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摘要：目的：研究幽門螺杆菌对左氧氟沙星耐药情况。方法：选取行胃镜检查患者的幽门螺杆菌株26株作为本次研究的样本，26株标准株为质控对照菌株，作耐药试验。结果：左氧氟沙星的耐药率为3.84%，对甲硝唑耐药为18株，克拉霉素耐药2株，其中双重耐药为1株，有1株（3.84%）敏感株。行体外选择耐药试验中5株选择分离出耐药菌株，均属于低耐药（≤4μg/ml）。选择分离成功的菌株，试验前敏感菌株被核酸内切酶酶切，试验后耐药菌朱没有被酶切。临床菌株的敏感菌株均被核酸内切酶酶切，耐药菌株中3株未被酶切，2株被酶切。5株临床耐药株中有4株为91位密码子突变。结论：幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率较低，左氧氟沙星是根除幽门螺杆菌较好的药物之一。gyrA基因QRDR中编码91位的Asp密码子突变在左氧氟沙星的耐药机制中十分关键。
关键词：幽门螺杆菌；左氧氟沙星；抗药性；DNA
临床中对根除幽门螺杆菌的抗生素药物不在少数，但幽门螺杆菌的耐药性强，找寻一种可以根除幽门螺杆菌的抗生素十分必要。左氧氟沙星近年来在临床上对抗、根除幽门螺杆菌较为常用，是一种很好的根除药物，但是幽门螺杆菌对喹诺酮类的药物有耐药性，因此需要鉴定幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率[31。本次针对幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率做出研究，并分析其耐药机制。具体报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
选取某院行胃镜检查患者的幽门螺杆菌株26株作为本次研究的样本，再选取26株幽门螺杆（标准）菌株，由上海北诺生物科技有限公司提供，作为质控对照菌株。选取2株标准株、6株样本株作左氧氟沙星体外耐药试验。选取体外选择耐药试验中分离成功的左氧氟沙星菌株，再选取5对耐药和敏感菌株作为耐药研究样本。
幽门螺杆菌基因组DNA采用UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽屉试剂盒，由上海北诺生物科技有限公司提供，提取出幽门螺杆菌DNA。
1.2方法
在浓度成倍增加的抗生素平板上选择耐药试验，最初抗生素浓度为1/2 MIC，将幽门螺杆菌接种至浓度为前一次2倍的抗生素平板中，重复上述步骤，直到幽门螺杆菌停止生长或选择分理处耐药菌株为止。
聚合酶连反应和核酸内切酶限制性片段长度多态性试验方法：使用错配引物（由上海北诺生物科技有限公司提供）人工将核酸内切酶限制性内切酶位点引入PCR产物，以正义引物和反义引物特异扩增包含编码91位氨基酸密码子的gyrA基因中喹诺酮耐药决定区域片段240bp，扩增的幽门螺杆菌左氧氟沙星敏感菌株的240bp片段中原没有核酸内切酶的切位点，反义引物中标注下划线的碱基为错配核苷酸，在敏感菌株的240bpPCR扩增片段中引入一个核酸内切酶限制性内切酶切位点。以核酸内切酶性酶切鉴别出91为密码子是否存有突变。
1.3评价指标
采用琼脂稀释法监测，左氧氟沙星和克拉霉素的最低抑菌浓度（MIC）>2μg/ml为耐药，甲硝唑MIC>8μg/ml为耐药。
2 结果
2.1幽门螺杆菌耐药监测结果
左氧氟沙星的耐药率为3.84%，其中幽门螺杆菌对甲硝唑耐药较多，为18株，克拉霉素耐药2株，其中双重耐药为1株，有1株（3.84%）敏感株。具体数据如表1所示。
2.2幽门螺旋杆菌左氧氟沙星体外选择耐药结果
行体外选择耐药试验的8株菌株中有5株选择分理处耐药菌株，但分离菌株的MIC较小，属于低耐药（≤4μg/ml）。3株为临床株，2株为标准株。
2.3聚合酶连反应和核酸内切酶限制性片段长度多态性试验结果
体外选择耐药实验中选择分离成功的菌株，试验前敏感菌株被核酸内切酶酶切，试验后耐药菌朱没有被酶切。临床菌株的敏感菌株均被核酸内切酶酶切，耐药菌株中3株未被酶切，2株被酶切。5株耐药菌株中，一株选择前MIC为1μg/ml，处于临界值，所以没有被入选到此项试验中。其余4株体外人工选择分离出的耐药菌株均为gyrA基因QRDR中编码为Asp91的密码子突变，5株临床耐药株中有4株为91为密码子突变。
