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摘要 [目的] 了解宁夏银川贺兰山部分区域岩羊布鲁氏菌病的分布情况。[方法] 以提取53份岩羊样品DNA为模板，使用P1和P2引物进行PCR扩增，对贺兰山野生岩羊布鲁氏菌病的分布状况进行检测。[结果] 53份野生岩羊样品中布鲁氏菌病的阳性检出率为0。[结论] 该研究表明宁夏贺兰山野生岩羊中不存在布鲁氏菌病，但还需要进一步研究。
关键词岩羊；布鲁氏菌病；分子生物学；检测
中图分类号S826.8+9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12935-02
Abstract[Objective] The research aimed to understand the distribution situations of brucellosis in blue sheep in some regions of Helan Mountains in Yinchuan of Ningxia. [Method] 53 DNA samples extracted from blue sheep were taken as template to make PCR amplification with P1 and P2 primers. The distribution situations of brucellosis in blue sheep in Helan Mountains were detected. [Result] The positive rate of brucellosis in 53 samples of blue sheep was zero. [Conclusion] The research results showed that no brucellosis was detected in these blue sheep， but it needed to be further studied.
Key wordsBlue sheep； Brucellosis； Molecular biology； Detection and analysis
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体引起的传染-变态反应性的人畜共患的自然疫源性传染病[1-2]，以流产、早产、不孕、不育、胎盘滞留、睾丸炎、关节炎、神经损伤为主要临床症状，可造成人体许多器官损伤，甚至终身丧失劳动力或残疾，迄今为止尚无根治方法[3]。1985年世界卫生组织（WHO）布鲁氏菌病专家委员会将布鲁氏菌病属分为6个种19个生物型[4]，该病在世界各国均有流行，其中以亚洲、南美洲和非洲等地区最为严重。在我国，该病自1905年在重庆被首次报道[5]，至今已有100多年的历史了，近年来该病的发病率逐年快速上升，疫情呈回升趋势，甚至出现局部爆发[6]。该病不仅危害畜牧生产，而且严重损害人类健康，从而造成巨大的经济损失和严重的公共卫生问题，因此受到广泛重视，被世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，同时被《中华人民共和国传染病防治法》列为乙类传染病，同时被《中华人民共和国动物防疫法》列为二类动物疫病[7]。
布鲁氏菌病的诊断和检疫主要依靠血清学检测和细菌学检测，但是由于上述2种检测方法耗时长、影响因素多、检出率低，不利于该病的早期诊断，且存在假阳性反应，因此在此次调查中采用PCR方法鉴定样品是否被布鲁氏菌感染。
1材料与方法
1.1待检样品宁夏贺兰山自然保护区的53份野生岩羊组织样品。
1.2主要试剂生理盐水、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、蛋白酶K、RNase酶、布鲁氏菌病活疫苗（S2株）。
1.3方法
1.3.1引物。
通过查阅相关文献[8]，选取以下引物：
上游引物P1：5’ATG TCT GGC ACA TCA TGG GC3’；
下游引物P2：5’TCA TGG AGC GGG CCT TGA GAT 3’。
引物由上海英俊公司合成。
1.3.2样品DNA的提取。
①组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5 g组织，放入1.5 ml离心管中，剪碎；
②加入0.45 ml TES混匀，再加入50 μl SDS（10%）和5.0 μl蛋白酶K（20 mg/ml），充分混匀后，于56 ℃保温4～6 h，每隔2 h摇动1次；
③放置到室温下，加入等体积饱和酚（500 μl），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min，小心吸取上清液，置于1个新的15 ml离心管；
