溶液（pH=2.0）与甲醇为流动相，紫外210nm检测，建立了饮料中酒石酸、苹果酸、柠檬酸含量的高效液相色谱方法。实验研究了流动相和其他操作条件的选择方法，并且研究了每种酸在各自浓度范围内测定的线性关系、回归方程、相关系数以及相对标准偏差。实验显示：方法的回收率为104.0％；酒石酸、苹果酸、柠檬酸的检出限(S/N=3)分别为0.00474 g/L、0.01115 g/L、0.01270g/L。
【关键词】 反相高效液相色谱法，饮料，有机酸
一、引 言
有机酸是饮料中主要的风味营养物质，其含量高低与果汁制品的品质有密切的关系。此外，饮料中的有机酸还可促进消化腺的活动，有助于食物的吸收，改善患者的食欲。天然果汁营养丰富，深受消费者青睐，然而，由于水果原料和生产成本的限制，果汁的掺假现象时有发生。在某些情况下，可以用测定各种有机酸含量的方法来鉴别饮料是否掺假，因此饮料中有机酸含量的测定是一个有关部门关注的课题。有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大，而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少。
饮料中广泛存在的有机酸大都为低分子羧酸，主要的有机酸有乙酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等。其中主要起酸感作用的有机酸有五种，分别是：酒石酸，苹果酸，柠檬酸，乳酸和琥珀酸。这五种酸的口感不同：酒石酸给人感觉是尖酸粗硬，苹果酸是生青尖酸，柠檬酸是清新凉爽，乳酸的酸性比较弱，略带一些乳香，琥珀酸是先咸后苦。本实验中主要对苹果酸、柠檬酸、酒石酸这三种酸进行了定量和定性的分析。有机酸的酸性不同，在相同的浓度下，三种酸的酸性是苹果酸>酒石酸>柠檬酸。
饮料中常有的柠檬酸用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸具有显著的保健效果，它不仅能有效促进体内乳酸分解，解除疲劳，改善精神状态，而且能增进食欲，保护肝脏和肾脏，具有防治疾病和延缓衰老等诸多功效［8］柠檬汁中含有大量柠檬酸，柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起到抗凝血的作用。 临床上采取新鲜血液时,需要加入一些消毒过的柠檬酸钠或草酸钠,就能起到防止血液凝固的作用,所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗凝血剂。
L-苹果酸是一种重要的天然有机酸，口感接近天然苹果的酸味，与柠檬酸相比，具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，目前已成为继柠檬酸、乳酸之后用量排第三的食品酸味剂。 L－苹果酸目前主要有三种用途：一是用于食品和饮料工业。作为食品酸味剂，特别适用于果冻及以水果为基础的食品，有保持天然果汁色泽的作用，苹果酸具有抗疲劳和保护肝，肾，心脏的作用，可用于保健饮料。二是用于医药工业。苹果酸能增进药物的稳定性，改善人体对药物的吸收。苹果酸配入复合氨基酸注射液中，直接进入生物体的主要代谢循环－三羟酸循环，可以减少氨基酸的代谢损失和弥补肝功能缺陷，用于治疗尿毒症，高血压并可减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。三是作为工业中间体。苹果酸亦可用作皮肤的消毒剂，空氣的清洁剂和除臭。但由于价格较贵，故苹果酸的用途受到了一定的限制。
迄今为止，酒石酸主要来源是葡萄酒生产厂（注：酒石酸是葡萄汁发酵后的副产品之一）。酒石酸在食品工业中应用远远不如柠檬酸那样广泛，但它却是医药工业的重要原料。许多种难溶药物均可加工成为水溶性极佳的酒石酸盐（如经典药物“酒石酸锑钾”）。欧洲各大葡萄酒厂是世界最大的酒石酸生产基地，全球80%的酒石酸产自欧洲。
目前，有机酸的测定方法有酸碱滴定法、旋光法、气相色谱法，高效液相色谱法等。常规的有机酸分析一般采用化学法测定，但该方法易受干扰，预处理步骤较多，时间长，且只能测定食品中的总酸度；酶法虽然前处理简单，但每次只能测定一种有机酸；薄层色谱法一次可测定多种有机酸，但测量精度差，只能半定量和定性；气相色谱法仅适于测定挥发性有机酸，且需衍生处理，操作繁琐，准确度较低，难以用于热稳定性差和含量极低的有机酸分析方法；离子色谱法多采用稀强酸做淋洗液，对设备有一定的腐蚀作用；高效液相色谱法很适合于非挥发性物质的分析，测量精度好，灵敏度高，并且实现一机多用，一柱多用 。