3 讨论
左氧氟沙星是一种氟喹诺酮类药物，是氧氟沙星的左旋体，体外抗菌活性高出氧氟沙星。左氧氟沙星是目前临床中根除幽门螺杆菌的有效抗生素药物之一[2]。在国外研究中，临床中应用左氧氟沙星对抗幽门螺杆菌根除率已经能够达到90%。国内学者临床试验研究中根除率也达到了89.5%。以往对幽门螺杆菌的治疗不够彻底，主要是由于幽门螺杆菌具有耐药性[3]。本次研究中的26株菌株中仅有1株对左氧氟沙星耐药，属于耐药性较低。左氧氟沙星的副作用小，依附性较高，临床中应该多推广使用左氧氟沙星药物对抗幽门螺杆菌。
在本次研究中，26株试验菌株对甲硝唑的耐药性较强，有18株，也会对克拉霉素产生耐药性，其中有1株对甲硝唑和克拉霉素同时产生耐药性，并且有1株敏感株。其中，双重耐药是影响治疗幽门螺杆菌的主要因素，常见的幽门螺杆菌双重耐药就是甲硝唑和克拉霉素，本次研究中虽然仅有1株是双重耐药，但这株对左氧氟沙星敏感，治疗失败后会出现继发性的双重耐药。在以往的研究中，幽门螺杆菌会出现甲硝唑耐药，在治疗失败后，出现对甲硝唑敏感，继而发生继发性甲硝唑耐药。而Buckley的研究中显示，含有质子泵抑制剂的三联疗法在失败后，开始对克拉霉素敏感的幽门螺杆菌会变成耐药菌株。以往临床中使用甲硝唑和克拉霉素来治疗根除幽门螺杆菌，但治疗失败后出现的双重耐药对患者影响较大，此时使用左氧氟沙星治疗是一种很好的选择。
在本次研究中主要针对幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药性进行了探讨，幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药机制分析为应该是由于药物靶酶——DNA促旋酶的基因突变进而将氨基酸改变所导致，本次研究中的91位Asp的密码子突变在耐药机制中很重要，引入核酸内切酶切位点的方法能够检测出左氧氟沙星的耐药菌株，这种方法十分简单且快速，对耐药的检测很有效。
参考文献：
[1]王松松.青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析[D].青岛：青岛大学，2013.
[2]吴李培，宣世海.幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药的研究进展[J].世界华人消化杂志，2014，05（02）：197-202.
[3]王松松，苏艳华，战淑慧，等.青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2013，03（05）：428-430.
关键词：幽门螺杆菌；左氧氟沙星；抗药性；DNA
临床中对根除幽门螺杆菌的抗生素药物不在少数，但幽门螺杆菌的耐药性强，找寻一种可以根除幽门螺杆菌的抗生素十分必要。左氧氟沙星近年来在临床上对抗、根除幽门螺杆菌较为常用，是一种很好的根除药物，但是幽门螺杆菌对喹诺酮类的药物有耐药性，因此需要鉴定幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率[31。本次针对幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药率做出研究，并分析其耐药机制。具体报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
选取某院行胃镜检查患者的幽门螺杆菌株26株作为本次研究的样本，再选取26株幽门螺杆（标准）菌株，由上海北诺生物科技有限公司提供，作为质控对照菌株。选取2株标准株、6株样本株作左氧氟沙星体外耐药试验。选取体外选择耐药试验中分离成功的左氧氟沙星菌株，再选取5对耐药和敏感菌株作为耐药研究样本。
幽门螺杆菌基因组DNA采用UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽屉试剂盒，由上海北诺生物科技有限公司提供，提取出幽门螺杆菌DNA。
1.2方法
在浓度成倍增加的抗生素平板上选择耐药试验，最初抗生素浓度为1/2 MIC，将幽门螺杆菌接种至浓度为前一次2倍的抗生素平板中，重复上述步骤，直到幽门螺杆菌停止生长或选择分理处耐药菌株为止。
