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摘 要：为研究GC/MS指纹图谱在烤烟产区识别中的应用，实验采用同时蒸馏萃取烤烟中香气物质，GC/MS检测，构建了湖南、广西、贵州3个产区烤烟的致香物质标准指纹图谱。随机选取这3个产区及广东、河南的部分烤烟样品对建立的标准指纹图谱进行验证。结果表明，验证样品与其所属产区的标准指纹图谱相似度较高，而与其他产区标准指纹图谱的相似度较低，从而能准确的识别其所属产区。将几个产区烤烟样品的指纹图谱进行系统聚类分析，不同产区的烤烟能够很好的聚合到一类，表明构建的指纹图谱能够反映不同产区烤烟的风格特色，进一步验证了利用GC/MS指纹图谱结合系统聚类法对样品进行产区识别及风格特色定位的可行性。
关键词：烤烟；致香物质；聚类分析；指纹图谱；产区识别
中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2014）06-0085-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.017
Abstract： In order to explore the potential of identifying flue-cured tobacco producing areas and controlling leaf quality by using GC/MS fingerprint， SDE combined with GC/MS was used to construct three standard fingerprints on aroma component of flue-cured tobacco from three areas （Hunan， Guangxi and Guizhou）. Random samples from the 3 areas were used to tested and samples from Guangdong and Henan were used to verify the standard fingerprints. The results showed that there was high similarity among samples in the same producing area for the 3 areas， while low similarity was exist among samples from different areas. The sample similarity from Guangdong， Henan with the other 3 areas were lower than the threshold value of the standard fingerprint. It suggested that the system could discriminate effectively producing areas of flue-cured tobacco. Hierarchical cluster analysis was also carried out to analyze the aroma component of the flue-cured tobacco. The results showed that it was basically the same as the fingerprint identification results， which further proved the feasibility of identification of the producing areas and the characteristic of flue-cured tobacco based on GC/MS fingerprint and combined hierarchical cluster analysis.
Keywords： flue-cured tobacco； aroma component； hierarchical cluster analysis； fingerprint chromatography； origin discrimination
我国烟区幅员辽阔生态多样，使得不同产区的烟叶风格各异[1-2]，烟叶原料是发展“中式卷烟”的重要基础[3-4]。通过将不同产区烟叶进行组合配比，可以调制出风格迥异的卷烟产品。目前，行业对烟叶风格特色的定位、评价主要依靠感官评吸，易受评吸主观影响，评价结果往往存在差异。指纹图谱技术是近些年来出现的控制中药材质量的较好方法之一，以指纹图谱作为中药（天然药物）提取物及其制剂的质量控制方法[5-10]，已成为国际共识。本研究旨在借助指纹图谱技术，建立起不同产区烟叶的标准指纹图谱，并结合系统聚类分析的模式识别，用于指导、筛选和鉴定烟叶产区。
