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摘要：在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，小胶质细胞是最主要的炎症效应细胞，与脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）后脑内神经炎症密切相关。CIRI可诱导小胶质活化，并产生表型的变化，一方面具有神经保护和组织修复的作用，但另一方面，当小胶质细胞被过度激活时，则具有损伤组织和神经毒害的作用。CIRI发生后，在大脑不同的区域，小胶质细胞可表达不同的蛋白质，显示不同的形态，并根据损伤程度的不同作出不同的反应。对CIRI后小胶质细胞异常活化的生物标志物研究进行了梳理，以期为深入了解小胶质细胞在CIRI病理过程中的作用及以小胶质细胞为作用靶点的药物研究提供理论依据。
关键词：缺血/再灌注损伤；小胶质细胞；生物标志物
中图分类号：R7433文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）07-0085-03
小胶质细胞作为CNS的第一道免疫防线，广泛的分布在CNS，其大约占CNS中脑细胞数的10%[1，2]。在静息状态下，小胶质细胞呈分枝状，穿梭于脑实质，监测CNS细胞微环境变化[3]，控制着神经突触的数量，及时的清除健康成人大脑中的坏死细胞碎片，维持CNS的动态平衡[4]。因此，静止的小胶质细胞不是简单的“静息”状态，而是不断地改变表型和功能从而监测和准备应对周围环境的各种刺激。目前，已有大量的研究证实，小胶质细胞参与了脑缺血性卒中的病理过程，最近的研究表明，多功能的小胶质细胞数量在脑卒中同侧大脑半球明显增加，而在对侧大脑半球仍然处于基础水平[5]，小胶质细胞的激活和增殖显著增加了脑梗死面积和凋亡细胞数，提示小胶质细胞在脑缺血中扮演着关键的角色，且对疾病的发展及转归具有重要的影响。
1小胶质细胞在缺血性卒中CIRI病理过程中的双重角色
脑缺血性卒中发生后，由于血栓自溶或超过时间窗的溶栓药的使用，可进一步造成脑缺血/再灌注损伤（CIRI），CIRI是一个由多种细胞参与的、复杂的病理学过程[6]。在此过程中，小胶质细胞发生活化，其通过结构、表型及功能的变化，在神经损伤及组织修复过程中发挥了双重的作用[7]。CIRI后小胶质细胞可被迅速激活，细胞形态可改变为典型激活型M1型，也会转变为选择性激活型M2型。M2型的小胶质细胞被视为“修复细胞”，有助于修复受损组织并分泌抗炎介质如：[HJ2.2mm]白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10），IL-4，IL-13，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），胰岛素生长因子-1（insulin growth factor-1，IGF-1）以及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等营养因子，这些生长因子或者营养因子有助于增加神经细胞对伤害性刺激的耐受性及促进血管新生和发挥神经保护的作用[8-11]。而M1型被认为可以促进炎症反应，可以产生各种炎症介质如肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-α），IL-1β，和干扰素-β（interferon-β，IFN-β）[12，13]。此外，与M2小胶质细胞相比，M1型更傾向于诱导神经细胞死亡[14]。因此，一直以来抑制M1型被广大研究者认为是脑缺血模型的合理治疗策略。近年来普遍研究发现M2型向M1型的转变会加重病情，而通过细胞因子或药物作用逆转小胶质细胞的亚型分布[15，16]，即诱导M1型向M2型转换从而发挥其拮抗炎症和神经保护作用是近年来研究的热点。
2CIRI后小胶质细胞的表型变化及其生物标志物
脑缺血后随着时间的推移，小胶质细胞可表现出动态的极化现象，主要从短暂的M2型向M1型转化。研究表明在缺血24 h后，M2型小胶质细胞呈现高表达，提示在缺血早期小胶质细胞参与组织修复。在缺血2-7天后，小胶质细胞逐渐从M2型转变为M1型，提示小胶质细胞促进炎症反应加重脑损伤。缺血后数周内，主要以M1型小胶质细胞为主，进一步加重神经炎症损伤[17]。这表明，小胶质细胞在脑缺血中的动态反应表现为，早期主要以“抗炎”M2型为主，随后向“促炎”型M1型转变。如果抑制M2型向M1型表型的变化，或者，诱导M1型向M2型转化，提高M2型在缺血区的比例，那么将对减轻神经炎症从而发挥脑保护作用带来有利的影响。
