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摘要：目的：研究分析银杏叶提取物对缺血再灌注肺损伤内血红素氧合酶的影响。方法：选择实验动物中心提供的60只健康小鼠，随机性平均分成四组，分别为对照组、I/R组、GBE组、ZnPP-IX组。结果：各组间H0-1活性相比，P<0.05有统计学意义。GBE组MDA水平明显低于I/R组、ZnPP-IX组，差异P<0.05有统计学意义。结论：银杏叶提取物能够诱导血红素氧合酶的表达，对I/R肺损伤具有良好的保护作用。
关键词：银杏叶提取物；缺血再灌注肺损伤；血红素氧合酶；影响
肺移植后一般会出现缺血再灌注（即为I/R）损伤，以至于肺损伤造成移植后早期肺功能障碍、受体死亡。研究发现[1]，血红素氧合酶1（简称HO-1）的高水平浓度是细胞拮抗氧化应激损伤的一项关键的内源性保护因子。银杏叶提取物（简称GBE）能够对细胞中的HO-1的表达进行诱导，促进HO-1的合成及分泌。现针对肺 II 型细胞 I/R损伤试验小鼠进行深入研究，观察GBE对细胞内HO-1的表达是否有所影响及对I/R肺损伤是否存在保护作用，研究如下。
1材料与方法
1.1材料
银杏特提取物（悦康药业集团有限公司，规格为5.0 ml：17.5 mg）。罗氏公司提供的COBAS 全自动生化分析仪，型号为INT EGRA400。H0-1免疫组化SABC试剂盒，由武汉博士德公司提供。其他试剂主要是分析纯。选择实验动物中心提供的60只小鼠，体重为18-23 g，平均（20.54±1.48）g。
1.2方法
1.2.1 A549细胞培养
A549细胞即为肺 II 型细胞株，对A549细胞进行复苏，然后在DMEM 培养基上完成接种，其中含有100 lug/ml的链霉素、100 U/ml的青霉素、10%浓度的胎牛血清。放置在37摄氏度、二氧化碳体积分数为5.0%、饱和湿度环境下进行培养，等到细胞贴壁后在第二天更换液体。当细胞铺满瓶底后[2]，应用PBS 进行冲洗，用0.25%浓度的胰蛋白酶进行消化，离心时收集细胞以便传代。
1.2.2制备肺 II 型细胞 I/R 模型
将A549细胞加入到甲右旋糖酐溶液（简称LPDG）内，放置在40 C、100% O2的封闭箱内培养12小时，模拟肺缺血。再更换成含有10%浓度的胎牛血清的DMEM，放置在37摄氏度、二氧化碳浓度为5.0%的培养箱内培养2小时，然后模拟再灌注[3]。
1.3实验分组
I/R组：A549细胞模拟缺血16小时，再灌注2小时。GBE组：应用GBE预处理24小时候，缺血12小时，再灌注2小时。ZnPP-IX组：应用GBE、Znpp-IX预处理24小时，缺血12小时，再灌注2小时。对照组：A549细胞进行常规培养。
1.4细胞损伤指标检查
1.4.1检查细胞存活率
在培养瓶中应用胰蛋白酶对肺 II 型细胞进行消化，溶入0.5%浓度的台盼兰，3分钟后，认真计算蓝染、没有蓝染的细胞计数，得出细胞存活率。
1.4.2检查线粒体呼吸能力（英简MR）
检查前，先把每组培养液更换成含有5.0%浓度的胎牛血清DMEM，再加入 hanK 液对四氮甲基唑蓝（简称MTT）进行溶解，最终浓度为0.5 mg/ml，放在37摄氏度环境中孵育1小时。认真吸弃培养液，滴入100 ul的二甲基亚砜（简称DMSO），轻慢摇动混匀培养液，应用450 nm的波长检查其吸光度。对照组吸光度100%作为标准，计算其余三组吸光度的百分比情况，以此表示细胞线粒体呼吸的能力。
1.4.3细胞上清液 MDA水平
在低温状态下離心培养液，每分钟1000 r，离心5分钟，吸取上清液，MDA 水平应用硫代巴比妥酸比色法进行检测[4]。
1.4.4凋亡的检查
收集2.0×106个肺 II 型细胞，进行离心沉淀，应用3.0%浓度的戊二醛进行固定，然后通过电镜检测。同时，收集1.0×106个细胞，应用PBS冲洗两次，通过碘化丙啶（简称P1）与FITC-Annexin V双染色后，使用流式细胞术凋亡率。
1.4.5 H0-1活性检查
细胞经5体积冷 TRis/Hcl 缓冲液进行离心，离心处理2次，分别是3.5 kg，20分钟；0.8 kg，10分钟，使线粒体沉淀。对上清液进行再次离心（105kg，90分钟），致使微粒体分离。应用100 mmol/L浓度、PH值7.4 的焦磷酸钠将血红蛋白除去，将磷酸钾缓冲液制备成微粒体悬液。
1.5统计学分析
通过SPSS 17.0 统计学软件对数据进行对比分析，对于计量资料，应用方差±表示，并使用配对样本t进行检验；对于计数资料，则用百分比（%）表示，然后利用X2进行检验。当P值小于0.5时，说明试验结果有统计学意义。
2结果
各组间H0-1活性相比，P<0.05有统计学意义。GBE组MDA水平明显低于I/R组、ZnPP-IX组，差异P<0.05有统计学意义。详见表1.