目前的研究表明，烟草致香物质对烟草的风格特色有着十分重要的影响[11-13]，为了寻找不同香型特色烟叶的特征化学成分，中国烟叶公司2010年启动了“特色优质烟叶开发”重大专项，将“烟叶香型风格的特征化学成分研究”项目作为专项重要研究内容。但由于形成香气的物质非常复杂，要从众多成分中，找出影响烟叶风格特色的关键物质，实非易事，目前尚未确定不同风格特色烟叶的独特化学成分。烟草指纹图谱技术，为从整体上评价烟草风格特色提供了一种新技术，因此，探索烤烟致香物质指纹图谱技术，从“整体性”、“模糊性”的角度对烟叶的风格特色定位，进而实现烟叶样品的产区识别，有着积极的意义。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 实验材料 实验所用烤烟样品为2012年采收，等级均为C3F，采自湖南（郴州、永州）、广西（河池、百色）、贵州（遵义、毕节）、广东（南雄）和河南（三门峡）5个产区。二氯甲烷为色谱纯，氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯。 1.1.2 实验仪器 气质联用仪：Agilent 7890A-5975C；同时蒸馏萃取装置（安徽天长华玻公司）；氮吹仪（美国OA公司）；BS214S天平（德国Sartorius）；水浴锅，电热套。
1.2 实验方法
1.2.1 致香物质测定 致香物质的检测采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱法（GC/MS）[14-15]。
1.2.2 相似度计算 采用相关系数法计算样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，计算公式参照曹建敏等[14]的方法。
1.2.3 感官评吸 由中国农业科学院烟草研究所评吸委员会参照GB 5606.4—2005卷烟第4部分[16]感官技术要求，对实验所用烤烟样品卷制的单料烟进行评吸，并对单料烟香型进行评判。
1.2.4 数据处理 运用DPS 13.5软件进行。
2 结 果
2.1 不同产区烤烟致香物质标准指纹图谱建立
不同产区烤烟一般都具有不同的风格特色，因此，不同产区的烤烟样品即使经感官评吸评判的香型相同，其风格特色也不尽相同。从湖南、广西、贵州3个产区2012年采收烤烟样品中，根据评吸结果选取以上3个产区具有代表性的样品，其中湖南25个，香型以浓偏中、中偏浓和浓香型为主，广西25个，香型以中偏浓、浓偏中为主，贵州25个，香型以中偏清、清偏中、中间型为主，共75个样品。按照1.2.1方法进行处理，通过GC/MS做全扫描，根据谱库检索结果，选择匹配率大于800的色谱峰共130个，在选择离子模式下进行检测，对各样品的GC/MS结果进行分析，其中75个样品具有124个共有峰（除内标），将这124个共有峰做相关性分析，将相关系数大于0.70的色谱峰合并，得到101个特征峰，参照文献[17]方法计算相对保留时间和相对峰面积。将这101个特征峰作为特征指纹峰，得到了这75个样品的致香物质指纹图谱，利用平均数法，分别得到这3个产区的烤烟标准指纹图谱。
2.2 不同产区烤烟致香物质指纹图谱相似度评价
将选取的烤烟样品的指纹图谱看做是以101个特征峰为维数，以相对峰面积为物质含量的空间101维向量，分别计算3个产区烤烟样品与所属产区及其他2个产区烤烟标准指纹图谱的相似度（表1）。
将每个产区中所有样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度最小值定义为阈值，由此可知，湖南、广西、贵州地区烤烟标准指纹图谱的阈值分别为0.751、0.755、0.759。这样以来，在鉴别不同产区烤烟样品时，分别计算未知样品与3个产区标准指纹图谱的相似度，再将每个相似度值跟与之相对应的产区阈值进行比较，如果相似度值大于阈值，就认为该未知样品属于这个产区，反之，就不属于该产区。从表1可以看出，除广西8号样品与湖南烤烟标准指纹图谱的类间相似度值略大于湖南地区标准指纹图谱的阈值外，其他3个产区与另外两个产区的类间相似度均小于其类内相似度的阈值。这说明建立的3个产区的标准指纹图谱能够将不同产区的烤烟样品区分开来。
2.3 不同产区烤烟指纹图谱验证
为了验证3个产区标准指纹图谱在产区识别中的可行性和准确性，从湖南、广西、贵州、河南、广东选取20个具有产区代表性的烤烟样品，其中湖南3个（评吸结果判定香型为中偏浓）、广西3个（评吸结果判定香型为中偏浓），贵州4个（评吸结果判定为中间香型）、广东5个（评吸结果判定为浓香型）、河南5个（评吸结果判定为浓偏中），按照1.2.1和2.1方法进行处理，得到20个烤烟样品的特征指纹图谱，分别计算这20个样品指纹图谱与3个产区标准指纹图谱的相似度值，如表2所示，再结合3个产区的阈值，可以得出，1#、2#、3#为湖南产区样品，4#、5#、6#为广西产区样品，7#、8#、9#、10#为贵州产区样品，11#～20#与3个产区标准指纹图谱相似度均低于其阈值，因此不属于这3个产区。由验证结果可以看出，每个样品与其所属产区的标准指纹图谱相似度较高，而与其他产区标准指纹图谱的相似度较低，从而准确的识别出其所属产区。
2.4 不同产区烤烟样品系统聚类分析
对湖南、广西、贵州75个建标样品，广东、河南10个验证样品，共计85个烤烟样本的101个特征峰，相对参比峰的峰面积进行量化，得到85*101价原始数据矩阵，运用DPS软件，对数据标准化后，采用绝对值距离，离差平方和聚类方法，进行聚类分析。图1为系统聚类谱系图，由图1可以看出，不同产区烤烟样品能够很好的聚合到一起，界限较为明显，与指纹图谱的判断结果基本一致。当85个样品分为两大类时，湖南、广东、河南、广西的60个样品聚为一类，贵州的25个样品聚为一类，说明贵州烤烟样品与其他4个产区烤烟风格特色差异较大。表明构建标准指纹图谱的致香物质种类能够反映不同产区烤烟的风格特色，从而更好的验证了利用致香物质指纹图谱对样品进行产区识别和风格特色评价的可行性。
3 讨 论