由于小胶质细胞形态和功能都与巨噬细胞极其相似，因此目前尚没有一个特异性标记物用来标记小胶质细胞，导致难以将其与渗透受损脑组织骨髓来源的巨噬细胞区分开[2]。利用流式细胞检测小胶质细胞表面CD45/CD11b水平的技术得到广泛运用，小胶质细胞表面为CD45 伴CD11b 的低表达，而浸润细胞表面则是CD45 伴CD11b高表达，但CD45/CD11b依然不能成为小胶质细胞完全特异标志物。由于小胶质细胞和巨噬细胞均来源于原始髓系细胞，因此一些指标如CD11b、F4/80，Iba-1是相同的，虽然活化的小胶质细胞不同表型表达特异性的细胞表面蛋白，但因为与巨噬细胞存在很多相似性，所以每一种表型的特异性标记物仍然没有确定[2，18]。到目前为止，只有少量几个标记物被确定为活化的M1型和M2型小胶质细胞，如CD68、CD86、CD16/32、iNOS为M1型常见生物标志物，而CD206、Arg1、CD163、TGF-β等为M2型常见生物标志物。
3小胶质细胞在脑缺血中心区及半暗带活化的差异
CIRI后小胶质细胞被激活，其形态也迅速发生变化。在缺血中心区小胶质细胞表现为阿米巴样；而在半暗带的小胶质细胞则表现为分支状，其突起较静息小胶质细胞更粗更短。Morrison[19]等人发现缺血1 h再灌注24 h以后，CD11b在缺血中心区的表达增加，表明小胶质细胞在该区域被激活，而在半暗带，小胶质细胞仍呈静息的分枝状态，随着时间的延长，阿米巴状小胶质细胞在半暗带逐渐增多，72 h后达到高峰。 缺血24 h后，M2表型标记物Ym-1和CD206只发现在缺血核心区，提示小胶质细胞在缺血中心区参与组织修复[20]。通过检测缺血24 h后在缺血中心区CD206的表达，发现CD206的表达在缺血后5天达到峰值，14天后降低[14]。随着时间的延长，小胶质细胞逐渐从M2型转变为M1型，并从缺血中心区扩展到半暗带。M1型小胶质细胞的标记物，在缺血中心区CD16/32、iNOS的表达在损伤3 d后开始增加，14 d达到高峰，并一直居高不下。这表明，在缺血早期，小胶质细胞在缺血中心区主要以M2型为主发挥脑保护作用。随后主要以M1型小胶质细胞为主，加重神经炎症损伤。
虽然这些研究是有限的，因为他们没有区分小胶质细胞和浸润的巨噬细胞，但是小胶质细胞表型的动态变化和位置是至关重要的。因此，深入研究小胶质细胞不同活化表型在时间和空间的动态变化，将为CIRI的临床治疗提供新思路。
4小结与展望
综上所述，小胶质细胞是首先对脑缺血损伤作出反应的细胞，活化的小胶质细胞在脑缺血中扮演着双刃剑的角色。目前，虽然一些抗炎治疗的试验在治疗急性缺血性中风的动物模型中已被證明是有效的，但令人失望的是它们在临床试验中是无效的。越来越多的证据表明，活化的小胶质细胞具有不同的功能，小胶质细胞可作为缺血性脑卒中有力的细胞靶点，操控小胶质细胞有可能成为治疗神经疾病的有效途径。这也表明脑缺血后针对小胶质细胞的治疗方向更应该权衡其损害与保护作用，而不是单纯的抑制小胶质细胞活化。进一步的研究应该考虑小胶质细胞抗炎和促炎反应，提高我们对小胶质细胞促炎和抗炎反应之间的动态平衡的理解，从而确定临床前研究和临床试验之间的差异以便提供更有效的治疗方案。
参考文献：
[1]Davalos D，Grutzendler J，Yang G，et alATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo[J].Nat Neurosci2005，8（6）：752-758
[2]Tambuyzer B R，Ponsaerts P，Nouwen E JMicroglia：gatekeepers of central nervous system immunology[J].2009，85（3）：352-370
[3]Nimmerjahn A，Kirchhoff F，Helmchen FResting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo[J].Science2005，308（5726）：1314-1318
[4]Eyo U B，Dailey M EMicroglia：key elements in neural development，
plasticity，and pathology[J].J Neuroimmune Pharmacol2013，8（3）：494-509
[5]Campanella M，Sciorati C，Tarozzo G，et alFlow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain[J].Stroke2002，33（2）：586-592
