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摘要：目的探讨基质金属蛋白酶-1（MMP-1）/其组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）在子宫内膜异位症中表达的特点?相关关系及影响?方法： 采用 as及SP免疫组化法检测异位内膜组织（30例）和正常子宫内膜组织（30例）中MMP-1/TIMP-2 mRNA及蛋白的表达?结果： MMP-1和TIMP-2的mRNA及蛋白在人异位内膜组织中均有表达，其中MM-1相对表达量均明显高于正常子宫内膜?差异显著（P<0.05）：TIMP-2表达低于正常内膜组织?各组MMP-1/TIMP-2比值均显著高于正常子宫内膜组（P<0.01）?结论MMP-1和TIMP-2在人异位组织中异常表达?动态平衡紊乱，在子宫内膜异位症中的发生发展中起重要作用异位位内膜组织具有较强的侵袭性，可能是异位内膜发生种植的源头因素?
关键词：子宫内膜异位症；基质金属蛋白酶-1；金属蛋白酶组织抑制因子-2；
Objective： To investigate the expression，relationship and influences of matrix metalloproteinases-1 （MMP-1） /tissue inhibitor of metalloproteinase-2 （TMP-2） in endometriosis.Methods： Determinating the expression of MMP-1/TIMP-2 mRNA and protein in endometrial tissues of ectopic and normal person using RT-PCR and SP immunohistochemical method.Results： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed in endometrial tissues of ectopic group and the expression of MMP-1 mRNA and protein were higher in ectopic group than normal significantly，p<0.05； the expression of TIMP-2 mRNA and protein were lower in ectopic group than normal； MMP-1/TIMP-2 was higher in ectopic group than normal significantly，p<0.01.Conclusion： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed abnormally in endometrial tissues of endometriosis. Disorder of dynamic balance plays a vital role in endometriosis. Ectopic endometrial tissues are aggressive and may be primary causes of endometriosis.
Key words： endometriosis；MMP-1； TIMP-2.
【中图分类号】R711.71 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）04-0577-02
子宫内膜异位症是内膜细胞种植在不正常的位置而形成的一种女性常见妇科疾病[1]?是育龄期妇女的多发病，是引起80% 患者慢性盆腔疼痛，30% 妇科手术和20% 患者不孕的主要原因?子宫内膜异位症具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长的能力，可导致痛经?慢性盆腔痛?性交痛及不孕等症状[2?3]?目前对此病发病的机理有多种说法，其中被普遍认可的是子宫内膜种植学说?此外，子宫内膜异位症的发生还与机体的免疫功能?遗传因素?环境因素有关?
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs ） 直接或间接参与胚胎发育?组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程?子宫内膜异位种植类似于肿瘤侵袭，需要降解细胞外基质，在这一过程中，MMPs发挥了重要作用[4]?MMP-1是MMPs家族中的主要成员，是细胞外基质代谢的主要调节者?本研究探讨MMP-1及其组织金属蛋白酶抑制剂-2在子宫内膜异位症患者子宫内膜中的表达，进一步探讨子宫内膜异位症细胞异位黏附，侵袭及生长机制[5]?
1材料与方法
1.1免疫组化SP 法 所有標本均在开腹手术时采集，立即用10%的甲醛固定，常规脱水及石蜡包埋?每份标本常规HE 染色后，光镜下观察组织学形态，筛选组织标本?切片厚度为4ìm，一抗试剂鼠抗人MMP- 2?MMP- 3?TIMP- 1单克隆抗体购自美国Neomarkers 公司，二抗购自中山生物技术有限公司SP 试剂盒（ 通用型） ?操作流程严格按试剂盒说明书进行?用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照，PBS 代替?一抗作阴性对照?