本研究通过借鉴中药质量控制研究领域指纹图谱技术，建立了湖南、广西、贵州3个产区烤烟致香物质标准指纹图谱，分别计算这3个产区烤烟样品与所属产区及其他两个产区烤烟标准指纹图谱的类内和类间相似度值，相似度结果越大表明该样品与标准指纹图谱的相似程度越高。从相似度计算结果可以看出，每个产区内样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度值较高，而与其他产区标准指纹图谱的类间相似度值偏低，说明同一产区烤烟样品的风格特色相似程度较高，而与其他产区差异较大。将每个产区建标样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度最小值定义为阈值，分别计算未知样品与3个产区标准指纹图谱的相似度，再将相似度值跟与之相对应的产区阈值进行比较，可以对烤烟样品的产地进行识别。
文中又选取了湖南、广西、贵州、广东、河南5个产区共20个烤烟样品对湖南、广西、贵州3个产区的标准指纹图谱进行验证。结果表明，除广西8号样品与湖南烤烟标准指纹图谱的类间相似度值略大于湖南地区标准指纹图谱的阈值外，其他3个产区与另外两个产区的类间相似度均小于其类内相似度的阈值，另外，验证样品与其所属产区的标准指纹图谱相似度较高，而与其他产区标准指纹图谱的相似度较低，从而能准确的识别出其所属产区，将不同产区的烤烟样品区分开来。 在中药原材料质量控制中，聚类分析、主成分分析等化学模式识别可作为相似度评价方法的有益补充，从而更客观的评价中药内在质量的真实性和一致性[18]，目前这种研究方法在石斛兰和灵芝的质量控制和产地识别中都有应用[19-20]。本研究运用系统聚类分析对85个烤烟样品的指纹图谱进行了模式识别，从系统聚类谱系图可以看出，不同产区烤烟由于具有不同的风格特色，能够很好的聚合到一类，分析结果与相似度评价软件计算结果一致。
4 结 论
本研究建立的烤烟致香物质GC/MS指纹图谱方法，能够有效的对烤烟产区进行识别，从而将不同产区的烤烟样品区分开来。此外，将指纹图谱的相似度评价方法结合系统聚类的化学模式识别，可以直观的显示各个产区烤烟的分布，对不同烟区烤烟进行空间识别，从而进一步验证了利用致香物质指纹图谱对烤烟样品进行产区识别和风格特色评价的可行性。
参考文献
[1] 李章海，王能如，王东胜，等. 不同生态尺度烟区烤烟香型风格的初步研究[J]. 中国烟草科学，2009，30（5）：67-70，76.
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关键词：烤烟；致香物质；聚类分析；指纹图谱；产区识别
中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2014）06-0085-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.017
Abstract： In order to explore the potential of identifying flue-cured tobacco producing areas and controlling leaf quality by using GC/MS fingerprint， SDE combined with GC/MS was used to construct three standard fingerprints on aroma component of flue-cured tobacco from three areas （Hunan， Guangxi and Guizhou）. Random samples from the 3 areas were used to tested and samples from Guangdong and Henan were used to verify the standard fingerprints. The results showed that there was high similarity among samples in the same producing area for the 3 areas， while low similarity was exist among samples from different areas. The sample similarity from Guangdong， Henan with the other 3 areas were lower than the threshold value of the standard fingerprint. It suggested that the system could discriminate effectively producing areas of flue-cured tobacco. Hierarchical cluster analysis was also carried out to analyze the aroma component of the flue-cured tobacco. The results showed that it was basically the same as the fingerprint identification results， which further proved the feasibility of identification of the producing areas and the characteristic of flue-cured tobacco based on GC/MS fingerprint and combined hierarchical cluster analysis.