[6]Denes A，Ferenczi S，Kovacs K JSystemic inflammatory challenges compromise survival after experimental stroke via augmenting brain inflammation，blood-brain barrier damage and brain oedema independently of infarct size[J].J Neuroinflammation2011，8：164
[7]Imai F，Suzuki H，Oda J，et alNeuroprotective effect of exogenous microglia in global brain ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab2007，27（3）：488-500
[8]Ponomarev E D，Veremeyko T，Weiner H LMicroRNAs are universal regulators of differentiation，activation，and polarization of microglia and macrophages in normal and diseased CNS[J].2013，61（1）：91-103
[9]Liu H，Zheng M，Du Y，et alN9 microglial cells polarized by LPS and IL4 show differential responses to secondary environmental stimuli[J].Cellular Immunology2012，278（1–2）：84-90
[10]Shin W H，Lee D Y，Park K W，et alMicroglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo[J].Glia2004，46（2）：142-152
[11]Zhou X，Spittau B，Krieglstein KTGFβ signalling plays an important role in IL4-induced alternative activation of microglia[J].Journal of Neuroinflammation2012，9（1）：210 [12]Liu J，Bartels M，Lu A，et alMicroglia/macrophages proliferate in striatum and neocortex but not in hippocampus after brief global ischemia that produces ischemic tolerance in gerbil brain[J].J Cereb Blood Flow Metab2001，21（4）：361-373
[13]Weinstein J R，Koerner I P，M Ller TMicroglia in ischemic brain injury[J].2010，5（2）：227-246
[14]Hu X，Li P，Guo Y，et alMicroglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia[J].Stroke；a journal of cerebral circulation2012，43（11）：3063-3070
[15]Austin S A，Floden A M，Murphy E J，et alAlpha-synuclein expression modulates microglial activation phenotype[J].J Neurosci2006，26（41）：10558-10563
[16]Zhang H，Li Y，Yu J，et alRho kinase inhibitor fasudil regulates microglia polarization and function[J].Neuroimmunomodulation2013，20（6）：313-322
[17]Kigerl K A，Gensel J C，Ankeny D P，et alIdentification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord[J].J Neurosci2009，29（43）：13435-13444