④加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min后，吸取上清液转移到新的1.5 ml离心管中；
⑤加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min，取上清液到1个新的15 ml离心管；
⑥加入2.5倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇沉淀DNA；
⑦12 000 r/min，离心10 min，弃掉所有液相；
⑧-20 ℃下保存的75%乙醇洗涤，12 000 r/min，离心5 min，弃去乙醇，干燥DNA；
⑨加入10 μl灭菌去离子水溶解DNA，于-20 ℃下保存，作为模板备用。
1.3.3PCR。
1.3.3.1PCR反应体系。
PCR反应体系由10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上下游引物（20 mmol//L）各1 μl、Taq酶（5 U/μl）0.5 μl、模板DNA 3 μl、去离子水35.5 μl组成。 1.3.3.2PCR反应程序。
95 ℃ 10 min（预变性）；94 ℃ 30 s（变性），55 ℃ 30 s（退火），72 ℃ 1 min（延伸），30个循环；
72 ℃10 min（延伸）；4 ℃下保存。
1.3.4琼脂糖凝胶电泳。配制1%的琼脂糖凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果。
2结果与分析
提取组织样品DNA为模板，使用P1和P2引物进行PCR扩增，阳性对照样品出现预期中的1 276 bp大小的PCR产物，待检样品未出现该产物（图1～3）。
3讨论与结论
3.1PCR方法检测的优势
经典的生化鉴定方法是一项较为繁琐的工作，且需要进行大量的活菌操作，由于实验室条件有限，因此笔者采用PCR方法鉴定。该方法具有准确、快速、特异的特点，且不需活菌操作，大大降低了实验室人员感染布病的风险，因而将PCR等分子生物学技术引进到菌种的鉴定，可以进一步提高工作的效率和质量。但是，样品的基因组DNA提取困难及试验过程中的污染等问题会造成PCR检测结果的不稳定，因此样品中基因组DNA提取是保障PCR检测重复性与检测准确度的重要前提，试验操作中需要特别注意。
3.2岩羊与布鲁氏菌病
岩羊是我国的国家二级重点保护野生动物[9]，同时也被世界自然保护联盟（IUCN）收录为需予关注（Least concern）[10]，在我国的生物多样性中占据着重要地位。同时，布鲁氏菌病的易感动物范围很广，目前已知的感染动物包括60多种，其宿主主要包括驯养动物、野生动物、人，其中以羊、牛、猪为主，岩羊极有可能感染该病菌并患病，进而影响到贺兰山地区甚至更大范围内的物种多样性。目前，对国内岩羊中布鲁氏菌病的相关检测数据较少，所以对岩羊中布鲁氏菌病的分布情况有必要进行检测和调查，从而确定是否有必要进行预防。尽管在此次检测中，岩羊中布鲁氏菌病的阳性率为0，但不能说明贺兰山岩羊不携带该病原，因为采集样品的时间、对象、条件、质量、保存等以及试验环境的局限性、具体试验操作中某些人为误差等等因素都有可能造成检出率的降低，因此有必要对岩羊中布鲁氏菌病的分布状况进行持续调查，以获得试验数据作为是否进行防治的依据。
该试验中53份宁夏贺兰山野生岩羊中布鲁氏菌病阳性检出率为0。
参考文献
[1] 尚德秋.布鲁氏菌病的流行动态及分子生物学的研究进展[M]//许龙善.再度肆虐人类的传染病.香港：亚洲医药出版社，1998：42.
[2] PAPPAS G，PANAGOPOULOU P，CHRISTOU L，et al.Brucella as a biological weapon[J].Cell Mol Life Sci，2006，63（19/20）：2229-2236.
[3] 闻玉梅.现代微生物学[M].上海：上海医科大学出版社，1999：455-469.
[4] 吴清民.兽医传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002：187-193.
[5] 张士义，朱岱，江森林.中国布鲁氏菌防治50年回顾[J].中国地方病防治杂志，2003，18（6）：347-350.
[6] 周艳彬.布氏杆菌病的流行、发病原因及防治进展[J].辽宁医学院学报，2010，31（1）：81-85.
[7] 世界动物卫生组织.哺乳动物、禽、蜜蜂 A 和 B 类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].农业部畜牧兽医局，译.北京：中国农业科学技术出版社，2002：308-325.
