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摘要 目的：觀察血府逐瘀汤对冠心病模型鼠的治疗作用，探讨其对PI3K-AKT信号通路相关蛋白的影响。方法：将45只SD大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只。将模型组及中药组大鼠冠心病造模，中药组用2 g/mL血府逐瘀汤药液灌胃，空白组及模型组用等量的生理盐水灌胃，3组均连续灌胃10 d。观察各组大鼠造模前后ST段变化、心肌细胞凋亡、颈总动脉形态学变化、血脂水平、心肌组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平变化及大鼠腹主动脉血Bax及Bcl-2水平变化。结果：1）心电图显示经过冠心病模型制备大鼠心电图ST段变化高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），其中中药组较模型组改善，差异有统计学意义（P<0.05）;2）经过冠心病模型制备的大鼠血脂代谢均出现紊乱，总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、Bax明显升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及Bcl-2明显下降，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;经过中药干预后，大鼠血脂水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;3）Tunel检测显示经过冠心病模型制备大鼠心肌细胞凋亡率高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），中药组心肌细胞凋亡率低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;4）HE染色显示空白组大鼠冠状动脉管壁结构厚薄均匀，中内膜形状规则，结构完整;模型组内中膜明显增厚，动脉管壁明显凹凸不平，管腔狭窄，出现明显斑块;中药组管壁较模型组平滑，斑块较模型组减小;5）冠心病模型大鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平低于空白对照组，Bax水平高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）;中药干预后，大鼠上述指标表达改善效果优于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），各组AKT表达水平相近，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：血府逐瘀汤可明显逆转冠心病病理改变，其作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡有关。
关键词 冠心病模型;血府逐瘀汤;血脂;心肌细胞;凋亡;PI3K-AKT信号通路;冠状动脉管壁结构;血脂代谢
Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on Cardiomyocyte Apoptosis and Expression of Related Proteins in Rats with Coronary Heart Disease
ZHAO Yi，ZHANG Yuan，GANG Lili
（Beijing Changping Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Beijing 102208，China）
Abstract Objective：To observe the therapeutic effect of Xuefu Zhuyu Decoction on coronary heart disease（CHD）model rats and explore its effect on PI3K-AKT signaling pathway related proteins.Methods：A total of 45 SD rats were randomly divided into a blank group，a model group and a traditional Chinese medicine（TCM）group，with 15 rats in each group.CHD model was set up for the rats in the model group and the TCM group.The rats in TCM group were given 2 g/mL Xuefu Zhuyu Decoction by gavage.The rats in the blank group and the model group were given the same amount of normal saline by gavage.All the 3 groups were given gavage continuously for 10 days.The changes of ST segment，cardiomyocyte apoptosis，morphology of common carotid artery，blood lipid level，protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in myocardial tissue，and the levels of Bax and Bcl-2 in abdominal aorta were observed before and after modeling.Results：1）ECG showed that the ST segment change of rats after CHD model preparation was higher than that of the blank group（P<0.05），and