3讨论
肺部因为存在独特性易损的组织结构，对缺血引起的损害具有较高的敏感性，肺移植后一般会出现缺血再灌注（即为I/R）损伤，造成移植后早期肺功能障碍、受体死亡[6]。本次试验通过模拟肺 II 型细胞I/R 损伤，在细胞、分子水平方面论证银杏叶提取物（即为GBE）具有较强的抗 I/R 肺损伤功能，进一步了解银杏叶提取物的作用途径及对血红素氧合酶含量的影响，进而为寻找新的抗肺移植 I/R 损伤及肺保护药物提供科学的实验依据。
以往关于银杏叶提取物的大量文献表明，银杏叶提取物存在松弛支气管、消解平滑肌痉挛、促进循环、拮抗血小板活化因子（英简PAF）、清除氧自由基等作用[7]。银杏叶提取物是治疗脑、肾、肺 I/R 损伤的一种天然中药[8]，具有极大的研发潜质。银杏叶提取物的主要作用机制在于充分发挥抗氧化应激、清除氧自由基的作用，并且已经有研究证实银杏叶提取物能够降低心脑器官的I/R 损伤。本次研究通过对健康小鼠模拟肺 I/R 损伤与常规培养、GBE预处理、GBE、Znpp-IX预处理三组小鼠进行对比试验，提示增强HO-1的活性，对肺 I/R 损伤起到了良好的保护作用，可延长肺 I/R 小鼠的存活率。银杏叶提取物可以有效诱导血红素氧合酶的表达，并且血红素氧合酶是已知存活在细胞微粒体内的一种关键性能够被诱导的抗氧化酶，同时也是细胞拮抗氧化应激性损伤的一种标志性内源保护因子。通过上述试验及结论可以推断，银杏叶提取物能够诱导血红素氧合酶的表达，对 I/R 肺损伤具有良好的保护作用。
参考文献：
[1]夏安周，邢淑华.银杏叶提取物对缺血再灌注损伤的保护作用研究进展[J].徐州医学院学报，2012，23（4）：369-370.
[2]王雁，杨义芳.银杏叶的药理作用及其机制的研究进展[J].中国现代应用药学杂志，2011，18（1）：1-3.
[3]周兰兰，明亮，左从文，等.银杏叶提取物改善反复脑缺血再灌注小鼠血液流变学的作用[J].中国现代应用药学杂志，2012，17（2）：91-93.
[4]李玲，郭泽云，，吴春云，等.银杏叶提取物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J].中国新药与临床杂志，2011，20（3）：171-172.
[5]郭潇.银杏达莫对兔心肌缺血再灌注诱导内皮细胞损伤的影响及机制[J].时珍国医国药，2012，19（5）：F003-F004.
[6]Akgui T ， Karaguzel E， Surer H ， et al .Ginkgo biloba （ EGB761）affects apoptosis and nitric-oxide synthases in tes-ticular torsion： an experimental study [J] . Int Urol Nephrol，2009，41（3）：531-536.
[7]Mechirova E ， Domorakova I， Dankova M ， et al . Effect of no-radrenalin and EGb 761 pretreatment on the ischemia-reperfu-sion injured spinal cord neurons in rabbits[ J] . Cell Mol Neuro-biol， 2009， 29（ 6-7） ： 991 -998.