[8] 李博.布鲁氏菌PCR检测方法的应用于分子分型研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2010：37.
[9] 刘振生.岩羊生态学研究[D].上海：华东师范大学，2006.
[10] HARRIS R B.Pseudois Nayaur[M]//IUCN 2012.IUCN Red List of Threatened Species.Version，2012.
关键词岩羊；布鲁氏菌病；分子生物学；检测
中图分类号S826.8+9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12935-02
Abstract[Objective] The research aimed to understand the distribution situations of brucellosis in blue sheep in some regions of Helan Mountains in Yinchuan of Ningxia. [Method] 53 DNA samples extracted from blue sheep were taken as template to make PCR amplification with P1 and P2 primers. The distribution situations of brucellosis in blue sheep in Helan Mountains were detected. [Result] The positive rate of brucellosis in 53 samples of blue sheep was zero. [Conclusion] The research results showed that no brucellosis was detected in these blue sheep， but it needed to be further studied.
Key wordsBlue sheep； Brucellosis； Molecular biology； Detection and analysis
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体引起的传染-变态反应性的人畜共患的自然疫源性传染病[1-2]，以流产、早产、不孕、不育、胎盘滞留、睾丸炎、关节炎、神经损伤为主要临床症状，可造成人体许多器官损伤，甚至终身丧失劳动力或残疾，迄今为止尚无根治方法[3]。1985年世界卫生组织（WHO）布鲁氏菌病专家委员会将布鲁氏菌病属分为6个种19个生物型[4]，该病在世界各国均有流行，其中以亚洲、南美洲和非洲等地区最为严重。在我国，该病自1905年在重庆被首次报道[5]，至今已有100多年的历史了，近年来该病的发病率逐年快速上升，疫情呈回升趋势，甚至出现局部爆发[6]。该病不仅危害畜牧生产，而且严重损害人类健康，从而造成巨大的经济损失和严重的公共卫生问题，因此受到广泛重视，被世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，同时被《中华人民共和国传染病防治法》列为乙类传染病，同时被《中华人民共和国动物防疫法》列为二类动物疫病[7]。
布鲁氏菌病的诊断和检疫主要依靠血清学检测和细菌学检测，但是由于上述2种检测方法耗时长、影响因素多、检出率低，不利于该病的早期诊断，且存在假阳性反应，因此在此次调查中采用PCR方法鉴定样品是否被布鲁氏菌感染。
1材料与方法
1.1待检样品宁夏贺兰山自然保护区的53份野生岩羊组织样品。
1.2主要试剂生理盐水、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、蛋白酶K、RNase酶、布鲁氏菌病活疫苗（S2株）。
1.3方法
1.3.1引物。
通过查阅相关文献[8]，选取以下引物：
上游引物P1：5’ATG TCT GGC ACA TCA TGG GC3’；
下游引物P2：5’TCA TGG AGC GGG CCT TGA GAT 3’。
引物由上海英俊公司合成。
1.3.2样品DNA的提取。
①组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5 g组织，放入1.5 ml离心管中，剪碎；
②加入0.45 ml TES混匀，再加入50 μl SDS（10%）和5.0 μl蛋白酶K（20 mg/ml），充分混匀后，于56 ℃保温4～6 h，每隔2 h摇动1次；
③放置到室温下，加入等体积饱和酚（500 μl），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min，小心吸取上清液，置于1个新的15 ml离心管；
④加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min后，吸取上清液转移到新的1.5 ml离心管中；