Keywords： flue-cured tobacco； aroma component； hierarchical cluster analysis； fingerprint chromatography； origin discrimination
我国烟区幅员辽阔生态多样，使得不同产区的烟叶风格各异[1-2]，烟叶原料是发展“中式卷烟”的重要基础[3-4]。通过将不同产区烟叶进行组合配比，可以调制出风格迥异的卷烟产品。目前，行业对烟叶风格特色的定位、评价主要依靠感官评吸，易受评吸主观影响，评价结果往往存在差异。指纹图谱技术是近些年来出现的控制中药材质量的较好方法之一，以指纹图谱作为中药（天然药物）提取物及其制剂的质量控制方法[5-10]，已成为国际共识。本研究旨在借助指纹图谱技术，建立起不同产区烟叶的标准指纹图谱，并结合系统聚类分析的模式识别，用于指导、筛选和鉴定烟叶产区。
目前的研究表明，烟草致香物质对烟草的风格特色有着十分重要的影响[11-13]，为了寻找不同香型特色烟叶的特征化学成分，中国烟叶公司2010年启动了“特色优质烟叶开发”重大专项，将“烟叶香型风格的特征化学成分研究”项目作为专项重要研究内容。但由于形成香气的物质非常复杂，要从众多成分中，找出影响烟叶风格特色的关键物质，实非易事，目前尚未确定不同风格特色烟叶的独特化学成分。烟草指纹图谱技术，为从整体上评价烟草风格特色提供了一种新技术，因此，探索烤烟致香物质指纹图谱技术，从“整体性”、“模糊性”的角度对烟叶的风格特色定位，进而实现烟叶样品的产区识别，有着积极的意义。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 实验材料 实验所用烤烟样品为2012年采收，等级均为C3F，采自湖南（郴州、永州）、广西（河池、百色）、贵州（遵义、毕节）、广东（南雄）和河南（三门峡）5个产区。二氯甲烷为色谱纯，氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯。 1.1.2 实验仪器 气质联用仪：Agilent 7890A-5975C；同时蒸馏萃取装置（安徽天长华玻公司）；氮吹仪（美国OA公司）；BS214S天平（德国Sartorius）；水浴锅，电热套。
1.2 实验方法
1.2.1 致香物质测定 致香物质的检测采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱法（GC/MS）[14-15]。
1.2.2 相似度计算 采用相关系数法计算样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，计算公式参照曹建敏等[14]的方法。
1.2.3 感官评吸 由中国农业科学院烟草研究所评吸委员会参照GB 5606.4—2005卷烟第4部分[16]感官技术要求，对实验所用烤烟样品卷制的单料烟进行评吸，并对单料烟香型进行评判。
1.2.4 数据处理 运用DPS 13.5软件进行。
2 结 果
2.1 不同产区烤烟致香物质标准指纹图谱建立
不同产区烤烟一般都具有不同的风格特色，因此，不同产区的烤烟样品即使经感官评吸评判的香型相同，其风格特色也不尽相同。从湖南、广西、贵州3个产区2012年采收烤烟样品中，根据评吸结果选取以上3个产区具有代表性的样品，其中湖南25个，香型以浓偏中、中偏浓和浓香型为主，广西25个，香型以中偏浓、浓偏中为主，贵州25个，香型以中偏清、清偏中、中间型为主，共75个样品。按照1.2.1方法进行处理，通过GC/MS做全扫描，根据谱库检索结果，选择匹配率大于800的色谱峰共130个，在选择离子模式下进行检测，对各样品的GC/MS结果进行分析，其中75个样品具有124个共有峰（除内标），将这124个共有峰做相关性分析，将相关系数大于0.70的色谱峰合并，得到101个特征峰，参照文献[17]方法计算相对保留时间和相对峰面积。将这101个特征峰作为特征指纹峰，得到了这75个样品的致香物质指纹图谱，利用平均数法，分别得到这3个产区的烤烟标准指纹图谱。
2.2 不同产区烤烟致香物质指纹图谱相似度评价
将选取的烤烟样品的指纹图谱看做是以101个特征峰为维数，以相对峰面积为物质含量的空间101维向量，分别计算3个产区烤烟样品与所属产区及其他2个产区烤烟标准指纹图谱的相似度（表1）。
