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【摘要】 目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）、Kruppel样因子（KLF4）在不同临床分期肺癌组织中的表达变化。方法：选取本院肿瘤内科肺癌患者63例，手术收集肺癌组织标本63例作为研究组，癌旁正常肺组织（肺癌边缘外>5 cm）标本60例作为对照组，采用免疫组化方法检测EGFR、KLF4表达，比较组间及不同临床分期EGFR、KLF4阳性率的差异。结果：研究组EGFR阳性率明显高于对照组，KLF4阳性率明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。Ⅲ～Ⅳ期EGFR阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织，Ⅲ～Ⅳ期KLF4阳性率明显低于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：EGFR在肺癌组织中阳性表达率显著增高，而KLF4在肺癌组织中的阳性表达率显著降低，其中肺癌组织临床分期越高，EGFR阳性率越高，KLF4阳性率越低。
【关键词】 表皮生长因子受体； Kruppel样因子； 临床分期； 肺癌
目前，随着经济社会的发展，环境污染加重和吸烟等多种影响因素均导致肺癌发生率和死亡率逐渐增加[1]。目前关于肺癌的病理发生机制尚未完全明确，其中与肺癌紧密相关性基因有P53、FHJT和Bal-2基因等，上述基因表达异常是导致肺癌发生和发展的重要因素[2-3]。但关于EGFR、KLF4在不同临床分期肺癌组织中的表达变化研究甚少，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年1月本院收治的肿瘤内科肺癌患者63例作为研究对象，手术期间收集肺癌组织标本63例作为研究组，癌旁正常肺组织（肺癌边缘外>5 cm）标本60例作为对照组。纳入标准：全部患者均符合肺癌的手术病理学诊断标准，术前未接受辅助治疗[4]。排除标准：严重未控制性急性感染或内科疾病史，未同意此次临床试验研究，合并其他肿瘤，急性肺脓肿和急性肺结核患者。其中男40例，女23例，年龄45～63岁，平均（53.64±8.59）岁，临床TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期29例，Ⅳ期9例；病理类型：鳞癌25例，腺癌30例，小细胞肺癌8例；组织分化程度：高分化13例，中分化34例，低分化或未分化16例；合并淋巴结转移35例，无淋巴结转移28例；手术方式：肺叶切除术40例，全肺切除术23例。
1.2 检测方法 （1）试剂与仪器：兔抗人EGFR、KLF4单克隆抗体，PBS缓冲液（美国Sigma公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）。（2）操作步骤：采用免疫组化方法，10%甲醛固定，脱水、石蜡包埋，连续4 μm切片，脱蜡、水化和自来水冲洗，采用柠檬酸抗原修复液高温高压抗原修复，室温下冷却10 min，采用自来水在压力锅外壁冲淋修复液冷却，冷却至室温后取出切片，自来水冲洗，PBS冲洗3 min×2次，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加100 μL一抗，EGFR（1∶150）、KLF4（1∶100），4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗，室温下孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加DAB显色剂，显色3 min，自来水冲洗终止显色，苏木精复染，PBS返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.3 免疫组化结果判定 EGFR、KLF4以细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色[5-6]，400倍视野下随机选取5个视野，当阳性细胞比例≤5%评定为0分，6%～25%评定为1分，26%～50%评定为2分，51%～75%评定为3分，≥75%评定为4分；当显色强度为未着色者评定为0分，显色强度为浅黄色者评定为1分，棕黄色者评定为2分，棕褐色者评定为3分，阳性细胞比例×显色强度划分等级，其中0～1分为阴性，2～4分为弱阳性，5～7分为阳性，≥8分为强阳性。
1.4 统计学处理 本研究数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以百分比表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组EGFR、KLF4阳性率的比较 研究组EGFR阳性率明显高于对照组，KLF4阳性率明显低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 不同临床分期肺癌组织EGFR、KLF4阳性率的比较 Ⅲ～Ⅳ期EGFR阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期KLF4阳性率明显低于Ⅰ～Ⅱ期，两者比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