⑤加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，12 000 r/min，离心10 min，取上清液到1个新的15 ml离心管；
⑥加入2.5倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇沉淀DNA；
⑦12 000 r/min，离心10 min，弃掉所有液相；
⑧-20 ℃下保存的75%乙醇洗涤，12 000 r/min，离心5 min，弃去乙醇，干燥DNA；
⑨加入10 μl灭菌去离子水溶解DNA，于-20 ℃下保存，作为模板备用。
1.3.3PCR。
1.3.3.1PCR反应体系。
PCR反应体系由10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上下游引物（20 mmol//L）各1 μl、Taq酶（5 U/μl）0.5 μl、模板DNA 3 μl、去离子水35.5 μl组成。 1.3.3.2PCR反应程序。
95 ℃ 10 min（预变性）；94 ℃ 30 s（变性），55 ℃ 30 s（退火），72 ℃ 1 min（延伸），30个循环；
72 ℃10 min（延伸）；4 ℃下保存。
1.3.4琼脂糖凝胶电泳。配制1%的琼脂糖凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果。
2结果与分析
提取组织样品DNA为模板，使用P1和P2引物进行PCR扩增，阳性对照样品出现预期中的1 276 bp大小的PCR产物，待检样品未出现该产物（图1～3）。
3讨论与结论
3.1PCR方法检测的优势
经典的生化鉴定方法是一项较为繁琐的工作，且需要进行大量的活菌操作，由于实验室条件有限，因此笔者采用PCR方法鉴定。该方法具有准确、快速、特异的特点，且不需活菌操作，大大降低了实验室人员感染布病的风险，因而将PCR等分子生物学技术引进到菌种的鉴定，可以进一步提高工作的效率和质量。但是，样品的基因组DNA提取困难及试验过程中的污染等问题会造成PCR检测结果的不稳定，因此样品中基因组DNA提取是保障PCR检测重复性与检测准确度的重要前提，试验操作中需要特别注意。
3.2岩羊与布鲁氏菌病
岩羊是我国的国家二级重点保护野生动物[9]，同时也被世界自然保护联盟（IUCN）收录为需予关注（Least concern）[10]，在我国的生物多样性中占据着重要地位。同时，布鲁氏菌病的易感动物范围很广，目前已知的感染动物包括60多种，其宿主主要包括驯养动物、野生动物、人，其中以羊、牛、猪为主，岩羊极有可能感染该病菌并患病，进而影响到贺兰山地区甚至更大范围内的物种多样性。目前，对国内岩羊中布鲁氏菌病的相关检测数据较少，所以对岩羊中布鲁氏菌病的分布情况有必要进行检测和调查，从而确定是否有必要进行预防。尽管在此次检测中，岩羊中布鲁氏菌病的阳性率为0，但不能说明贺兰山岩羊不携带该病原，因为采集样品的时间、对象、条件、质量、保存等以及试验环境的局限性、具体试验操作中某些人为误差等等因素都有可能造成检出率的降低，因此有必要对岩羊中布鲁氏菌病的分布状况进行持续调查，以获得试验数据作为是否进行防治的依据。
该试验中53份宁夏贺兰山野生岩羊中布鲁氏菌病阳性检出率为0。
参考文献
[1] 尚德秋.布鲁氏菌病的流行动态及分子生物学的研究进展[M]//许龙善.再度肆虐人类的传染病.香港：亚洲医药出版社，1998：42.
[2] PAPPAS G，PANAGOPOULOU P，CHRISTOU L，et al.Brucella as a biological weapon[J].Cell Mol Life Sci，2006，63（19/20）：2229-2236.
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[5] 张士义，朱岱，江森林.中国布鲁氏菌防治50年回顾[J].中国地方病防治杂志，2003，18（6）：347-350.
[6] 周艳彬.布氏杆菌病的流行、发病原因及防治进展[J].辽宁医学院学报，2010，31（1）：81-85.
[7] 世界动物卫生组织.哺乳动物、禽、蜜蜂 A 和 B 类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].农业部畜牧兽医局，译.北京：中国农业科学技术出版社，2002：308-325.
[8] 李博.布鲁氏菌PCR检测方法的应用于分子分型研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2010：37.
[9] 刘振生.岩羊生态学研究[D].上海：华东师范大学，2006.
[10] HARRIS R B.Pseudois Nayaur[M]//IUCN 2012.IUCN Red List of Threatened Species.Version，2012.