[18]Ginhoux F，Greter M，Leboeuf M，et alFate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages[J].Science2010，330（6005）：841-845
[19]Okun E，Griffioen K J，Lathia J D，et alToll-like receptors in neurodegeneration[J].Brain Research Reviews2009，59（2）：278-292
[20]Morrison H W，Filosa J AA quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion[J].J Neuroinflammation2013，10：4
关键词：缺血/再灌注损伤；小胶质细胞；生物标志物
中图分类号：R7433文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）07-0085-03
小胶质细胞作为CNS的第一道免疫防线，广泛的分布在CNS，其大约占CNS中脑细胞数的10%[1，2]。在静息状态下，小胶质细胞呈分枝状，穿梭于脑实质，监测CNS细胞微环境变化[3]，控制着神经突触的数量，及时的清除健康成人大脑中的坏死细胞碎片，维持CNS的动态平衡[4]。因此，静止的小胶质细胞不是简单的“静息”状态，而是不断地改变表型和功能从而监测和准备应对周围环境的各种刺激。目前，已有大量的研究证实，小胶质细胞参与了脑缺血性卒中的病理过程，最近的研究表明，多功能的小胶质细胞数量在脑卒中同侧大脑半球明显增加，而在对侧大脑半球仍然处于基础水平[5]，小胶质细胞的激活和增殖显著增加了脑梗死面积和凋亡细胞数，提示小胶质细胞在脑缺血中扮演着关键的角色，且对疾病的发展及转归具有重要的影响。
1小胶质细胞在缺血性卒中CIRI病理过程中的双重角色
脑缺血性卒中发生后，由于血栓自溶或超过时间窗的溶栓药的使用，可进一步造成脑缺血/再灌注损伤（CIRI），CIRI是一个由多种细胞参与的、复杂的病理学过程[6]。在此过程中，小胶质细胞发生活化，其通过结构、表型及功能的变化，在神经损伤及组织修复过程中发挥了双重的作用[7]。CIRI后小胶质细胞可被迅速激活，细胞形态可改变为典型激活型M1型，也会转变为选择性激活型M2型。M2型的小胶质细胞被视为“修复细胞”，有助于修复受损组织并分泌抗炎介质如：[HJ2.2mm]白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10），IL-4，IL-13，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），胰岛素生长因子-1（insulin growth factor-1，IGF-1）以及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等营养因子，这些生长因子或者营养因子有助于增加神经细胞对伤害性刺激的耐受性及促进血管新生和发挥神经保护的作用[8-11]。而M1型被认为可以促进炎症反应，可以产生各种炎症介质如肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-α），IL-1β，和干扰素-β（interferon-β，IFN-β）[12，13]。此外，与M2小胶质细胞相比，M1型更傾向于诱导神经细胞死亡[14]。因此，一直以来抑制M1型被广大研究者认为是脑缺血模型的合理治疗策略。近年来普遍研究发现M2型向M1型的转变会加重病情，而通过细胞因子或药物作用逆转小胶质细胞的亚型分布[15，16]，即诱导M1型向M2型转换从而发挥其拮抗炎症和神经保护作用是近年来研究的热点。
2CIRI后小胶质细胞的表型变化及其生物标志物
脑缺血后随着时间的推移，小胶质细胞可表现出动态的极化现象，主要从短暂的M2型向M1型转化。研究表明在缺血24 h后，M2型小胶质细胞呈现高表达，提示在缺血早期小胶质细胞参与组织修复。在缺血2-7天后，小胶质细胞逐渐从M2型转变为M1型，提示小胶质细胞促进炎症反应加重脑损伤。缺血后数周内，主要以M1型小胶质细胞为主，进一步加重神经炎症损伤[17]。这表明，小胶质细胞在脑缺血中的动态反应表现为，早期主要以“抗炎”M2型为主，随后向“促炎”型M1型转变。如果抑制M2型向M1型表型的变化，或者，诱导M1型向M2型转化，提高M2型在缺血区的比例，那么将对减轻神经炎症从而发挥脑保护作用带来有利的影响。