the TCM group was better than that of the model group（P<0.05）; 2）the blood lipid metabolism of rats after CHD model preparation was disordered，with a significant increase in TC，TG，LDL-C，Bax and a significant decrease in HDL-C，bcl-2; compared with the blank group，the differences were statistically significant（P<0.05）.After the intervention of TCM，the blood lipid level of rats was higher than that of the model group（P<0.05）; 3）TUNEL detection showed that the apoptosis rate of cardiomyocytes in the model group was higher than that of the blank group（P<0.05），and the apoptosis rate of cardiomyocytes in the TCM group was lower than that of the model group（P<0.05）; 4）HE staining showed that the thickness of the coronary artery wall in the blank group was uniform，the shape of the intima was regular，and the structure was complete; the intima-media in the model group was significantly thickened，the arterial wall was significantly uneven，the lumen was narrow，and obvious plaque appeared; the wall of the TCM group was smoother than that of the model group，and the plaque was smaller than the model group; 5）the levels of PI3K，p-AKT and Bcl-2 in the CHD model rats were lower than those in the blank group.The concentration of Bax in the control group was higher than that in the blank group（P<0.05），and the improvement effect of the above indexes in the TCM group was better than that in the model group（P<0.05）.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoction can significantly reverse the pathological changes of coronary heart disease，and its mechanism may be related to the inhibition of cardiomyocyte apoptosis. Keywords Coronary heart disease model; Xuefu Zhuyu Decoction; Blood lipid; Cardiomyocyte; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Coronary artery wall structure; Blood lipid metabolism
中图分类号：R289.4;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.011
心血管疾病已然成为危害我国居民生命安全的主要疾病之一，其中冠心病占据主导位置，是心血管疾病第一死因[1]。历代医贤并无“冠心病”这一病名的记载，根据其临床征象将其归属于“胸痹”“血瘀”“痹证”等范畴，病位在心，《黄帝内经》云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓。”由此可见气血瘀滞、心脉不通是该病的主要病因病机，则行气活血、化瘀止痛是治则。血府逐瘀汤是经典的理血剂，首载于《医林改错》，现代临床不乏其有效治疗高脂血症、冠心病、脑血栓形成、高血压的记载[2-5]，但其作用机制目前尚无统一定论，基于此，本研究探讨血府逐瘀汤有效治疗冠心病的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取45只无特定病原体（Speciifc Pathogen Free，SPF）级SD雄性大鼠，所有大鼠均购自济南金丰实验动物有限公司，（许可证号：SCXK（鲁）2014 0006）。大鼠体质量190～230 g，平均体质量（225±5）g，鼠龄5～6个月，平均鼠龄（5.2±0.5）个月。所有大鼠均饲养于室温（23±0.5）℃、湿度（51±3）%环境中，自由摄食，12 h/12 h交替光照。3组大鼠在体质量、鼠龄、饲养环境等条件一致。
1.1.2 药物 制备血府逐瘀汤药液：桃仁12 g，红花、当归、生地黄、牛膝各9 g，川芎、桔梗各4.5 g，赤芍、枳壳、甘草各6 g，柴胡3 g。整方藥材置于全自动煎药机中浸泡30 min，水煎煮后滤出药液，再次加水煎煮后滤出药液，将2次药液混匀后浓缩为0.88 g/mL的药液，置于-20 ℃冰箱中备用。所有中药均由本院药剂科采购，批号：29302-11。
