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[中图分类号]R285.5
[文献标识码]B
[文章编号]1005-0019(2009)7-0064-02
作者简介:文正平(1962.11-),女,汉族,湖南常德桃源人,广东省韩山师范学院卫生所,西医,无学位大专学历,研究方向:西医临床。
[摘要]目的:研究了不同类型心脑血管疾病患者体内可溶性细胞间粘附分子-l(sICAM-1,solubleIniercellularahdesinomoleeule-1)、可溶性血管粘附蛋白-l(svAp-1,C反应蛋白(C,表达水平变化以及它们间的相互关系)了解他们与不同类型老年心脑血管疾病的相关性,进一步阐明冠心病、脑梗塞等心、脑血管疾病发病机理,为该疾病的预防、治疗提供更为合理的科学依据。方法:通过ELISA方法分别检测老年冠心病患者(包括稳定性心绞痛组及急性心肌梗塞组,分别简称为心绞痛组及心梗组)、脑梗塞患者及老年健康体检者血清SVAP-1、Sicam-1、CRP水平并进行组间比较,健康体检者为正常对照,每组选21~22例进行研究。结论:(1)以sICAM-1、sVAP-1为代表的细胞粘附分子及粘附蛋白、以CRP为代表的炎症因子在老年心脑血管疾病患者体内均较正常老年人高,说明以上三指标对老年心脑血管疾病的发生、发展可能起促进作用。(2)sICAM-1、svAp-1及CRP三种指标以急性心肌梗塞患者体内水平为最高,稳定性心绞痛患者次之,脑梗塞患者最次,说明三指标表达水平与心脑血管疾病患者缺血程度、炎症坏死的严重程度有一定的关。
[关键词]心脑血管;细胞粘附分子;sICAM-1
1临床病例资料
所有接受研究的心脑血管疾病患者均为2004年2月至2005年5月我院老年病科、心内科、神经内科部分就医老年病人,老年冠心病病例(所有观察对象诊断均符合WHO1979年诊断标准,并经冠脉造影或心电图及心肌酶谱的典型表现证实)分为急性心肌梗塞组(以下简称心梗组)、稳定性心绞痛组(以下简称心绞痛组),老年脑梗塞组,脑梗死患者诊断均符合全国第4届脑血管病会议制订的诊断标准,并均经颅脑CT或MRI检查证实。按按Admas方法,分为:大面积梗死4例,小面积梗死17例,其中心肌梗塞时间平均(6.21)小时,脑梗塞时间平均(6.71)个月,选择老年健康体检者(无冠心病、糖尿病、高血压史、血常规及生化正常)为正常对照组,每组观察对象为20例。临床研究过程中对合并有感染、免疫系统疾病、高血糖、高血脂的心脑血管疾病患者均排除在外。
在标本采集与制备中,按患者入院先后顺序或门诊就诊先后顺序无菌抽取被观察者清晨空腹静脉血2ml,形成血凝块后,2000/rhl离心20m分离血清,保存于-80℃冰箱中集中检测。正常对照组标本为健康者体检时直接采取,标本处理同上。
2方法
人血清sVAP-1、sICAM-1、CRP酶联免疫定量检测,实验时,所有样本常温复融,将所有样本顺序混乱并随机编号,进行相关指标的检测,检测时均设复孔,求其均值作为其水平。
2.1血清sVAP-1测定方法:反应板每孔内包被有鼠抗人单抗,试剂盒内备有Biotin-conjugate抗sVAp-1单克隆抗体、sVAp-1标准品、链合素、洗涤缓冲液、分析缓冲液、底物1、底物2、终止液。
2.1.1建立标准曲线:设标准孔2组16孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。标准品浓度从第一孔到第七孔分别为2、1、0.5、0.25、0125、0.0625、0.0313ong/ml。
2.1.2加样与洗板、测定OD值:300ul工作液洗板2次、甩干加100ul分析缓冲液至标准品孔加100ul分析缓冲液至空白孔加90ul分析缓冲液至样本检测孔~待测样品孔每孔各加入样品10ul加50ulBiot-niocnjugaet至各孔一将反应板置25℃水浴箱120分钟300ul工作液洗板4次、甩干加100ul链合素至各孔将反应板置25℃水浴箱60分钟300ul工作液洗板4次、风干*加100ul底物1、底物2的混和液~将反应板置25℃水浴箱20分钟加100ul终止液一轻轻混匀,即刻在酶标仪上直接测定波长为450nnl处的吸光度值。