3 讨论
EGFR是ERB-B家族成员之一，是一种170ku的膜受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，与生长因子结合具有活化细胞内信号传导，促进细胞增殖，而表皮生长因子受体自身则发生内化作用或下调[7]。表皮生长因子受体与配体相结合促进EGFR形成二聚体和磷酸化而活化，活性EGFR可以向细胞内传导信号[8]。相关研究显示，胃癌组织EGFR表达显著上调，且与胃癌浸润深度和病理组织学分期具有紧密的关系，EGFR表达与胃癌淋巴结转移和组织分化程度显著相关[9]。目前大量研究证实，EGFR及其配体系统参与恶性肿瘤细胞增殖及其病情的发生和发展[10]。未分化胃癌动物模型上应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有明显抑制肿瘤细胞的生长，证实了EGFR阳性表达具有促进恶性肿瘤病情的发生和发展过程[11]。KLF4是一种真核生物锌指蛋白转录因子，通过激活或抑制靶向基因调控基因表达的时间或组织特异性。相关研究表明，KLF4在结肠癌组织中的阳性表达显著降低，但在口腔上皮异常增生、口腔癌的全层上皮中过度弥漫性表达[12-13]。目前关于KLF4在肺癌组织中的表达及其机制尚未完全明确。
本研究结果显示，肺癌组织EGFR阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织，两者比较差异具有显著性，其中Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织EGFR阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织，两者比较差异具有显著性，研究揭示了EGFR阳性表达率在肺癌组织中显著性上调，其中随着临床分期的增加，EGFR阳性表达率越高，肺癌病情越严重[14]。因此，EGFR阳性表达率在反映肺癌病情程度和预后状况中具有重要的意义。另一方面，肺癌组织KLF4阳性表达率明显低于癌旁正常肺组织，两者比较差异具有显著性，其中Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织KLF4阳性表达率明显低于Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织，两者比较差异具有显著性。揭示了KLF4阳性表达率在肺癌组织中显著下调，随着肺癌病情的发展，KLF4阳性表达率显著下降，KLF4在细胞增生和分化中具有重要的作用，并参与肿瘤的发生和发展[15]。 综上所述，EGFR在肺癌组织中阳性表达率显著增高，KLF4在肺癌组织中的阳性表达率显著降低，其中肺癌组织临床分期越高，EGFR阳性率越高，KLF4阳性率越低。
参考文献
[1]李琴，张亚雷，江梅，等.吸烟和CHRNA5-A3-B4基因簇上rs588765位点多态性与肺癌的关联[J].中华疾病控制杂志，2015，19（1）：1-4.
[2]王俊，吴卫兵.非小细胞肺癌组织、癌旁组织和正常组织微小RNA-18a、微小RNA-24和let-7b差异表达分析[J].中华实验外科杂志，2015，32（1）：201.
[3]刘天舒，毛志福，刘军韬，等.Notch信号通路在肺癌干细胞中的表达及其对增殖的影响[J].中华实验外科杂志，2015，32（1）：84-87.
[4]李琴，江梅，赵劭娟，等.吸烟及烟碱型乙酰胆碱受体亚单位α5基因rs17486278位点多态性对肺癌的交互作用[J].中华流行病学杂志，2015，36（1）：67-70.
[5] 王红霞，陈昊，闫蓉，等.涎腺癌组织中EGFR和HER-2表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（8）：900-904.
[6] 孙红成.KLF4表达联合米兰标准在肝癌肝移植受者预后分析中的价值[J].中华器官移植杂志，2014，35（6）：333-336.
[7] 刘勤，杨伟明，杨雪峰，等.双侧乳腺癌CyclinD1和EGFR的蛋白表达及相关性[J].中国妇幼保健，2014，29（21）：3502-3505.
[8] 王荣荣，刘晓，陆苏.乳腺癌中BAG-1 EGFR和PARP-1的表达及其临床意义[J].中国肿瘤临床，2014，41（13）：866-871.
[9]张小辉.胃癌组织中EGFR和TGF-α的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（6）：676-678.
[10] 单宝珍，李胜保.大肠癌及其癌前组织中EGFR蛋白的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2014，24（11）：63-66.
[11]黄邵洪，胡昆鹏.siRNA沉默KLF4的表达促进食管癌KYSE140细胞的增殖及迁移[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013，20（3）：301-305.