[8]谢守霞，张万帆，贾孟良，等.基因芯片分析银杏叶提取物对小鼠肾缺血-再灌注损伤的保护作用机制[J].中国医院药学杂志，2011，26（12）：1455-1459.
关键词：银杏叶提取物；缺血再灌注肺损伤；血红素氧合酶；影响
肺移植后一般会出现缺血再灌注（即为I/R）损伤，以至于肺损伤造成移植后早期肺功能障碍、受体死亡。研究发现[1]，血红素氧合酶1（简称HO-1）的高水平浓度是细胞拮抗氧化应激损伤的一项关键的内源性保护因子。银杏叶提取物（简称GBE）能够对细胞中的HO-1的表达进行诱导，促进HO-1的合成及分泌。现针对肺 II 型细胞 I/R损伤试验小鼠进行深入研究，观察GBE对细胞内HO-1的表达是否有所影响及对I/R肺损伤是否存在保护作用，研究如下。
1材料与方法
1.1材料
银杏特提取物（悦康药业集团有限公司，规格为5.0 ml：17.5 mg）。罗氏公司提供的COBAS 全自动生化分析仪，型号为INT EGRA400。H0-1免疫组化SABC试剂盒，由武汉博士德公司提供。其他试剂主要是分析纯。选择实验动物中心提供的60只小鼠，体重为18-23 g，平均（20.54±1.48）g。
1.2方法
1.2.1 A549细胞培养
A549细胞即为肺 II 型细胞株，对A549细胞进行复苏，然后在DMEM 培养基上完成接种，其中含有100 lug/ml的链霉素、100 U/ml的青霉素、10%浓度的胎牛血清。放置在37摄氏度、二氧化碳体积分数为5.0%、饱和湿度环境下进行培养，等到细胞贴壁后在第二天更换液体。当细胞铺满瓶底后[2]，应用PBS 进行冲洗，用0.25%浓度的胰蛋白酶进行消化，离心时收集细胞以便传代。
1.2.2制备肺 II 型细胞 I/R 模型
将A549细胞加入到甲右旋糖酐溶液（简称LPDG）内，放置在40 C、100% O2的封闭箱内培养12小时，模拟肺缺血。再更换成含有10%浓度的胎牛血清的DMEM，放置在37摄氏度、二氧化碳浓度为5.0%的培养箱内培养2小时，然后模拟再灌注[3]。
1.3实验分组
I/R组：A549细胞模拟缺血16小时，再灌注2小时。GBE组：应用GBE预处理24小时候，缺血12小时，再灌注2小时。ZnPP-IX组：应用GBE、Znpp-IX预处理24小时，缺血12小时，再灌注2小时。对照组：A549细胞进行常规培养。
1.4细胞损伤指标检查
1.4.1检查细胞存活率
在培养瓶中应用胰蛋白酶对肺 II 型细胞进行消化，溶入0.5%浓度的台盼兰，3分钟后，认真计算蓝染、没有蓝染的细胞计数，得出细胞存活率。
1.4.2检查线粒体呼吸能力（英简MR）
检查前，先把每组培养液更换成含有5.0%浓度的胎牛血清DMEM，再加入 hanK 液对四氮甲基唑蓝（简称MTT）进行溶解，最终浓度为0.5 mg/ml，放在37摄氏度环境中孵育1小时。认真吸弃培养液，滴入100 ul的二甲基亚砜（简称DMSO），轻慢摇动混匀培养液，应用450 nm的波长检查其吸光度。对照组吸光度100%作为标准，计算其余三组吸光度的百分比情况，以此表示细胞线粒体呼吸的能力。
1.4.3细胞上清液 MDA水平
在低温状态下離心培养液，每分钟1000 r，离心5分钟，吸取上清液，MDA 水平应用硫代巴比妥酸比色法进行检测[4]。
1.4.4凋亡的检查
收集2.0×106个肺 II 型细胞，进行离心沉淀，应用3.0%浓度的戊二醛进行固定，然后通过电镜检测。同时，收集1.0×106个细胞，应用PBS冲洗两次，通过碘化丙啶（简称P1）与FITC-Annexin V双染色后，使用流式细胞术凋亡率。
1.4.5 H0-1活性检查
细胞经5体积冷 TRis/Hcl 缓冲液进行离心，离心处理2次，分别是3.5 kg，20分钟；0.8 kg，10分钟，使线粒体沉淀。对上清液进行再次离心（105kg，90分钟），致使微粒体分离。应用100 mmol/L浓度、PH值7.4 的焦磷酸钠将血红蛋白除去，将磷酸钾缓冲液制备成微粒体悬液。
1.5统计学分析
通过SPSS 17.0 统计学软件对数据进行对比分析，对于计量资料，应用方差±表示，并使用配对样本t进行检验；对于计数资料，则用百分比（%）表示，然后利用X2进行检验。当P值小于0.5时，说明试验结果有统计学意义。
2结果
各组间H0-1活性相比，P<0.05有统计学意义。GBE组MDA水平明显低于I/R组、ZnPP-IX组，差异P<0.05有统计学意义。详见表1.
