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摘 要：为了解酶解法对燕麦中蛋白质水解度的影响，该研究采用梯度改变酶解反应的蛋白酶类型、加酶量、底物浓度、反应时间的条件，探究燕麦蛋白水解度的变化。结果表明：酶解法制取燕麦蛋白，在3类蛋白酶中碱性蛋白酶对燕麦蛋白的酶解性最好，根据单因素实验结果，并综合考虑实验成本，得出碱性蛋白酶在加酶量为1 200u/g，底物浓度为2%，酶解时间为40min的条件下，水解最为彻底。
关键词：酶解法；燕麦蛋白；水解度
中图分类号 TS201.21 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）06-0032-03
Influence of Enzymatic Hydrolysis on the Hydrolysis Degree of Oat Protein
Zhang Xueying et al.
（College of Food Science，Heilongjiang August First Land Reclamation University，Daqing 163319，China）
Abstract：In order to understand the effect of enzymatic hydrolysis on the degree of protein hydrolysis in oats，the change of proteolytic degree of oat was explored by changing the protease type，enzyme dosage，substrate concentration and reaction time.The results showed that oatmeal protein was prepared by enzymatic hydrolysis，and the proteolytic activity of oat protein was the best in the three kinds of proteases.Based on the single factor experiment and the experimental cost were taken into account，the alkaline protease was 1200u/g，the substrate concentration of 2%，the hydrolysis time of 40min.Under the conditions，the hydrolysis is the most thorough.
Key words：Enzymatic hydrolysis；Oat protein；Degree of hydrolysis
燕麦（Avena sativa L.），《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子，其含有多种易被人体吸引的营养成分，具有降血脂、降血糖、减肥和美容等多种功能，是较受现代人欢迎的食物之一[1-5]。在《Time》杂志评出的十大健康食品中，燕麦名列第5位[6]。燕麦中的氨基酸含量高，且必需氨基酸比重较高，是一种优质的蛋白质源[7-8]。本文通过研究不同酶解条件（酶种类、酶浓度、底物浓度、酶解时间）酶解处理对燕麦蛋白水解度的影响，为研究燕麦蛋白提取工艺提供方法提供理论基础。
1 材料与仪器
1.1 试验材料 燕麦，市售。
1.2 主要仪器和设备 JAR2140型电子分析天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司生产；DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司生产；L420型高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发公司生产。
2 试验条件和方法
2.1 燕麦常规成分分析 蛋白质：GB5009.5-2010检测[9]；脂肪：GB5009.6-2003检测[10]。
2.2 工艺流程 工艺流程如下：燕麦→清洗干燥→粉碎过筛→脱脂→碱溶→加入蛋白酶→进行水解反应→灭酶→调至中性→冻干→燕麦蛋白。
2.3 酶解蛋白质水解度（DH）的测定 采用pH-stat法，水解度的计算公式如下：
[DH（%）=CNaOH×VNaOHα×Mp×Htot×100]
式中：CNaOH、VNaOH分别为水解过程中消耗NaOH的浓度（mol/L）和体积（mL）；Mp为底物蛋白质中净蛋白质质量（g）；Htot为燕麦蛋白中所含肽键的毫摩尔数（mmol/g），根据底物的氨基酸组成计算其值为7.31；α为氨基的平均解离度，可按α=10pH-pK/[1+10pH-pK]計算（pH：水解溶液的pH值；pK：α-氨基的解离度的负对数，pK=7.0）[11-12]。
2.4 酶解条件的变化