1.1.3 试剂与仪器 PI3K一抗抗体（CST公司，美国，货号：4249T），AKT一抗抗体（CST公司，美国，货号：46855），p-AKT一抗抗体（CST公司，美国，货号：40605），Bcl-2一抗抗体（CST公司，美国，货号：15071T），Bax一抗抗体（CST公司，美国，货号：14796S）。Morris水迷宫（江苏赛昂斯公司，型号：SA201），Model68酶标仪（Bio-Rad Laboratories，美国，型号：680），全自动煎药机（济南玖延机械厂，型号：JY-C2+1）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将所有大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只。将所有SD大鼠进行适应性喂养7 d，将模型组和中药组投喂高脂饲料（10%猪油+10%的蔗糖+10%胆固醇+1%胆盐和69%普通饲料配制成的高脂饲料），3次/d，同时注射70万U的维生素D3，隔1 d注射1次，共注射4次。
1.2.2 给药方法 空白组大鼠投喂普通饲料。3组均连续投喂8周。随后中药组用2 g/mL血府逐瘀汤药液灌胃，空白组及模型组用等量的0.9%氯化钠注射液灌胃，3组均连续灌胃10 d。灌胃结束后处死所有大鼠。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 各组心电图检测 使用水合氯醛（0.1 mL/kg）进行腹腔注射麻醉，待大鼠充分麻醉后连接BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），对各组大鼠造模前后的心电图进行记录，记录时间持续30 min，记录标准Ⅱ导联心电图，以J点（QRS波群的终点与ST段交接处）的位移情况判断心肌是否存在缺血征象，J点上升或下降0.1 mV视为心肌存在缺血。
1.2.3.2 各组血脂、Bax及Bcl-2水平的变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，抽取腹主动脉血后4 ℃ 5 000 r/min条件下离心10 min（离心半径10 cm），抽吸上清液利用酶联免疫吸附试验法（ELISA）对总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、Bax、Bcl-2水平进行测定，具体操作过程严格按照ELISA试剂盒上的说明书进行。
1.2.3.3 Tunel检测心肌细胞凋亡情况 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛溶液从左心室注入，随后将
大鼠心脏取出，对心肌组织进行剪切、修剪成5 mm×5 mm大小的组织块，再进行脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等过程，严格按照Tunel试剂盒中的操作过程，利用激光共聚焦对心肌细胞的凋亡情况进行检测。其中所有细胞核显示为蓝色荧光，凋亡细胞显示绿色荧光，每个组织片随机选取5个视野。细胞凋亡率=（绿色荧光的凋亡细胞数/Tunel染色的总细胞数）×100%。
1.2.3.4 HE染色观察主动脉的病理变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛溶液从左心室注入，随后将大鼠主动脉取出，剪裁主动脉长度约1 cm，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等过程，严格按照HE染色试剂盒对主动脉进行HE染色，并在光镜下观察主动脉的病理变化。
1.2.3.5 蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测各组心肌组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，处死后冰上快速取出心脏，加入裂解液充分反应30 min，随后将标本置于4 ℃ 5 000 r/min条件下离心10 min（离心半径10 cm），取出上清液后利用DBA试剂盒测定总蛋白含量，将样本加入至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中进行蛋白分离，将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，进行脱脂牛奶封闭，加入相应的一抗孵育，将PVDF用PBS清洗后再加入HRP-二抗，置于室温，经60 min后取出再用PBS洗涤3次。最后进行曝光、显影、定影、拍照和统计分析。 1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，多组计量资料采用LSD法单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血脂、Bax及Bcl-2水平变化 经过冠心病模型制备的大鼠均出现血脂代谢紊乱，TC、TG、LDL-C、Bax明显升高，HDL-C、Bcl-2明显下降，与空白组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;中药干预后，大鼠血脂水平明显改善，与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表1、图1。
2.2 各组心电图检测结果比较 心電图显示，经过冠心病模型制备大鼠心电图ST段变化超过0.1 mV，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），其中中药组较模型组改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 各组Tunel检测结果比较 Tunel检测显示，经过冠心病模型制备大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），其中，中药组心肌细胞凋亡率较模型组下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2.4 各组主动脉HE染色结果比较 HE染色显示，空白组大鼠冠状动脉管壁结构厚薄均匀，中内膜形状规则，结构完整;模型组内中膜明显增厚，动脉管壁明显凹凸不平，管腔狭窄，出现明显斑块;中药组管壁较模型组平滑，斑块较模型组减小。见图2。