1.2实时定量PCR反应（Real-Time PCR）：采用SYBR GreePCR Master Mix，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，使其特异性地掺入DNA双链后发射荧光信 号，而不掺入链 中的SYBR染料分子则不会发射荧光信号，从 而保证荧光信号的增加和PCR产物的增加完全同步?在96孔板中加入SYBR混合试剂10 ìl?引物上下游各1 ìl?cDNA1 ìl?Nuclease-Free Water 7 ìl补足至20 ìl?建立PCR产物溶解曲线，U6为内参?实时定量PCR循环条件：STAGE1：95°C 10 min；STAGE2：95°C 15 sec，60°C 1 min；STAGE3：95°C 15 sec，60°C 1 min；95°C 15 sec；60°C 15 sec? 1.3结果判定 细胞间质中出现棕黄色或褐色颗粒为阳性?根据阳性细胞百分率及显色深浅分级?（ 1） 阳性细胞百分率： 无细胞显色或阳性细胞数< 5%为0： 5%～ 35% 细胞显色为1，36%～ 65%细胞显色为2； > 65%细胞显色为3； （ 2） 显色深浅： 不显色或显色不清为0； 浅黄色为1； 棕黄色为2； 深褐色为3?将二者的评分相加除以2，作为该切片的最终评分： 将0?0～ 1?1. 5 ～ 3 分分别定为阴性（ - ） ?阳性（ + ） ?强阳性（ + + ） ?
1.4统计方法 利用Kruskal- Wallis H 检验和Nemenyi 检验?
2结果
2.1免疫组化法示异位组较空白组?在位组MMP-1表达高，TIMP-2表达低，差异有统计学意义；空白组?在位组MMP-1低表达，TIMP-2高表达，差异无统计学意义，见表1
2.2 RT-PCR法示异位组较空白组?在位组MMP-1表达高，TIMP-2表达低，差异有统计学意义；见图2
3讨论
由于E M S 具有类似恶性肿瘤浸润转移的特性，大多数研究着重于肿瘤转移促进因子在E M S 发病中的作用，肿瘤侵袭转移涉及到肿瘤细胞与宿上细胞的黏附性?肿瘤细胞的运动?细胞外基质的降解等过程【6】，其中细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭转移的前提?研究证明子宫内膜碎片必须像肿瘤组织一样通过黏附?侵袭和血管形成，才可以生存?生长，并引起病变和症状力【7】?细胞外基质的降解是新生血管形成及组织结构重建的先决条件，许多因子在子宫内膜组织异位种植?细胞外基质降解的过程中发挥重要作用，细胞外基质的降解涉及到多种水解酶【8】?而M M P s 与细胞外基质降解密切相关，其中M M P - 1 是细胞外基质代谢的主要调节者?
本研究结果表明，在正常稳定状态，组织中M M P -1 表达量极少，而在某些因素刺激下表达量上升?目前认为E M S 是与炎症和凋亡能力下降相关的一种慢性疾病，一旦异位病灶形成，它们就开始分泌多种促炎W 子?研究表明，在位内膜自身免疫调作的异常，与E M S 的发生发展互为因果，异常的内膜免疫环境抑制内膜细胞凋亡?改变内膜功能基因的表达，可能导致M M P -1 的表达升高，降解细胞外基质，而为内膜的异位?黏附?种植?生长增进血管的生成及结构的重建【9】；M M P s 可能受雌激素分泌的类固醇激素调节，类固醇激素通过刺激子宫内膜产生一组具有生物活性的生长因子，促进如M M P - 1 的表达，从而调节月经期的内膜组织重构，促进腹腔内的子宫内膜的异位，并调控疾病的发展过程【10】?本研究未涉及M M P s 与其他因素的联合研究?
目前，临床主要是采用“ 手术为主，药物为辅”的治疗策略，但手术复发率高，药物治疗仍居重要地位，理想的治疗E M S 的药物应该是在缓解疼痛的同时，不抑制排卵和月经，能长期安全使用，甚至有望实现E M S 的手术治疗向药物治疗的模式转变?
参考文献
[1] Michael G.Teneriello，RobertC.ParkEarly detection of Ovarrian Cancer；CA Cancer J Clin 1995；45：71-87
[2] Reese K A ，Reddy S，Rock J A. Endometriosis in an adolescent population：the experience[J].J Pediatr Adolese Gynecol，1996，9（3）：125.
[3] Laufer M R，Goitein L，Bush M，et al.Prevalence of endometriosis in adolescent women with chronic pelvic pain not responding to conventional theray[J].J Pediatr Adolesc Gynecol，1997，10（4）；199.
[4] Osteen KG，Bruner KL，Sharpe-Tinms KL.Steroid and growth factor regulation of matrix metalloproteinase expression and endometriosis[J].Semin Reprod Endocrinol，1996，14（3）：247-255
[5] Chunhong Yan，Heng Wang，Douglas D.Boy.KISS-1 represses 92-kDa type IV collagensae expression by down-regulating NF-B binding to the promoter as a consequence od IB-induced block of p65/p50 nuclear translocation[J].J boil Chem，2001，276（2）：1164-1172
[6] AGRAWAL D ，CHEN T，IRBY R，et al.Osteopontin identified aslead marker of colon caneer progression ，using pooled sample expression profiling[J].Natl Cancer Inst，2008，94（35）：513-521.