2.4.1 酶种类选择实验 设定蛋白酶种类分别为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，加酶量设定在800u/g，底物浓度设定预5%，为了让蛋白酶发挥出既有的水解能力和活性，参考相关文献，将pH调至各类蛋白酶最适宜的酸碱度，分别为9.0，7.0，7.0[13]。
2.4.2 加酶量选择实验 将筛选出的蛋白酶在燕麦蛋白底物浓度为5%的条件下进行酶解处理，加酶量分别设定为400u/g，800u/g，1 200u/g，1 600u/g，2 000u/g。
2.4.3 酶解底物浓度选择实验 在燕麦蛋白溶液中加入一定量的筛选出的蛋白酶进行酶解处理，底物浓度分别设定为1%，2%，3%，4%，5%[14]。
3 结果与讨论
3.1 原料燕麦的基本指标 原料燕麦的基本指标：蛋白质含量为（15.8±0.2）%，油脂含量为（6.1±0.1）%。 3.2 不同酶解处理对燕麦蛋白水解度的影响
3.2.1 蛋白酶种类对燕麦蛋白水解度的影响 由图1可知，碱性蛋白酶和中性蛋白酶对燕麦蛋白的水解作用强于木瓜蛋白酶，当反应时间短于20min时，碱性蛋白酶与中性蛋白酶对燕麦蛋白的水解程度差异不大，而当反应时间超过20min时，碱性蛋白酶的水解效果显著高于中性蛋白酶。原因可能是碱性蛋白酶的水解pH为碱性，燕麦蛋白的碱液中具有较好的溶解性，使得蛋白质在溶液中充分的溶解，能够更高效的与蛋白酶结合，继而增强了水解效果。因此在接下来的试验中选择碱性蛋白酶为水解燕麦蛋白的蛋白酶，并对其水解条件进行优化。
3.2.2 加酶量对燕麦蛋白水解度的影响 由图2可知，随着蛋白酶添加量的升高，燕麦蛋白的水解度也不断攀升，当加酶量增加至1 200u/g时，蛋白酶的水解度的增长趋势逐渐放缓，变化幅度逐渐减小。这可能是由于逐渐增加加酶量會使燕麦蛋白与蛋白酶接触增加，继而加快水解反应，当蛋白酶增加至一定浓度时，蛋白酶的浓度超过与底物相结合的阙值，继续增加蛋白酶，其与底物相接触的程度也不会有明显增加[15]。
3.2.3 底物浓度对燕麦蛋白水解度的影响 由图3可知，随着燕麦蛋白底物浓度的变化，蛋白质的水解度呈现先增加后降低的抛物线趋势。当底物浓度增加至2%时，蛋白质的水解度增长趋势明显的趋缓。当底物浓度增加至3%以上，随着底物浓度的升高，蛋白质水解度反而呈现下降趋势，且变化趋势相对明显。这可能是由于燕麦蛋白的浓度增加到一定的阙值后，会阻碍蛋白酶对蛋白质的水解能力，当蛋白质浓度过高会减弱其在溶液中的分散程度，进而减少了蛋白质与酶的接触和反应。
3.2.4 反应时间对燕麦蛋白水解度的影响 由图4可知，随着酶解反应时间的延长，蛋白质水解度呈现先增加后不变的变化趋势。反应时间在30min以内，燕麦蛋白水解度增长趋势显著，稳步提高。当反应时间在30～50min区间内，燕麦蛋白水解度增长趋势明显趋缓，反应时间超过50min后，蛋白质的水解度基本保持不变。
4 结论
本文探讨了不同条件下的酶解反应对燕麦蛋白水解度的影响。综上所述，在3类蛋白酶中碱性蛋白酶对燕麦蛋白的酶解性最好，根据单因素实验结果，并综合考虑实验成本，得出碱性蛋白酶在加酶量为1 200u/g，底物浓度为2%，酶解时间为40min的条件下，水解最为彻底，而酶解法对燕麦蛋白功能特性的影响仍需进一步研究。
参考文献
[1]李桂娟，樊守瑞，尤伟，等.燕麦蛋白的制备工艺研究[J].食品与机械，2009，25（1）：120-123.
[2]张晓平，冯涛，赵世锋，等.酶法提取燕麦蛋白的研究[J].食品科技，2009，34（5）：170-174.
[3]刘建垒，张玲，郝利平.燕麦蛋白提取分离的研究进展[J].食品研究与开发，2014（1）：132-136.
[4]张蓓，郭晓娜，彭伟，等.燕麦蛋白糖基化改性研究[J].中国粮油学报，2016，31（6）：41-46.
[5]孙江，刘振春，徐博，等.响应面优化超声波辅助燕麦蛋白-乳糖接枝的研究[J].农产品加工：上，2015（1）：8-11.
[6]张蓓.燕麦蛋白质糖基化改性及乳化性研究[D].无锡：江南大学，2015.
[7]苏日娜，张美莉.响应面优化水提取燕麦抗真菌蛋白的研究[J].食品工业科技，2015，36（14）：312-316.
[8]Mohamed A，Biresaw G，Xu J，et al.Oats protein isolate：Thermal，rheological，surface and functional properties[J].Food Research International，2009，42（1）：107-114.
[9]中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.5-2010，食品中蛋白质的测定[S].北京：中华人民共和国卫生部，2010.
[10]中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.6-2003，食品中脂肪的测定[S].北京：中华人民共和国卫生部，2003.
[11]Zhang B，Guo X，Zhu K，et al.Improvement of emulsifying properties of oat protein isolate–dextran conjugates by glycation[J].Carbohydrate Polymers，2015，127：168-175.