由于小胶质细胞形态和功能都与巨噬细胞极其相似，因此目前尚没有一个特异性标记物用来标记小胶质细胞，导致难以将其与渗透受损脑组织骨髓来源的巨噬细胞区分开[2]。利用流式细胞检测小胶质细胞表面CD45/CD11b水平的技术得到广泛运用，小胶质细胞表面为CD45 伴CD11b 的低表达，而浸润细胞表面则是CD45 伴CD11b高表达，但CD45/CD11b依然不能成为小胶质细胞完全特异标志物。由于小胶质细胞和巨噬细胞均来源于原始髓系细胞，因此一些指标如CD11b、F4/80，Iba-1是相同的，虽然活化的小胶质细胞不同表型表达特异性的细胞表面蛋白，但因为与巨噬细胞存在很多相似性，所以每一种表型的特异性标记物仍然没有确定[2，18]。到目前为止，只有少量几个标记物被确定为活化的M1型和M2型小胶质细胞，如CD68、CD86、CD16/32、iNOS为M1型常见生物标志物，而CD206、Arg1、CD163、TGF-β等为M2型常见生物标志物。
3小胶质细胞在脑缺血中心区及半暗带活化的差异
CIRI后小胶质细胞被激活，其形态也迅速发生变化。在缺血中心区小胶质细胞表现为阿米巴样；而在半暗带的小胶质细胞则表现为分支状，其突起较静息小胶质细胞更粗更短。Morrison[19]等人发现缺血1 h再灌注24 h以后，CD11b在缺血中心区的表达增加，表明小胶质细胞在该区域被激活，而在半暗带，小胶质细胞仍呈静息的分枝状态，随着时间的延长，阿米巴状小胶质细胞在半暗带逐渐增多，72 h后达到高峰。 缺血24 h后，M2表型标记物Ym-1和CD206只发现在缺血核心区，提示小胶质细胞在缺血中心区参与组织修复[20]。通过检测缺血24 h后在缺血中心区CD206的表达，发现CD206的表达在缺血后5天达到峰值，14天后降低[14]。随着时间的延长，小胶质细胞逐渐从M2型转变为M1型，并从缺血中心区扩展到半暗带。M1型小胶质细胞的标记物，在缺血中心区CD16/32、iNOS的表达在损伤3 d后开始增加，14 d达到高峰，并一直居高不下。这表明，在缺血早期，小胶质细胞在缺血中心区主要以M2型为主发挥脑保护作用。随后主要以M1型小胶质细胞为主，加重神经炎症损伤。
虽然这些研究是有限的，因为他们没有区分小胶质细胞和浸润的巨噬细胞，但是小胶质细胞表型的动态变化和位置是至关重要的。因此，深入研究小胶质细胞不同活化表型在时间和空间的动态变化，将为CIRI的临床治疗提供新思路。
4小结与展望
综上所述，小胶质细胞是首先对脑缺血损伤作出反应的细胞，活化的小胶质细胞在脑缺血中扮演着双刃剑的角色。目前，虽然一些抗炎治疗的试验在治疗急性缺血性中风的动物模型中已被證明是有效的，但令人失望的是它们在临床试验中是无效的。越来越多的证据表明，活化的小胶质细胞具有不同的功能，小胶质细胞可作为缺血性脑卒中有力的细胞靶点，操控小胶质细胞有可能成为治疗神经疾病的有效途径。这也表明脑缺血后针对小胶质细胞的治疗方向更应该权衡其损害与保护作用，而不是单纯的抑制小胶质细胞活化。进一步的研究应该考虑小胶质细胞抗炎和促炎反应，提高我们对小胶质细胞促炎和抗炎反应之间的动态平衡的理解，从而确定临床前研究和临床试验之间的差异以便提供更有效的治疗方案。
参考文献：
[1]Davalos D，Grutzendler J，Yang G，et alATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo[J].Nat Neurosci2005，8（6）：752-758
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[16]Zhang H，Li Y，Yu J，et alRho kinase inhibitor fasudil regulates microglia polarization and function[J].Neuroimmunomodulation2013，20（6）：313-322
[17]Kigerl K A，Gensel J C，Ankeny D P，et alIdentification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord[J].J Neurosci2009，29（43）：13435-13444
[18]Ginhoux F，Greter M，Leboeuf M，et alFate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages[J].Science2010，330（6005）：841-845
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[20]Morrison H W，Filosa J AA quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion[J].J Neuroinflammation2013，10：4