2.4 各组大鼠PI3K、p-AKT水平比较 冠心病模型制备的大鼠PI3K、p-AKT水平明显下降，与空白组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;经过中药干预后，大鼠PI3K、p-AKT表达明显改善，与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。各组AKT表达水平相近，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3、表4。
3 讨论
心血管事件在我国发生率居高不下，冠心病病理上主要是粥样斑块形成，导致冠脉管腔狭窄，心肌供血减少，因此纠正冠脉异常增厚，抑制斑块形成是治疗冠心病的关键[6-7]。中医并无“冠心病”这一病名的记载，根据其临床征象将其归属于“胸痹”“血瘀”“痹证”等范畴，病位在心，《黄帝内经》云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓。”由此可见，气血瘀滞、心脉不通是该病的主要病因病机，则行气活血、化瘀止痛是治则。血府逐瘀汤是胸中血瘀证的代表经方，方中活血药与行气药相结合，桃仁、红花、赤芍可活血化瘀，川芎血中之气药，活血同时可行气，桔梗、枳壳可行气止痛，与川芎合用加强行气活血之功效，当归、生地黄可活血凉血，柴胡、牛膝引血下行，升降并用。诸药合而用之，使得瘀化气行，共奏行气活血、化瘀止痛之功[8-11]。我们对各组大鼠进行心电图检测，结果显示，经过冠心病模型制备大鼠心电图ST段变化超过0.1 mV，经过血府逐瘀汤干预后，大鼠心肌缺血征象明显改善。与此同时我们利用HE染色显示空白组大鼠冠状动脉管壁结构厚薄均匀，中内膜形状规则，结构完整;模型组内中膜明显增厚，动脉管壁明显凹凸不平，管腔狭窄，出现明显斑块;中药组管壁较模型组平滑，斑块较模型组减小。在佐证本研究造模成功的同时进一步佐证了血府逐瘀汤可明显改善冠状动脉病理结构，增加心肌供血。活血化瘀汤中的化“瘀”涵盖的意义较为广泛，包括血瘀、代谢产物积聚等。尤其对于代谢产物及各种毒性物质如血脂等形成的淤积，活血化瘀汤通过对这些物质的清除，达到缩小斑块，改善冠状动脉结构的效果。
既往认为心肌缺血导致细胞坏死是心肌细胞死亡的主要形式，但随着研究的不断深入，越来越多的证据显示细胞凋亡参与了心肌缺血的病理变化过程[12-13]。心肌细胞的缺血缺氧导致了细胞凋亡效应增强，而心肌异常凋亡是导致心肌收缩力异常及心室重构、心力衰竭的重要原因。此外，心肌细胞属于可执行特定功能的终末分化成熟细胞，再分裂潜能极其微弱，故心肌坏死导致的细胞减少或丢失对心功能具有致命的影响，而细胞凋亡在一定程度属于部分可逆，因此抗凋亡是治疗心肌缺血，改善冠心病远期预后的重要靶向。PI3K/AKT信号通路是经典抗凋亡通路，PI3K激活后介导第二信使PIP3的生成，PIP3进一步结合下游的AKT使其核移位，促进AKT的磷酸化而影响其构象的改变，启动细胞凋亡程序[14-15]。Bcl-2与Bax亦是与凋亡密切相关的因子，二者之间有45%的同源性，作用相反，当Bcl-2与Bax形成异二聚体复合物后有相互抑制作用。有研究人员证实正常生理状态下Bax以单体的形式存在于细胞核内，在受到凋亡信号的刺激后其构象发生变化，寡聚在线粒体膜上，诱发细胞色素C自线粒体的释放，诱导细胞的凋亡[16-20]。本研究结果显示经过冠心病模型制备的大鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平明显下降，Bax水平上调，经过中药干预后，大鼠上述指标表达明显改善。为了进一步验证，本研究对各组大鼠心肌组织进行Tunnel染色，结果显示经过冠心病模型制备大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，其中中药组心肌细胞凋亡率较模型组下降，这说明血府逐瘀汤对冠心病模型心肌细胞凋亡发挥抑制效应。
总之，血府逐瘀汤可明显逆转冠心病病理组织改变，其作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡有关，而该过程可能是通过PI3K/AKT信号通路介导的。
参考文献
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（2019-09-30收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（31874851）
作者简介：赵旻（1981.09—），男，研究生，主治医师，研究方向：中医基础理论与临床的关系，E-mail：[email protected]
关键词 冠心病模型;血府逐瘀汤;血脂;心肌细胞;凋亡;PI3K-AKT信号通路;冠状动脉管壁结构;血脂代谢
Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on Cardiomyocyte Apoptosis and Expression of Related Proteins in Rats with Coronary Heart Disease
ZHAO Yi，ZHANG Yuan，GANG Lili
（Beijing Changping Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Beijing 102208，China）