[12]Leila M，Mahdi K，Mohammad S.Effects of succinylation and deamidation on functional properties of oat protein isolate[J].Food Chemistry，2009，114（1）：127-131.
[13]乔瑶瑶，赵武奇，胡新中，等.近红外光谱技术检测燕麦中蛋白质含量[J].中国粮油学报，2016，31（8）：138-142.
[14]田斌强，邓乾春，黄娟，等.燕麦分离蛋白疏水性及起泡性研究[J].食品研究与开发，2015（6）：1-5.
[15]马萨日娜，张美莉，王晓冬，等.裸燕麦谷蛋白酶解条件的优化[J].食品科技，2016（5）：163-168. （责编：张宏民）
关键词：酶解法；燕麦蛋白；水解度
中图分类号 TS201.21 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）06-0032-03
Influence of Enzymatic Hydrolysis on the Hydrolysis Degree of Oat Protein
Zhang Xueying et al.
（College of Food Science，Heilongjiang August First Land Reclamation University，Daqing 163319，China）
Abstract：In order to understand the effect of enzymatic hydrolysis on the degree of protein hydrolysis in oats，the change of proteolytic degree of oat was explored by changing the protease type，enzyme dosage，substrate concentration and reaction time.The results showed that oatmeal protein was prepared by enzymatic hydrolysis，and the proteolytic activity of oat protein was the best in the three kinds of proteases.Based on the single factor experiment and the experimental cost were taken into account，the alkaline protease was 1200u/g，the substrate concentration of 2%，the hydrolysis time of 40min.Under the conditions，the hydrolysis is the most thorough.
Key words：Enzymatic hydrolysis；Oat protein；Degree of hydrolysis
燕麦（Avena sativa L.），《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子，其含有多种易被人体吸引的营养成分，具有降血脂、降血糖、减肥和美容等多种功能，是较受现代人欢迎的食物之一[1-5]。在《Time》杂志评出的十大健康食品中，燕麦名列第5位[6]。燕麦中的氨基酸含量高，且必需氨基酸比重较高，是一种优质的蛋白质源[7-8]。本文通过研究不同酶解条件（酶种类、酶浓度、底物浓度、酶解时间）酶解处理对燕麦蛋白水解度的影响，为研究燕麦蛋白提取工艺提供方法提供理论基础。
1 材料与仪器
1.1 试验材料 燕麦，市售。
1.2 主要仪器和设备 JAR2140型电子分析天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司生产；DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司生产；L420型高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发公司生产。
2 试验条件和方法
2.1 燕麦常规成分分析 蛋白质：GB5009.5-2010检测[9]；脂肪：GB5009.6-2003检测[10]。
2.2 工艺流程 工艺流程如下：燕麦→清洗干燥→粉碎过筛→脱脂→碱溶→加入蛋白酶→进行水解反应→灭酶→调至中性→冻干→燕麦蛋白。
2.3 酶解蛋白质水解度（DH）的测定 采用pH-stat法，水解度的计算公式如下：
[DH（%）=CNaOH×VNaOHα×Mp×Htot×100]
式中：CNaOH、VNaOH分别为水解过程中消耗NaOH的浓度（mol/L）和体积（mL）；Mp为底物蛋白质中净蛋白质质量（g）；Htot为燕麦蛋白中所含肽键的毫摩尔数（mmol/g），根据底物的氨基酸组成计算其值为7.31；α为氨基的平均解离度，可按α=10pH-pK/[1+10pH-pK]計算（pH：水解溶液的pH值；pK：α-氨基的解离度的负对数，pK=7.0）[11-12]。
2.4 酶解条件的变化