高效液相色谱测定方法简便，特别是对于芳香族有机酸和多元酸，已被广泛用于各种食品和天然物中有机酸的测定［6,7］。本实验利用反相高效液相色谱法，对饮料中多种有机酸进行分析，取得较好的结果。并对测定条件进行了研究，建立了一种简便、准确的分析教学方法，以便于解决今后学生遇到的类似问题。
二、实验部分
1.仪器和试剂
Agilent1200型高效液相色谱仪
G1379B在线脱气
G1310A ISO pump
G1314B VWD检测器
YCQ100超声波清洗机（上海凯波超声波设备有限公司）
AB104-N电子天平
pHs－3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）
标准品酒石酸、苹果酸、柠檬酸；1%磷酸，1%醋酸，1%高氯酸，甲醇(AR)，二次蒸馏水。
2. 色谱条件
色谱柱：Eclipse XD6-Ｃ18柱（4.6×150ｍｍ，5μｍ）；
流动相：0.1%磷酸 （ pH为2.0） ：甲醇＝95：5
流速：0.8ml/min
柱温：室温
检测波长：210nm
进样量：10uL
3.测定步骤
3.1 标准溶液的制备：
分别称取酒石酸0.1264g、苹果酸0.1115g 柠檬酸0.1129g于100ml容量瓶中，二次蒸馏水定容，备用。
3.2 样品的制备：
选取当下市面上比较畅销的饮料样品，包括：康师傅鲜的每日C葡萄汁，苹果汁（杭州顶津食品有限公司），三得利超级维体（三得利食品贸易有限公司）和Scream（农夫山泉股份有限公司）进行实验。
吸取样品康师傅鲜的每日C葡萄汁，苹果汁，三得利超级维体，Scream各5毫升用0.45um滤膜过滤，稀释10倍超声波振荡后待用。
3.3饮料中各种有机酸的定性与定量分析：
定性分析：在相同的色谱条件下，将样品色谱图与有机酸标准液进行对照，根据确定样品中的各有机酸峰的保留时间来进行定性。还可以在样品液中加入一定量的有机酸标准溶液，观察在相同的保留时间下，峰面积是否增加，以此来进行定性分析。
定量测定：在标样与样品进样量相同的情况下，应用外标法定量，可计算出样品中各有机酸的含量。
三、结果与讨论
有机酸在水相中大部分以离子态存在，而离子在C18柱上几乎无保留，故采用抑制电离的方法，使其变为分子态的酸在柱子上保留而得到分离。选择合适的流动相能使色谱峰得到较好分离。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
【关键词】 反相高效液相色谱法，饮料，有机酸
一、引 言
有机酸是饮料中主要的风味营养物质，其含量高低与果汁制品的品质有密切的关系。此外，饮料中的有机酸还可促进消化腺的活动，有助于食物的吸收，改善患者的食欲。天然果汁营养丰富，深受消费者青睐，然而，由于水果原料和生产成本的限制，果汁的掺假现象时有发生。在某些情况下，可以用测定各种有机酸含量的方法来鉴别饮料是否掺假，因此饮料中有机酸含量的测定是一个有关部门关注的课题。有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大，而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少。
饮料中广泛存在的有机酸大都为低分子羧酸，主要的有机酸有乙酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等。其中主要起酸感作用的有机酸有五种，分别是：酒石酸，苹果酸，柠檬酸，乳酸和琥珀酸。这五种酸的口感不同：酒石酸给人感觉是尖酸粗硬，苹果酸是生青尖酸，柠檬酸是清新凉爽，乳酸的酸性比较弱，略带一些乳香，琥珀酸是先咸后苦。本实验中主要对苹果酸、柠檬酸、酒石酸这三种酸进行了定量和定性的分析。有机酸的酸性不同，在相同的浓度下，三种酸的酸性是苹果酸>酒石酸>柠檬酸。
饮料中常有的柠檬酸用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。柠檬酸具有显著的保健效果，它不仅能有效促进体内乳酸分解，解除疲劳，改善精神状态，而且能增进食欲，保护肝脏和肾脏，具有防治疾病和延缓衰老等诸多功效［8］柠檬汁中含有大量柠檬酸，柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起到抗凝血的作用。 临床上采取新鲜血液时,需要加入一些消毒过的柠檬酸钠或草酸钠,就能起到防止血液凝固的作用,所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗凝血剂。