[12] 张志平，王洲，刘相燕，等.食管癌组织KLF4和Survivin蛋白表达及其相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志，2012，19（6）：406-409.
[13] 杨文婷，刘树艳，郑鹏生.转录因子KLF4在宫颈癌中的表达及意义[J].西安交通大学学报：医学版，2010，25（1）：22-25.
[14] 许学亮.转录活化因子和表皮生长因子受体在非小细胞肺癌中表达的相关性研究[J].重庆医学，2013，42（7）：757-758.
[15] 张志平，王洲，刘相燕，等.KLF4和SPARC在非小细胞肺癌中的表达及其相关性研究[J].中国肺癌杂志，2012，15（12）：720-724.
（收稿日期：2015-09-22） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 表皮生长因子受体； Kruppel样因子； 临床分期； 肺癌
目前，随着经济社会的发展，环境污染加重和吸烟等多种影响因素均导致肺癌发生率和死亡率逐渐增加[1]。目前关于肺癌的病理发生机制尚未完全明确，其中与肺癌紧密相关性基因有P53、FHJT和Bal-2基因等，上述基因表达异常是导致肺癌发生和发展的重要因素[2-3]。但关于EGFR、KLF4在不同临床分期肺癌组织中的表达变化研究甚少，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年1月本院收治的肿瘤内科肺癌患者63例作为研究对象，手术期间收集肺癌组织标本63例作为研究组，癌旁正常肺组织（肺癌边缘外>5 cm）标本60例作为对照组。纳入标准：全部患者均符合肺癌的手术病理学诊断标准，术前未接受辅助治疗[4]。排除标准：严重未控制性急性感染或内科疾病史，未同意此次临床试验研究，合并其他肿瘤，急性肺脓肿和急性肺结核患者。其中男40例，女23例，年龄45～63岁，平均（53.64±8.59）岁，临床TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期29例，Ⅳ期9例；病理类型：鳞癌25例，腺癌30例，小细胞肺癌8例；组织分化程度：高分化13例，中分化34例，低分化或未分化16例；合并淋巴结转移35例，无淋巴结转移28例；手术方式：肺叶切除术40例，全肺切除术23例。
1.2 检测方法 （1）试剂与仪器：兔抗人EGFR、KLF4单克隆抗体，PBS缓冲液（美国Sigma公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）。（2）操作步骤：采用免疫组化方法，10%甲醛固定，脱水、石蜡包埋，连续4 μm切片，脱蜡、水化和自来水冲洗，采用柠檬酸抗原修复液高温高压抗原修复，室温下冷却10 min，采用自来水在压力锅外壁冲淋修复液冷却，冷却至室温后取出切片，自来水冲洗，PBS冲洗3 min×2次，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加100 μL一抗，EGFR（1∶150）、KLF4（1∶100），4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗，室温下孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加DAB显色剂，显色3 min，自来水冲洗终止显色，苏木精复染，PBS返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.3 免疫组化结果判定 EGFR、KLF4以细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色[5-6]，400倍视野下随机选取5个视野，当阳性细胞比例≤5%评定为0分，6%～25%评定为1分，26%～50%评定为2分，51%～75%评定为3分，≥75%评定为4分；当显色强度为未着色者评定为0分，显色强度为浅黄色者评定为1分，棕黄色者评定为2分，棕褐色者评定为3分，阳性细胞比例×显色强度划分等级，其中0～1分为阴性，2～4分为弱阳性，5～7分为阳性，≥8分为强阳性。
1.4 统计学处理 本研究数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以百分比表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组EGFR、KLF4阳性率的比较 研究组EGFR阳性率明显高于对照组，KLF4阳性率明显低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 不同临床分期肺癌组织EGFR、KLF4阳性率的比较 Ⅲ～Ⅳ期EGFR阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期KLF4阳性率明显低于Ⅰ～Ⅱ期，两者比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