[7] 郎景和. 子宮内膜异位症的任务与展望（一）[J]. 中华妇产科杂志，2 0 0 8 ，4 1（ 5 ）： 2 8 9-2 9 1 .
[8] 李央，林金芳. 子宫内膜异位症发病机制研究机制|[J].中华产科杂志，2 0 0 5，4 0（1）： 5 5 - 5 6 .
[9] 全佳丽 . 子宫内膜异位症的在位内膜病变研究进展[J]，现代妇产科进展，2 0 1 0，1 9 （ 6 ）： 4 6 6 - 4 6 7 .
[1 0] 郭平. 子宫内膜异位症研究进展[J].实用临床医学，2011，12（1）：130-132.
关键词：子宫内膜异位症；基质金属蛋白酶-1；金属蛋白酶组织抑制因子-2；
Objective： To investigate the expression，relationship and influences of matrix metalloproteinases-1 （MMP-1） /tissue inhibitor of metalloproteinase-2 （TMP-2） in endometriosis.Methods： Determinating the expression of MMP-1/TIMP-2 mRNA and protein in endometrial tissues of ectopic and normal person using RT-PCR and SP immunohistochemical method.Results： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed in endometrial tissues of ectopic group and the expression of MMP-1 mRNA and protein were higher in ectopic group than normal significantly，p<0.05； the expression of TIMP-2 mRNA and protein were lower in ectopic group than normal； MMP-1/TIMP-2 was higher in ectopic group than normal significantly，p<0.01.Conclusion： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed abnormally in endometrial tissues of endometriosis. Disorder of dynamic balance plays a vital role in endometriosis. Ectopic endometrial tissues are aggressive and may be primary causes of endometriosis.
Key words： endometriosis；MMP-1； TIMP-2.
【中图分类号】R711.71 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）04-0577-02
子宫内膜异位症是内膜细胞种植在不正常的位置而形成的一种女性常见妇科疾病[1]?是育龄期妇女的多发病，是引起80% 患者慢性盆腔疼痛，30% 妇科手术和20% 患者不孕的主要原因?子宫内膜异位症具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长的能力，可导致痛经?慢性盆腔痛?性交痛及不孕等症状[2?3]?目前对此病发病的机理有多种说法，其中被普遍认可的是子宫内膜种植学说?此外，子宫内膜异位症的发生还与机体的免疫功能?遗传因素?环境因素有关?
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs ） 直接或间接参与胚胎发育?组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程?子宫内膜异位种植类似于肿瘤侵袭，需要降解细胞外基质，在这一过程中，MMPs发挥了重要作用[4]?MMP-1是MMPs家族中的主要成员，是细胞外基质代谢的主要调节者?本研究探讨MMP-1及其组织金属蛋白酶抑制剂-2在子宫内膜异位症患者子宫内膜中的表达，进一步探讨子宫内膜异位症细胞异位黏附，侵袭及生长机制[5]?
1材料与方法
1.1免疫组化SP 法 所有標本均在开腹手术时采集，立即用10%的甲醛固定，常规脱水及石蜡包埋?每份标本常规HE 染色后，光镜下观察组织学形态，筛选组织标本?切片厚度为4ìm，一抗试剂鼠抗人MMP- 2?MMP- 3?TIMP- 1单克隆抗体购自美国Neomarkers 公司，二抗购自中山生物技术有限公司SP 试剂盒（ 通用型） ?操作流程严格按试剂盒说明书进行?用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照，PBS 代替?一抗作阴性对照?