Abstract Objective：To observe the therapeutic effect of Xuefu Zhuyu Decoction on coronary heart disease（CHD）model rats and explore its effect on PI3K-AKT signaling pathway related proteins.Methods：A total of 45 SD rats were randomly divided into a blank group，a model group and a traditional Chinese medicine（TCM）group，with 15 rats in each group.CHD model was set up for the rats in the model group and the TCM group.The rats in TCM group were given 2 g/mL Xuefu Zhuyu Decoction by gavage.The rats in the blank group and the model group were given the same amount of normal saline by gavage.All the 3 groups were given gavage continuously for 10 days.The changes of ST segment，cardiomyocyte apoptosis，morphology of common carotid artery，blood lipid level，protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in myocardial tissue，and the levels of Bax and Bcl-2 in abdominal aorta were observed before and after modeling.Results：1）ECG showed that the ST segment change of rats after CHD model preparation was higher than that of the blank group（P<0.05），and the TCM group was better than that of the model group（P<0.05）; 2）the blood lipid metabolism of rats after CHD model preparation was disordered，with a significant increase in TC，TG，LDL-C，Bax and a significant decrease in HDL-C，bcl-2; compared with the blank group，the differences were statistically significant（P<0.05）.After the intervention of TCM，the blood lipid level of rats was higher than that of the model group（P<0.05）; 3）TUNEL detection showed that the apoptosis rate of cardiomyocytes in the model group was higher than that of the blank group（P<0.05），and the apoptosis rate of cardiomyocytes in the TCM group was lower than that of the model group（P<0.05）; 4）HE staining showed that the thickness of the coronary artery wall in the blank group was uniform，the shape of the intima was regular，and the structure was complete; the intima-media in the model group was significantly thickened，the arterial wall was significantly uneven，the lumen was narrow，and obvious plaque appeared; the wall of the TCM group was smoother than that of the model group，and the plaque was smaller than the model group; 5）the levels of PI3K，p-AKT and Bcl-2 in the CHD model rats were lower than those in the blank group.The concentration of Bax in the control group was higher than that in the blank group（P<0.05），and the improvement effect of the above indexes in the TCM group was better than that in the model group（P<0.05）.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoction can significantly reverse the pathological changes of coronary heart disease，and its mechanism may be related to the inhibition of cardiomyocyte apoptosis. Keywords Coronary heart disease model; Xuefu Zhuyu Decoction; Blood lipid; Cardiomyocyte; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Coronary artery wall structure; Blood lipid metabolism
中图分类号：R289.4;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.011