将每个产区中所有样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度最小值定义为阈值，由此可知，湖南、广西、贵州地区烤烟标准指纹图谱的阈值分别为0.751、0.755、0.759。这样以来，在鉴别不同产区烤烟样品时，分别计算未知样品与3个产区标准指纹图谱的相似度，再将每个相似度值跟与之相对应的产区阈值进行比较，如果相似度值大于阈值，就认为该未知样品属于这个产区，反之，就不属于该产区。从表1可以看出，除广西8号样品与湖南烤烟标准指纹图谱的类间相似度值略大于湖南地区标准指纹图谱的阈值外，其他3个产区与另外两个产区的类间相似度均小于其类内相似度的阈值。这说明建立的3个产区的标准指纹图谱能够将不同产区的烤烟样品区分开来。
2.3 不同产区烤烟指纹图谱验证
为了验证3个产区标准指纹图谱在产区识别中的可行性和准确性，从湖南、广西、贵州、河南、广东选取20个具有产区代表性的烤烟样品，其中湖南3个（评吸结果判定香型为中偏浓）、广西3个（评吸结果判定香型为中偏浓），贵州4个（评吸结果判定为中间香型）、广东5个（评吸结果判定为浓香型）、河南5个（评吸结果判定为浓偏中），按照1.2.1和2.1方法进行处理，得到20个烤烟样品的特征指纹图谱，分别计算这20个样品指纹图谱与3个产区标准指纹图谱的相似度值，如表2所示，再结合3个产区的阈值，可以得出，1#、2#、3#为湖南产区样品，4#、5#、6#为广西产区样品，7#、8#、9#、10#为贵州产区样品，11#～20#与3个产区标准指纹图谱相似度均低于其阈值，因此不属于这3个产区。由验证结果可以看出，每个样品与其所属产区的标准指纹图谱相似度较高，而与其他产区标准指纹图谱的相似度较低，从而准确的识别出其所属产区。
2.4 不同产区烤烟样品系统聚类分析
对湖南、广西、贵州75个建标样品，广东、河南10个验证样品，共计85个烤烟样本的101个特征峰，相对参比峰的峰面积进行量化，得到85*101价原始数据矩阵，运用DPS软件，对数据标准化后，采用绝对值距离，离差平方和聚类方法，进行聚类分析。图1为系统聚类谱系图，由图1可以看出，不同产区烤烟样品能够很好的聚合到一起，界限较为明显，与指纹图谱的判断结果基本一致。当85个样品分为两大类时，湖南、广东、河南、广西的60个样品聚为一类，贵州的25个样品聚为一类，说明贵州烤烟样品与其他4个产区烤烟风格特色差异较大。表明构建标准指纹图谱的致香物质种类能够反映不同产区烤烟的风格特色，从而更好的验证了利用致香物质指纹图谱对样品进行产区识别和风格特色评价的可行性。
3 讨 论
本研究通过借鉴中药质量控制研究领域指纹图谱技术，建立了湖南、广西、贵州3个产区烤烟致香物质标准指纹图谱，分别计算这3个产区烤烟样品与所属产区及其他两个产区烤烟标准指纹图谱的类内和类间相似度值，相似度结果越大表明该样品与标准指纹图谱的相似程度越高。从相似度计算结果可以看出，每个产区内样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度值较高，而与其他产区标准指纹图谱的类间相似度值偏低，说明同一产区烤烟样品的风格特色相似程度较高，而与其他产区差异较大。将每个产区建标样品与该产区标准指纹图谱的类内相似度最小值定义为阈值，分别计算未知样品与3个产区标准指纹图谱的相似度，再将相似度值跟与之相对应的产区阈值进行比较，可以对烤烟样品的产地进行识别。
文中又选取了湖南、广西、贵州、广东、河南5个产区共20个烤烟样品对湖南、广西、贵州3个产区的标准指纹图谱进行验证。结果表明，除广西8号样品与湖南烤烟标准指纹图谱的类间相似度值略大于湖南地区标准指纹图谱的阈值外，其他3个产区与另外两个产区的类间相似度均小于其类内相似度的阈值，另外，验证样品与其所属产区的标准指纹图谱相似度较高，而与其他产区标准指纹图谱的相似度较低，从而能准确的识别出其所属产区，将不同产区的烤烟样品区分开来。 在中药原材料质量控制中，聚类分析、主成分分析等化学模式识别可作为相似度评价方法的有益补充，从而更客观的评价中药内在质量的真实性和一致性[18]，目前这种研究方法在石斛兰和灵芝的质量控制和产地识别中都有应用[19-20]。本研究运用系统聚类分析对85个烤烟样品的指纹图谱进行了模式识别，从系统聚类谱系图可以看出，不同产区烤烟由于具有不同的风格特色，能够很好的聚合到一类，分析结果与相似度评价软件计算结果一致。
4 结 论
本研究建立的烤烟致香物质GC/MS指纹图谱方法，能够有效的对烤烟产区进行识别，从而将不同产区的烤烟样品区分开来。此外，将指纹图谱的相似度评价方法结合系统聚类的化学模式识别，可以直观的显示各个产区烤烟的分布，对不同烟区烤烟进行空间识别，从而进一步验证了利用致香物质指纹图谱对烤烟样品进行产区识别和风格特色评价的可行性。
参考文献
[1] 李章海，王能如，王东胜，等. 不同生态尺度烟区烤烟香型风格的初步研究[J]. 中国烟草科学，2009，30（5）：67-70，76.
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