1.2实时定量PCR反应（Real-Time PCR）：采用SYBR GreePCR Master Mix，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，使其特异性地掺入DNA双链后发射荧光信 号，而不掺入链 中的SYBR染料分子则不会发射荧光信号，从 而保证荧光信号的增加和PCR产物的增加完全同步?在96孔板中加入SYBR混合试剂10 ìl?引物上下游各1 ìl?cDNA1 ìl?Nuclease-Free Water 7 ìl补足至20 ìl?建立PCR产物溶解曲线，U6为内参?实时定量PCR循环条件：STAGE1：95°C 10 min；STAGE2：95°C 15 sec，60°C 1 min；STAGE3：95°C 15 sec，60°C 1 min；95°C 15 sec；60°C 15 sec? 1.3结果判定 细胞间质中出现棕黄色或褐色颗粒为阳性?根据阳性细胞百分率及显色深浅分级?（ 1） 阳性细胞百分率： 无细胞显色或阳性细胞数< 5%为0： 5%～ 35% 细胞显色为1，36%～ 65%细胞显色为2； > 65%细胞显色为3； （ 2） 显色深浅： 不显色或显色不清为0； 浅黄色为1； 棕黄色为2； 深褐色为3?将二者的评分相加除以2，作为该切片的最终评分： 将0?0～ 1?1. 5 ～ 3 分分别定为阴性（ - ） ?阳性（ + ） ?强阳性（ + + ） ?
1.4统计方法 利用Kruskal- Wallis H 检验和Nemenyi 检验?
2结果
2.1免疫组化法示异位组较空白组?在位组MMP-1表达高，TIMP-2表达低，差异有统计学意义；空白组?在位组MMP-1低表达，TIMP-2高表达，差异无统计学意义，见表1
2.2 RT-PCR法示异位组较空白组?在位组MMP-1表达高，TIMP-2表达低，差异有统计学意义；见图2
3讨论
由于E M S 具有类似恶性肿瘤浸润转移的特性，大多数研究着重于肿瘤转移促进因子在E M S 发病中的作用，肿瘤侵袭转移涉及到肿瘤细胞与宿上细胞的黏附性?肿瘤细胞的运动?细胞外基质的降解等过程【6】，其中细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭转移的前提?研究证明子宫内膜碎片必须像肿瘤组织一样通过黏附?侵袭和血管形成，才可以生存?生长，并引起病变和症状力【7】?细胞外基质的降解是新生血管形成及组织结构重建的先决条件，许多因子在子宫内膜组织异位种植?细胞外基质降解的过程中发挥重要作用，细胞外基质的降解涉及到多种水解酶【8】?而M M P s 与细胞外基质降解密切相关，其中M M P - 1 是细胞外基质代谢的主要调节者?
本研究结果表明，在正常稳定状态，组织中M M P -1 表达量极少，而在某些因素刺激下表达量上升?目前认为E M S 是与炎症和凋亡能力下降相关的一种慢性疾病，一旦异位病灶形成，它们就开始分泌多种促炎W 子?研究表明，在位内膜自身免疫调作的异常，与E M S 的发生发展互为因果，异常的内膜免疫环境抑制内膜细胞凋亡?改变内膜功能基因的表达，可能导致M M P -1 的表达升高，降解细胞外基质，而为内膜的异位?黏附?种植?生长增进血管的生成及结构的重建【9】；M M P s 可能受雌激素分泌的类固醇激素调节，类固醇激素通过刺激子宫内膜产生一组具有生物活性的生长因子，促进如M M P - 1 的表达，从而调节月经期的内膜组织重构，促进腹腔内的子宫内膜的异位，并调控疾病的发展过程【10】?本研究未涉及M M P s 与其他因素的联合研究?
目前，临床主要是采用“ 手术为主，药物为辅”的治疗策略，但手术复发率高，药物治疗仍居重要地位，理想的治疗E M S 的药物应该是在缓解疼痛的同时，不抑制排卵和月经，能长期安全使用，甚至有望实现E M S 的手术治疗向药物治疗的模式转变?
参考文献
[1] Michael G.Teneriello，RobertC.ParkEarly detection of Ovarrian Cancer；CA Cancer J Clin 1995；45：71-87
[2] Reese K A ，Reddy S，Rock J A. Endometriosis in an adolescent population：the experience[J].J Pediatr Adolese Gynecol，1996，9（3）：125.
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[4] Osteen KG，Bruner KL，Sharpe-Tinms KL.Steroid and growth factor regulation of matrix metalloproteinase expression and endometriosis[J].Semin Reprod Endocrinol，1996，14（3）：247-255
[5] Chunhong Yan，Heng Wang，Douglas D.Boy.KISS-1 represses 92-kDa type IV collagensae expression by down-regulating NF-B binding to the promoter as a consequence od IB-induced block of p65/p50 nuclear translocation[J].J boil Chem，2001，276（2）：1164-1172
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