3讨论
肺部因为存在独特性易损的组织结构，对缺血引起的损害具有较高的敏感性，肺移植后一般会出现缺血再灌注（即为I/R）损伤，造成移植后早期肺功能障碍、受体死亡[6]。本次试验通过模拟肺 II 型细胞I/R 损伤，在细胞、分子水平方面论证银杏叶提取物（即为GBE）具有较强的抗 I/R 肺损伤功能，进一步了解银杏叶提取物的作用途径及对血红素氧合酶含量的影响，进而为寻找新的抗肺移植 I/R 损伤及肺保护药物提供科学的实验依据。
以往关于银杏叶提取物的大量文献表明，银杏叶提取物存在松弛支气管、消解平滑肌痉挛、促进循环、拮抗血小板活化因子（英简PAF）、清除氧自由基等作用[7]。银杏叶提取物是治疗脑、肾、肺 I/R 损伤的一种天然中药[8]，具有极大的研发潜质。银杏叶提取物的主要作用机制在于充分发挥抗氧化应激、清除氧自由基的作用，并且已经有研究证实银杏叶提取物能够降低心脑器官的I/R 损伤。本次研究通过对健康小鼠模拟肺 I/R 损伤与常规培养、GBE预处理、GBE、Znpp-IX预处理三组小鼠进行对比试验，提示增强HO-1的活性，对肺 I/R 损伤起到了良好的保护作用，可延长肺 I/R 小鼠的存活率。银杏叶提取物可以有效诱导血红素氧合酶的表达，并且血红素氧合酶是已知存活在细胞微粒体内的一种关键性能够被诱导的抗氧化酶，同时也是细胞拮抗氧化应激性损伤的一种标志性内源保护因子。通过上述试验及结论可以推断，银杏叶提取物能够诱导血红素氧合酶的表达，对 I/R 肺损伤具有良好的保护作用。
参考文献：
[1]夏安周，邢淑华.银杏叶提取物对缺血再灌注损伤的保护作用研究进展[J].徐州医学院学报，2012，23（4）：369-370.
[2]王雁，杨义芳.银杏叶的药理作用及其机制的研究进展[J].中国现代应用药学杂志，2011，18（1）：1-3.
[3]周兰兰，明亮，左从文，等.银杏叶提取物改善反复脑缺血再灌注小鼠血液流变学的作用[J].中国现代应用药学杂志，2012，17（2）：91-93.
[4]李玲，郭泽云，，吴春云，等.银杏叶提取物对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J].中国新药与临床杂志，2011，20（3）：171-172.
[5]郭潇.银杏达莫对兔心肌缺血再灌注诱导内皮细胞损伤的影响及机制[J].时珍国医国药，2012，19（5）：F003-F004.
[6]Akgui T ， Karaguzel E， Surer H ， et al .Ginkgo biloba （ EGB761）affects apoptosis and nitric-oxide synthases in tes-ticular torsion： an experimental study [J] . Int Urol Nephrol，2009，41（3）：531-536.
[7]Mechirova E ， Domorakova I， Dankova M ， et al . Effect of no-radrenalin and EGb 761 pretreatment on the ischemia-reperfu-sion injured spinal cord neurons in rabbits[ J] . Cell Mol Neuro-biol， 2009， 29（ 6-7） ： 991 -998.
[8]谢守霞，张万帆，贾孟良，等.基因芯片分析银杏叶提取物对小鼠肾缺血-再灌注损伤的保护作用机制[J].中国医院药学杂志，2011，26（12）：1455-1459.