心血管疾病已然成为危害我国居民生命安全的主要疾病之一，其中冠心病占据主导位置，是心血管疾病第一死因[1]。历代医贤并无“冠心病”这一病名的记载，根据其临床征象将其归属于“胸痹”“血瘀”“痹证”等范畴，病位在心，《黄帝内经》云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓。”由此可见气血瘀滞、心脉不通是该病的主要病因病机，则行气活血、化瘀止痛是治则。血府逐瘀汤是经典的理血剂，首载于《医林改错》，现代临床不乏其有效治疗高脂血症、冠心病、脑血栓形成、高血压的记载[2-5]，但其作用机制目前尚无统一定论，基于此，本研究探讨血府逐瘀汤有效治疗冠心病的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取45只无特定病原体（Speciifc Pathogen Free，SPF）级SD雄性大鼠，所有大鼠均购自济南金丰实验动物有限公司，（许可证号：SCXK（鲁）2014 0006）。大鼠体质量190～230 g，平均体质量（225±5）g，鼠龄5～6个月，平均鼠龄（5.2±0.5）个月。所有大鼠均饲养于室温（23±0.5）℃、湿度（51±3）%环境中，自由摄食，12 h/12 h交替光照。3组大鼠在体质量、鼠龄、饲养环境等条件一致。
1.1.2 药物 制备血府逐瘀汤药液：桃仁12 g，红花、当归、生地黄、牛膝各9 g，川芎、桔梗各4.5 g，赤芍、枳壳、甘草各6 g，柴胡3 g。整方藥材置于全自动煎药机中浸泡30 min，水煎煮后滤出药液，再次加水煎煮后滤出药液，将2次药液混匀后浓缩为0.88 g/mL的药液，置于-20 ℃冰箱中备用。所有中药均由本院药剂科采购，批号：29302-11。
1.1.3 试剂与仪器 PI3K一抗抗体（CST公司，美国，货号：4249T），AKT一抗抗体（CST公司，美国，货号：46855），p-AKT一抗抗体（CST公司，美国，货号：40605），Bcl-2一抗抗体（CST公司，美国，货号：15071T），Bax一抗抗体（CST公司，美国，货号：14796S）。Morris水迷宫（江苏赛昂斯公司，型号：SA201），Model68酶标仪（Bio-Rad Laboratories，美国，型号：680），全自动煎药机（济南玖延机械厂，型号：JY-C2+1）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将所有大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组15只。将所有SD大鼠进行适应性喂养7 d，将模型组和中药组投喂高脂饲料（10%猪油+10%的蔗糖+10%胆固醇+1%胆盐和69%普通饲料配制成的高脂饲料），3次/d，同时注射70万U的维生素D3，隔1 d注射1次，共注射4次。
1.2.2 给药方法 空白组大鼠投喂普通饲料。3组均连续投喂8周。随后中药组用2 g/mL血府逐瘀汤药液灌胃，空白组及模型组用等量的0.9%氯化钠注射液灌胃，3组均连续灌胃10 d。灌胃结束后处死所有大鼠。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 各组心电图检测 使用水合氯醛（0.1 mL/kg）进行腹腔注射麻醉，待大鼠充分麻醉后连接BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），对各组大鼠造模前后的心电图进行记录，记录时间持续30 min，记录标准Ⅱ导联心电图，以J点（QRS波群的终点与ST段交接处）的位移情况判断心肌是否存在缺血征象，J点上升或下降0.1 mV视为心肌存在缺血。
1.2.3.2 各组血脂、Bax及Bcl-2水平的变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，抽取腹主动脉血后4 ℃ 5 000 r/min条件下离心10 min（离心半径10 cm），抽吸上清液利用酶联免疫吸附试验法（ELISA）对总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、Bax、Bcl-2水平进行测定，具体操作过程严格按照ELISA试剂盒上的说明书进行。
1.2.3.3 Tunel检测心肌细胞凋亡情况 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛溶液从左心室注入，随后将
大鼠心脏取出，对心肌组织进行剪切、修剪成5 mm×5 mm大小的组织块，再进行脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等过程，严格按照Tunel试剂盒中的操作过程，利用激光共聚焦对心肌细胞的凋亡情况进行检测。其中所有细胞核显示为蓝色荧光，凋亡细胞显示绿色荧光，每个组织片随机选取5个视野。细胞凋亡率=（绿色荧光的凋亡细胞数/Tunel染色的总细胞数）×100%。
1.2.3.4 HE染色观察主动脉的病理变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛溶液从左心室注入，随后将大鼠主动脉取出，剪裁主动脉长度约1 cm，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等过程，严格按照HE染色试剂盒对主动脉进行HE染色，并在光镜下观察主动脉的病理变化。
1.2.3.5 蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测各组心肌组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平变化 接受干预后，在完成心电图检测后随机选取各组3只大鼠，处死后冰上快速取出心脏，加入裂解液充分反应30 min，随后将标本置于4 ℃ 5 000 r/min条件下离心10 min（离心半径10 cm），取出上清液后利用DBA试剂盒测定总蛋白含量，将样本加入至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中进行蛋白分离，将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，进行脱脂牛奶封闭，加入相应的一抗孵育，将PVDF用PBS清洗后再加入HRP-二抗，置于室温，经60 min后取出再用PBS洗涤3次。最后进行曝光、显影、定影、拍照和统计分析。 1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，多组计量资料采用LSD法单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组血脂、Bax及Bcl-2水平变化 经过冠心病模型制备的大鼠均出现血脂代谢紊乱，TC、TG、LDL-C、Bax明显升高，HDL-C、Bcl-2明显下降，与空白组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;中药干预后，大鼠血脂水平明显改善，与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表1、图1。