聚合酶连反应和核酸内切酶限制性片段长度多态性试验方法：使用错配引物（由上海北诺生物科技有限公司提供）人工将核酸内切酶限制性内切酶位点引入PCR产物，以正义引物和反义引物特异扩增包含编码91位氨基酸密码子的gyrA基因中喹诺酮耐药决定区域片段240bp，扩增的幽门螺杆菌左氧氟沙星敏感菌株的240bp片段中原没有核酸内切酶的切位点，反义引物中标注下划线的碱基为错配核苷酸，在敏感菌株的240bpPCR扩增片段中引入一个核酸内切酶限制性内切酶切位点。以核酸内切酶性酶切鉴别出91为密码子是否存有突变。
1.3评价指标
采用琼脂稀释法监测，左氧氟沙星和克拉霉素的最低抑菌浓度（MIC）>2μg/ml为耐药，甲硝唑MIC>8μg/ml为耐药。
2 结果
2.1幽门螺杆菌耐药监测结果
左氧氟沙星的耐药率为3.84%，其中幽门螺杆菌对甲硝唑耐药较多，为18株，克拉霉素耐药2株，其中双重耐药为1株，有1株（3.84%）敏感株。具体数据如表1所示。
2.2幽门螺旋杆菌左氧氟沙星体外选择耐药结果
行体外选择耐药试验的8株菌株中有5株选择分理处耐药菌株，但分离菌株的MIC较小，属于低耐药（≤4μg/ml）。3株为临床株，2株为标准株。
2.3聚合酶连反应和核酸内切酶限制性片段长度多态性试验结果
体外选择耐药实验中选择分离成功的菌株，试验前敏感菌株被核酸内切酶酶切，试验后耐药菌朱没有被酶切。临床菌株的敏感菌株均被核酸内切酶酶切，耐药菌株中3株未被酶切，2株被酶切。5株耐药菌株中，一株选择前MIC为1μg/ml，处于临界值，所以没有被入选到此项试验中。其余4株体外人工选择分离出的耐药菌株均为gyrA基因QRDR中编码为Asp91的密码子突变，5株临床耐药株中有4株为91为密码子突变。
3 讨论
左氧氟沙星是一种氟喹诺酮类药物，是氧氟沙星的左旋体，体外抗菌活性高出氧氟沙星。左氧氟沙星是目前临床中根除幽门螺杆菌的有效抗生素药物之一[2]。在国外研究中，临床中应用左氧氟沙星对抗幽门螺杆菌根除率已经能够达到90%。国内学者临床试验研究中根除率也达到了89.5%。以往对幽门螺杆菌的治疗不够彻底，主要是由于幽门螺杆菌具有耐药性[3]。本次研究中的26株菌株中仅有1株对左氧氟沙星耐药，属于耐药性较低。左氧氟沙星的副作用小，依附性较高，临床中应该多推广使用左氧氟沙星药物对抗幽门螺杆菌。
在本次研究中，26株试验菌株对甲硝唑的耐药性较强，有18株，也会对克拉霉素产生耐药性，其中有1株对甲硝唑和克拉霉素同时产生耐药性，并且有1株敏感株。其中，双重耐药是影响治疗幽门螺杆菌的主要因素，常见的幽门螺杆菌双重耐药就是甲硝唑和克拉霉素，本次研究中虽然仅有1株是双重耐药，但这株对左氧氟沙星敏感，治疗失败后会出现继发性的双重耐药。在以往的研究中，幽门螺杆菌会出现甲硝唑耐药，在治疗失败后，出现对甲硝唑敏感，继而发生继发性甲硝唑耐药。而Buckley的研究中显示，含有质子泵抑制剂的三联疗法在失败后，开始对克拉霉素敏感的幽门螺杆菌会变成耐药菌株。以往临床中使用甲硝唑和克拉霉素来治疗根除幽门螺杆菌，但治疗失败后出现的双重耐药对患者影响较大，此时使用左氧氟沙星治疗是一种很好的选择。
在本次研究中主要针对幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药性进行了探讨，幽门螺杆菌对左氧氟沙星的耐药机制分析为应该是由于药物靶酶——DNA促旋酶的基因突变进而将氨基酸改变所导致，本次研究中的91位Asp的密码子突变在耐药机制中很重要，引入核酸内切酶切位点的方法能够检测出左氧氟沙星的耐药菌株，这种方法十分简单且快速，对耐药的检测很有效。
参考文献：
[1]王松松.青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析[D].青岛：青岛大学，2013.
[2]吴李培，宣世海.幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药的研究进展[J].世界华人消化杂志，2014，05（02）：197-202.
[3]王松松，苏艳华，战淑慧，等.青岛地区幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药性及gyrA基因突变分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2013，03（05）：428-430.