L-苹果酸是一种重要的天然有机酸，口感接近天然苹果的酸味，与柠檬酸相比，具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，目前已成为继柠檬酸、乳酸之后用量排第三的食品酸味剂。 L－苹果酸目前主要有三种用途：一是用于食品和饮料工业。作为食品酸味剂，特别适用于果冻及以水果为基础的食品，有保持天然果汁色泽的作用，苹果酸具有抗疲劳和保护肝，肾，心脏的作用，可用于保健饮料。二是用于医药工业。苹果酸能增进药物的稳定性，改善人体对药物的吸收。苹果酸配入复合氨基酸注射液中，直接进入生物体的主要代谢循环－三羟酸循环，可以减少氨基酸的代谢损失和弥补肝功能缺陷，用于治疗尿毒症，高血压并可减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。三是作为工业中间体。苹果酸亦可用作皮肤的消毒剂，空氣的清洁剂和除臭。但由于价格较贵，故苹果酸的用途受到了一定的限制。
迄今为止，酒石酸主要来源是葡萄酒生产厂（注：酒石酸是葡萄汁发酵后的副产品之一）。酒石酸在食品工业中应用远远不如柠檬酸那样广泛，但它却是医药工业的重要原料。许多种难溶药物均可加工成为水溶性极佳的酒石酸盐（如经典药物“酒石酸锑钾”）。欧洲各大葡萄酒厂是世界最大的酒石酸生产基地，全球80%的酒石酸产自欧洲。
目前，有机酸的测定方法有酸碱滴定法、旋光法、气相色谱法，高效液相色谱法等。常规的有机酸分析一般采用化学法测定，但该方法易受干扰，预处理步骤较多，时间长，且只能测定食品中的总酸度；酶法虽然前处理简单，但每次只能测定一种有机酸；薄层色谱法一次可测定多种有机酸，但测量精度差，只能半定量和定性；气相色谱法仅适于测定挥发性有机酸，且需衍生处理，操作繁琐，准确度较低，难以用于热稳定性差和含量极低的有机酸分析方法；离子色谱法多采用稀强酸做淋洗液，对设备有一定的腐蚀作用；高效液相色谱法很适合于非挥发性物质的分析，测量精度好，灵敏度高，并且实现一机多用，一柱多用 。
高效液相色谱测定方法简便，特别是对于芳香族有机酸和多元酸，已被广泛用于各种食品和天然物中有机酸的测定［6,7］。本实验利用反相高效液相色谱法，对饮料中多种有机酸进行分析，取得较好的结果。并对测定条件进行了研究，建立了一种简便、准确的分析教学方法，以便于解决今后学生遇到的类似问题。
二、实验部分
1.仪器和试剂
Agilent1200型高效液相色谱仪
G1379B在线脱气
G1310A ISO pump
G1314B VWD检测器
YCQ100超声波清洗机（上海凯波超声波设备有限公司）
AB104-N电子天平
pHs－3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）
标准品酒石酸、苹果酸、柠檬酸；1%磷酸，1%醋酸，1%高氯酸，甲醇(AR)，二次蒸馏水。
2. 色谱条件
色谱柱：Eclipse XD6-Ｃ18柱（4.6×150ｍｍ，5μｍ）；
流动相：0.1%磷酸 （ pH为2.0） ：甲醇＝95：5
流速：0.8ml/min
柱温：室温
检测波长：210nm
进样量：10uL
3.测定步骤
3.1 标准溶液的制备：
分别称取酒石酸0.1264g、苹果酸0.1115g 柠檬酸0.1129g于100ml容量瓶中，二次蒸馏水定容，备用。
3.2 样品的制备：
选取当下市面上比较畅销的饮料样品，包括：康师傅鲜的每日C葡萄汁，苹果汁（杭州顶津食品有限公司），三得利超级维体（三得利食品贸易有限公司）和Scream（农夫山泉股份有限公司）进行实验。
吸取样品康师傅鲜的每日C葡萄汁，苹果汁，三得利超级维体，Scream各5毫升用0.45um滤膜过滤，稀释10倍超声波振荡后待用。
3.3饮料中各种有机酸的定性与定量分析：
定性分析：在相同的色谱条件下，将样品色谱图与有机酸标准液进行对照，根据确定样品中的各有机酸峰的保留时间来进行定性。还可以在样品液中加入一定量的有机酸标准溶液，观察在相同的保留时间下，峰面积是否增加，以此来进行定性分析。
定量测定：在标样与样品进样量相同的情况下，应用外标法定量，可计算出样品中各有机酸的含量。
三、结果与讨论
有机酸在水相中大部分以离子态存在，而离子在C18柱上几乎无保留，故采用抑制电离的方法，使其变为分子态的酸在柱子上保留而得到分离。选择合适的流动相能使色谱峰得到较好分离。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文