2.1.3结果判定:所有标准品和样品的OD值均应以空白对照调零。SVAP-1其浓度及对应的OD值见附表
2.2.1建立标准曲线:设标准孔2组16孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第六孔,最后,从第六孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第七孔为空白对照。标准品浓度从第一孔到第七孔分别为100、50、25、12.5、625、3.13、ong/ml。
加样、洗板、测定OD值300ul工作液洗板2次、甩干加100ul样品稀释液至标准品孔一加100ul样品稀释液至空白孔加100ul样品稀释液至样本检测孔待测样品孔每孔各加入样品100ul加50ulHRp-conjugate至各孔将反应板置25℃水浴箱60分钟~300ul工作液洗板3次、甩干加100ul底物1、底物2的混和液~将反应板置25℃水浴箱10分钟加100ul终止液一轻轻混匀,即刻在酶标仪上直接测定波长为450ul处的吸光度值。 2.3CRP检测：反应板每孔内包被有兔抗人CRP单抗，试剂盒内备有CRP标准品、e洗涤缓冲液、分析缓冲液、底物、终止液。试剂盒内反应板内己有包被好的CRP标准的反应板，A孔至F孔CRP浓度分别为：0、10、30、100、250、500ng/m1。
2.3.1加样、洗板、测定OD值：反应板标记一加标准品、对照物、样本各10ul至相应孔内加200ul分析液至各孔室温孵育30分钟-300ul工作液洗板5次、甩干加300ul工作液洗板5次、甩干加100ul底物液一室温孵育10分钟加I00ul终止液一轻轻混匀，即刻在酶标仪上直接测定波长为450ul处的吸光度值。
2.3.2结果判定：所有标准品和样品的OD值均应以空白对照调零。CRP的值如表所示。
3讨论
本研究结果显示心、脑血管疾病患者体内SICAM-l均有明显的高表达，急性心肌梗塞组SICAM-l平均水平高达549.8nig/ml，显著高于稳定性心绞痛组(422.04ng/nil)、脑梗塞组(383.57n留ml)及正常对照组(30.209ng/ml)；稳定性心绞痛组SICAM-l值高于正常对照组，但较急性心肌梗塞组低，与脑梗塞组间无显著差异；脑梗塞组较正常对照组高，但低于急性心肌梗塞组。临床分析显示：四组人群中以急性心肌梗塞组临床组织缺血、炎症现象最为明显，其SICAM-l表达水平为最高，SICAM-l在心梗组表达最高者1583n岁ml，为稳定性心绞痛患者平均水平的3倍，这与该类患者组织缺血坏死较重有一定的关系。MRL/IP狼疮鼠体内ICAM-1、VCAM-1水平随着小鼠心脏、脑组织损伤加重而增加也说明这一点。有研究显示口服阿斯匹林可抑制不稳定心绞痛患者及正常人体内SICAM-l表达，虽然本组资料中所观察的病例均接受了临床上常用的消心痛及肠溶阿斯匹林等药物的治疗，稳定性心绞痛组患者、脑梗塞患者与正常对照组相比其体内Sciam-1表达水平仍然较高，这可能该类患者已存在有内皮细胞损伤有一定的关系。有研究发现:致死性心肌梗塞患者体内粘附分子的水平又明显高于存活的心肌梗塞患者，更说明冠心病患者病情的严重程度与体内粘附分子水平呈正相关。
因此，临床上我们可根据冠心病患者体内粘附分子水平间接判断缺血性心脏病患者心肌损害的严重程度，对指导临床判断患者的预后、评估组织病变严重的程度有重要的指导价值。在缺血性脑血管疾病变中，KitgaawaK研究发现缺血后脑组织SCIAM-1表达增加并可致使粒细胞向脑血区聚集，随后出现脑组织坏死。另有报道不同梗死面积患者血清Sicam-1浓度比较，大面积梗死灶组第1、3和7日血清sICAM-1浓度均高于小面积梗死灶组；这说明sICAM-1参与了脑缺血后的发病过程，脑缺血后可引发炎症反应，白细胞与血管壁接触，在内皮细胞上滚动，牢固结合及跨内皮细胞转运均需粘附分子的参与；脑缺血一再灌注损伤期间，白细胞在SICAM-1及其配体介导下大量浸润到缺血组织，通过机械阻塞微循环通道和释放毒性物质而导致或加重组织损伤。本研究结果显示脑梗塞组Sicam-1水平明显高于正常对照组同样说明这一点。且大面积梗死患者sICAM-1浓度升高更明显，说明脑缺血后sICAM-1水平增高可加重脑损伤。sCIAM-1虽然与梗死灶大小有关，但与梗死部位无关，故粘附分子不能判断脑缺血的致残性。