3 讨论
EGFR是ERB-B家族成员之一，是一种170ku的膜受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，与生长因子结合具有活化细胞内信号传导，促进细胞增殖，而表皮生长因子受体自身则发生内化作用或下调[7]。表皮生长因子受体与配体相结合促进EGFR形成二聚体和磷酸化而活化，活性EGFR可以向细胞内传导信号[8]。相关研究显示，胃癌组织EGFR表达显著上调，且与胃癌浸润深度和病理组织学分期具有紧密的关系，EGFR表达与胃癌淋巴结转移和组织分化程度显著相关[9]。目前大量研究证实，EGFR及其配体系统参与恶性肿瘤细胞增殖及其病情的发生和发展[10]。未分化胃癌动物模型上应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有明显抑制肿瘤细胞的生长，证实了EGFR阳性表达具有促进恶性肿瘤病情的发生和发展过程[11]。KLF4是一种真核生物锌指蛋白转录因子，通过激活或抑制靶向基因调控基因表达的时间或组织特异性。相关研究表明，KLF4在结肠癌组织中的阳性表达显著降低，但在口腔上皮异常增生、口腔癌的全层上皮中过度弥漫性表达[12-13]。目前关于KLF4在肺癌组织中的表达及其机制尚未完全明确。
本研究结果显示，肺癌组织EGFR阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织，两者比较差异具有显著性，其中Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织EGFR阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织，两者比较差异具有显著性，研究揭示了EGFR阳性表达率在肺癌组织中显著性上调，其中随着临床分期的增加，EGFR阳性表达率越高，肺癌病情越严重[14]。因此，EGFR阳性表达率在反映肺癌病情程度和预后状况中具有重要的意义。另一方面，肺癌组织KLF4阳性表达率明显低于癌旁正常肺组织，两者比较差异具有显著性，其中Ⅲ～Ⅳ期肺癌组织KLF4阳性表达率明显低于Ⅰ～Ⅱ期肺癌组织，两者比较差异具有显著性。揭示了KLF4阳性表达率在肺癌组织中显著下调，随着肺癌病情的发展，KLF4阳性表达率显著下降，KLF4在细胞增生和分化中具有重要的作用，并参与肿瘤的发生和发展[15]。 综上所述，EGFR在肺癌组织中阳性表达率显著增高，KLF4在肺癌组织中的阳性表达率显著降低，其中肺癌组织临床分期越高，EGFR阳性率越高，KLF4阳性率越低。
参考文献
[1]李琴，张亚雷，江梅，等.吸烟和CHRNA5-A3-B4基因簇上rs588765位点多态性与肺癌的关联[J].中华疾病控制杂志，2015，19（1）：1-4.
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[5] 王红霞，陈昊，闫蓉，等.涎腺癌组织中EGFR和HER-2表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（8）：900-904.
[6] 孙红成.KLF4表达联合米兰标准在肝癌肝移植受者预后分析中的价值[J].中华器官移植杂志，2014，35（6）：333-336.
[7] 刘勤，杨伟明，杨雪峰，等.双侧乳腺癌CyclinD1和EGFR的蛋白表达及相关性[J].中国妇幼保健，2014，29（21）：3502-3505.
[8] 王荣荣，刘晓，陆苏.乳腺癌中BAG-1 EGFR和PARP-1的表达及其临床意义[J].中国肿瘤临床，2014，41（13）：866-871.
[9]张小辉.胃癌组织中EGFR和TGF-α的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（6）：676-678.
[10] 单宝珍，李胜保.大肠癌及其癌前组织中EGFR蛋白的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2014，24（11）：63-66.
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[12] 张志平，王洲，刘相燕，等.食管癌组织KLF4和Survivin蛋白表达及其相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志，2012，19（6）：406-409.
[13] 杨文婷，刘树艳，郑鹏生.转录因子KLF4在宫颈癌中的表达及意义[J].西安交通大学学报：医学版，2010，25（1）：22-25.
[14] 许学亮.转录活化因子和表皮生长因子受体在非小细胞肺癌中表达的相关性研究[J].重庆医学，2013，42（7）：757-758.
[15] 张志平，王洲，刘相燕，等.KLF4和SPARC在非小细胞肺癌中的表达及其相关性研究[J].中国肺癌杂志，2012，15（12）：720-724.
（收稿日期：2015-09-22） （本文编辑：蔡元元）