2.4.1 酶种类选择实验 设定蛋白酶种类分别为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，加酶量设定在800u/g，底物浓度设定预5%，为了让蛋白酶发挥出既有的水解能力和活性，参考相关文献，将pH调至各类蛋白酶最适宜的酸碱度，分别为9.0，7.0，7.0[13]。
2.4.2 加酶量选择实验 将筛选出的蛋白酶在燕麦蛋白底物浓度为5%的条件下进行酶解处理，加酶量分别设定为400u/g，800u/g，1 200u/g，1 600u/g，2 000u/g。
2.4.3 酶解底物浓度选择实验 在燕麦蛋白溶液中加入一定量的筛选出的蛋白酶进行酶解处理，底物浓度分别设定为1%，2%，3%，4%，5%[14]。
3 结果与讨论
3.1 原料燕麦的基本指标 原料燕麦的基本指标：蛋白质含量为（15.8±0.2）%，油脂含量为（6.1±0.1）%。 3.2 不同酶解处理对燕麦蛋白水解度的影响
3.2.1 蛋白酶种类对燕麦蛋白水解度的影响 由图1可知，碱性蛋白酶和中性蛋白酶对燕麦蛋白的水解作用强于木瓜蛋白酶，当反应时间短于20min时，碱性蛋白酶与中性蛋白酶对燕麦蛋白的水解程度差异不大，而当反应时间超过20min时，碱性蛋白酶的水解效果显著高于中性蛋白酶。原因可能是碱性蛋白酶的水解pH为碱性，燕麦蛋白的碱液中具有较好的溶解性，使得蛋白质在溶液中充分的溶解，能够更高效的与蛋白酶结合，继而增强了水解效果。因此在接下来的试验中选择碱性蛋白酶为水解燕麦蛋白的蛋白酶，并对其水解条件进行优化。
3.2.2 加酶量对燕麦蛋白水解度的影响 由图2可知，随着蛋白酶添加量的升高，燕麦蛋白的水解度也不断攀升，当加酶量增加至1 200u/g时，蛋白酶的水解度的增长趋势逐渐放缓，变化幅度逐渐减小。这可能是由于逐渐增加加酶量會使燕麦蛋白与蛋白酶接触增加，继而加快水解反应，当蛋白酶增加至一定浓度时，蛋白酶的浓度超过与底物相结合的阙值，继续增加蛋白酶，其与底物相接触的程度也不会有明显增加[15]。
3.2.3 底物浓度对燕麦蛋白水解度的影响 由图3可知，随着燕麦蛋白底物浓度的变化，蛋白质的水解度呈现先增加后降低的抛物线趋势。当底物浓度增加至2%时，蛋白质的水解度增长趋势明显的趋缓。当底物浓度增加至3%以上，随着底物浓度的升高，蛋白质水解度反而呈现下降趋势，且变化趋势相对明显。这可能是由于燕麦蛋白的浓度增加到一定的阙值后，会阻碍蛋白酶对蛋白质的水解能力，当蛋白质浓度过高会减弱其在溶液中的分散程度，进而减少了蛋白质与酶的接触和反应。
3.2.4 反应时间对燕麦蛋白水解度的影响 由图4可知，随着酶解反应时间的延长，蛋白质水解度呈现先增加后不变的变化趋势。反应时间在30min以内，燕麦蛋白水解度增长趋势显著，稳步提高。当反应时间在30～50min区间内，燕麦蛋白水解度增长趋势明显趋缓，反应时间超过50min后，蛋白质的水解度基本保持不变。
4 结论
本文探讨了不同条件下的酶解反应对燕麦蛋白水解度的影响。综上所述，在3类蛋白酶中碱性蛋白酶对燕麦蛋白的酶解性最好，根据单因素实验结果，并综合考虑实验成本，得出碱性蛋白酶在加酶量为1 200u/g，底物浓度为2%，酶解时间为40min的条件下，水解最为彻底，而酶解法对燕麦蛋白功能特性的影响仍需进一步研究。
参考文献
[1]李桂娟，樊守瑞，尤伟，等.燕麦蛋白的制备工艺研究[J].食品与机械，2009，25（1）：120-123.
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[5]孙江，刘振春，徐博，等.响应面优化超声波辅助燕麦蛋白-乳糖接枝的研究[J].农产品加工：上，2015（1）：8-11.
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[9]中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.5-2010，食品中蛋白质的测定[S].北京：中华人民共和国卫生部，2010.
[10]中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.6-2003，食品中脂肪的测定[S].北京：中华人民共和国卫生部，2003.
[11]Zhang B，Guo X，Zhu K，et al.Improvement of emulsifying properties of oat protein isolate–dextran conjugates by glycation[J].Carbohydrate Polymers，2015，127：168-175.
[12]Leila M，Mahdi K，Mohammad S.Effects of succinylation and deamidation on functional properties of oat protein isolate[J].Food Chemistry，2009，114（1）：127-131.
[13]乔瑶瑶，赵武奇，胡新中，等.近红外光谱技术检测燕麦中蛋白质含量[J].中国粮油学报，2016，31（8）：138-142.
[14]田斌强，邓乾春，黄娟，等.燕麦分离蛋白疏水性及起泡性研究[J].食品研究与开发，2015（6）：1-5.
[15]马萨日娜，张美莉，王晓冬，等.裸燕麦谷蛋白酶解条件的优化[J].食品科技，2016（5）：163-168. （责编：张宏民）