[文献标识码]B
[文章编号]1005-0019(2009)7-0064-02
作者简介:文正平(1962.11-),女,汉族,湖南常德桃源人,广东省韩山师范学院卫生所,西医,无学位大专学历,研究方向:西医临床。
[摘要]目的:研究了不同类型心脑血管疾病患者体内可溶性细胞间粘附分子-l(sICAM-1,solubleIniercellularahdesinomoleeule-1)、可溶性血管粘附蛋白-l(svAp-1,C反应蛋白(C,表达水平变化以及它们间的相互关系)了解他们与不同类型老年心脑血管疾病的相关性,进一步阐明冠心病、脑梗塞等心、脑血管疾病发病机理,为该疾病的预防、治疗提供更为合理的科学依据。方法:通过ELISA方法分别检测老年冠心病患者(包括稳定性心绞痛组及急性心肌梗塞组,分别简称为心绞痛组及心梗组)、脑梗塞患者及老年健康体检者血清SVAP-1、Sicam-1、CRP水平并进行组间比较,健康体检者为正常对照,每组选21~22例进行研究。结论:(1)以sICAM-1、sVAP-1为代表的细胞粘附分子及粘附蛋白、以CRP为代表的炎症因子在老年心脑血管疾病患者体内均较正常老年人高,说明以上三指标对老年心脑血管疾病的发生、发展可能起促进作用。(2)sICAM-1、svAp-1及CRP三种指标以急性心肌梗塞患者体内水平为最高,稳定性心绞痛患者次之,脑梗塞患者最次,说明三指标表达水平与心脑血管疾病患者缺血程度、炎症坏死的严重程度有一定的关。
[关键词]心脑血管;细胞粘附分子;sICAM-1
1临床病例资料
所有接受研究的心脑血管疾病患者均为2004年2月至2005年5月我院老年病科、心内科、神经内科部分就医老年病人,老年冠心病病例(所有观察对象诊断均符合WHO1979年诊断标准,并经冠脉造影或心电图及心肌酶谱的典型表现证实)分为急性心肌梗塞组(以下简称心梗组)、稳定性心绞痛组(以下简称心绞痛组),老年脑梗塞组,脑梗死患者诊断均符合全国第4届脑血管病会议制订的诊断标准,并均经颅脑CT或MRI检查证实。按按Admas方法,分为:大面积梗死4例,小面积梗死17例,其中心肌梗塞时间平均(6.21)小时,脑梗塞时间平均(6.71)个月,选择老年健康体检者(无冠心病、糖尿病、高血压史、血常规及生化正常)为正常对照组,每组观察对象为20例。临床研究过程中对合并有感染、免疫系统疾病、高血糖、高血脂的心脑血管疾病患者均排除在外。
在标本采集与制备中,按患者入院先后顺序或门诊就诊先后顺序无菌抽取被观察者清晨空腹静脉血2ml,形成血凝块后,2000/rhl离心20m分离血清,保存于-80℃冰箱中集中检测。正常对照组标本为健康者体检时直接采取,标本处理同上。
2方法
人血清sVAP-1、sICAM-1、CRP酶联免疫定量检测,实验时,所有样本常温复融,将所有样本顺序混乱并随机编号,进行相关指标的检测,检测时均设复孔,求其均值作为其水平。
2.1血清sVAP-1测定方法:反应板每孔内包被有鼠抗人单抗,试剂盒内备有Biotin-conjugate抗sVAp-1单克隆抗体、sVAp-1标准品、链合素、洗涤缓冲液、分析缓冲液、底物1、底物2、终止液。
2.1.1建立标准曲线:设标准孔2组16孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。标准品浓度从第一孔到第七孔分别为2、1、0.5、0.25、0125、0.0625、0.0313ong/ml。
2.1.2加样与洗板、测定OD值:300ul工作液洗板2次、甩干加100ul分析缓冲液至标准品孔加100ul分析缓冲液至空白孔加90ul分析缓冲液至样本检测孔~待测样品孔每孔各加入样品10ul加50ulBiot-niocnjugaet至各孔一将反应板置25℃水浴箱120分钟300ul工作液洗板4次、甩干加100ul链合素至各孔将反应板置25℃水浴箱60分钟300ul工作液洗板4次、风干*加100ul底物1、底物2的混和液~将反应板置25℃水浴箱20分钟加100ul终止液一轻轻混匀,即刻在酶标仪上直接测定波长为450nnl处的吸光度值。
2.1.3结果判定:所有标准品和样品的OD值均应以空白对照调零。SVAP-1其浓度及对应的OD值见附表