2.2 各组心电图检测结果比较 心電图显示，经过冠心病模型制备大鼠心电图ST段变化超过0.1 mV，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），其中中药组较模型组改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 各组Tunel检测结果比较 Tunel检测显示，经过冠心病模型制备大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05），其中，中药组心肌细胞凋亡率较模型组下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2.4 各组主动脉HE染色结果比较 HE染色显示，空白组大鼠冠状动脉管壁结构厚薄均匀，中内膜形状规则，结构完整;模型组内中膜明显增厚，动脉管壁明显凹凸不平，管腔狭窄，出现明显斑块;中药组管壁较模型组平滑，斑块较模型组减小。见图2。
2.4 各组大鼠PI3K、p-AKT水平比较 冠心病模型制备的大鼠PI3K、p-AKT水平明显下降，与空白组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;经过中药干预后，大鼠PI3K、p-AKT表达明显改善，与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。各组AKT表达水平相近，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3、表4。
3 讨论
心血管事件在我国发生率居高不下，冠心病病理上主要是粥样斑块形成，导致冠脉管腔狭窄，心肌供血减少，因此纠正冠脉异常增厚，抑制斑块形成是治疗冠心病的关键[6-7]。中医并无“冠心病”这一病名的记载，根据其临床征象将其归属于“胸痹”“血瘀”“痹证”等范畴，病位在心，《黄帝内经》云：“心痹者，脉不通，烦则心下鼓。”由此可见，气血瘀滞、心脉不通是该病的主要病因病机，则行气活血、化瘀止痛是治则。血府逐瘀汤是胸中血瘀证的代表经方，方中活血药与行气药相结合，桃仁、红花、赤芍可活血化瘀，川芎血中之气药，活血同时可行气，桔梗、枳壳可行气止痛，与川芎合用加强行气活血之功效，当归、生地黄可活血凉血，柴胡、牛膝引血下行，升降并用。诸药合而用之，使得瘀化气行，共奏行气活血、化瘀止痛之功[8-11]。我们对各组大鼠进行心电图检测，结果显示，经过冠心病模型制备大鼠心电图ST段变化超过0.1 mV，经过血府逐瘀汤干预后，大鼠心肌缺血征象明显改善。与此同时我们利用HE染色显示空白组大鼠冠状动脉管壁结构厚薄均匀，中内膜形状规则，结构完整;模型组内中膜明显增厚，动脉管壁明显凹凸不平，管腔狭窄，出现明显斑块;中药组管壁较模型组平滑，斑块较模型组减小。在佐证本研究造模成功的同时进一步佐证了血府逐瘀汤可明显改善冠状动脉病理结构，增加心肌供血。活血化瘀汤中的化“瘀”涵盖的意义较为广泛，包括血瘀、代谢产物积聚等。尤其对于代谢产物及各种毒性物质如血脂等形成的淤积，活血化瘀汤通过对这些物质的清除，达到缩小斑块，改善冠状动脉结构的效果。
既往认为心肌缺血导致细胞坏死是心肌细胞死亡的主要形式，但随着研究的不断深入，越来越多的证据显示细胞凋亡参与了心肌缺血的病理变化过程[12-13]。心肌细胞的缺血缺氧导致了细胞凋亡效应增强，而心肌异常凋亡是导致心肌收缩力异常及心室重构、心力衰竭的重要原因。此外，心肌细胞属于可执行特定功能的终末分化成熟细胞，再分裂潜能极其微弱，故心肌坏死导致的细胞减少或丢失对心功能具有致命的影响，而细胞凋亡在一定程度属于部分可逆，因此抗凋亡是治疗心肌缺血，改善冠心病远期预后的重要靶向。PI3K/AKT信号通路是经典抗凋亡通路，PI3K激活后介导第二信使PIP3的生成，PIP3进一步结合下游的AKT使其核移位，促进AKT的磷酸化而影响其构象的改变，启动细胞凋亡程序[14-15]。Bcl-2与Bax亦是与凋亡密切相关的因子，二者之间有45%的同源性，作用相反，当Bcl-2与Bax形成异二聚体复合物后有相互抑制作用。有研究人员证实正常生理状态下Bax以单体的形式存在于细胞核内，在受到凋亡信号的刺激后其构象发生变化，寡聚在线粒体膜上，诱发细胞色素C自线粒体的释放，诱导细胞的凋亡[16-20]。本研究结果显示经过冠心病模型制备的大鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平明显下降，Bax水平上调，经过中药干预后，大鼠上述指标表达明显改善。为了进一步验证，本研究对各组大鼠心肌组织进行Tunnel染色，结果显示经过冠心病模型制备大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，其中中药组心肌细胞凋亡率较模型组下降，这说明血府逐瘀汤对冠心病模型心肌细胞凋亡发挥抑制效应。
总之，血府逐瘀汤可明显逆转冠心病病理组织改变，其作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡有关，而该过程可能是通过PI3K/AKT信号通路介导的。
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（2019-09-30收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（31874851）
作者简介：赵旻（1981.09—），男，研究生，主治医师，研究方向：中医基础理论与临床的关系，E-mail：[email protected]