2.2.1建立标准曲线:设标准孔2组16孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第六孔,最后,从第六孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第七孔为空白对照。标准品浓度从第一孔到第七孔分别为100、50、25、12.5、625、3.13、ong/ml。
加样、洗板、测定OD值300ul工作液洗板2次、甩干加100ul样品稀释液至标准品孔一加100ul样品稀释液至空白孔加100ul样品稀释液至样本检测孔待测样品孔每孔各加入样品100ul加50ulHRp-conjugate至各孔将反应板置25℃水浴箱60分钟~300ul工作液洗板3次、甩干加100ul底物1、底物2的混和液~将反应板置25℃水浴箱10分钟加100ul终止液一轻轻混匀,即刻在酶标仪上直接测定波长为450ul处的吸光度值。 2.3CRP检测：反应板每孔内包被有兔抗人CRP单抗，试剂盒内备有CRP标准品、e洗涤缓冲液、分析缓冲液、底物、终止液。试剂盒内反应板内己有包被好的CRP标准的反应板，A孔至F孔CRP浓度分别为：0、10、30、100、250、500ng/m1。
2.3.1加样、洗板、测定OD值：反应板标记一加标准品、对照物、样本各10ul至相应孔内加200ul分析液至各孔室温孵育30分钟-300ul工作液洗板5次、甩干加300ul工作液洗板5次、甩干加100ul底物液一室温孵育10分钟加I00ul终止液一轻轻混匀，即刻在酶标仪上直接测定波长为450ul处的吸光度值。
2.3.2结果判定：所有标准品和样品的OD值均应以空白对照调零。CRP的值如表所示。
3讨论
本研究结果显示心、脑血管疾病患者体内SICAM-l均有明显的高表达，急性心肌梗塞组SICAM-l平均水平高达549.8nig/ml，显著高于稳定性心绞痛组(422.04ng/nil)、脑梗塞组(383.57n留ml)及正常对照组(30.209ng/ml)；稳定性心绞痛组SICAM-l值高于正常对照组，但较急性心肌梗塞组低，与脑梗塞组间无显著差异；脑梗塞组较正常对照组高，但低于急性心肌梗塞组。临床分析显示：四组人群中以急性心肌梗塞组临床组织缺血、炎症现象最为明显，其SICAM-l表达水平为最高，SICAM-l在心梗组表达最高者1583n岁ml，为稳定性心绞痛患者平均水平的3倍，这与该类患者组织缺血坏死较重有一定的关系。MRL/IP狼疮鼠体内ICAM-1、VCAM-1水平随着小鼠心脏、脑组织损伤加重而增加也说明这一点。有研究显示口服阿斯匹林可抑制不稳定心绞痛患者及正常人体内SICAM-l表达，虽然本组资料中所观察的病例均接受了临床上常用的消心痛及肠溶阿斯匹林等药物的治疗，稳定性心绞痛组患者、脑梗塞患者与正常对照组相比其体内Sciam-1表达水平仍然较高，这可能该类患者已存在有内皮细胞损伤有一定的关系。有研究发现:致死性心肌梗塞患者体内粘附分子的水平又明显高于存活的心肌梗塞患者，更说明冠心病患者病情的严重程度与体内粘附分子水平呈正相关。
因此，临床上我们可根据冠心病患者体内粘附分子水平间接判断缺血性心脏病患者心肌损害的严重程度，对指导临床判断患者的预后、评估组织病变严重的程度有重要的指导价值。在缺血性脑血管疾病变中，KitgaawaK研究发现缺血后脑组织SCIAM-1表达增加并可致使粒细胞向脑血区聚集，随后出现脑组织坏死。另有报道不同梗死面积患者血清Sicam-1浓度比较，大面积梗死灶组第1、3和7日血清sICAM-1浓度均高于小面积梗死灶组；这说明sICAM-1参与了脑缺血后的发病过程，脑缺血后可引发炎症反应，白细胞与血管壁接触，在内皮细胞上滚动，牢固结合及跨内皮细胞转运均需粘附分子的参与；脑缺血一再灌注损伤期间，白细胞在SICAM-1及其配体介导下大量浸润到缺血组织，通过机械阻塞微循环通道和释放毒性物质而导致或加重组织损伤。本研究结果显示脑梗塞组Sicam-1水平明显高于正常对照组同样说明这一点。且大面积梗死患者sICAM-1浓度升高更明显，说明脑缺血后sICAM-1水平增高可加重脑损伤。sCIAM-1虽然与梗死灶大小有关，但与梗死部位无关，故粘附分子不能判断脑缺血的致残性。