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摘要 [目的]比较黑棘鲷群体线粒体16S rRNA基因序列。[方法]运用黑棘鲷线粒体16SrRNA基因片段，对来自我国沿海的10个野生黑棘鲷群体进行了遗传多样性以及遗传分化的分析。[结果]10个群体的80个个体中，碱基A、C、G、T的平均含量分别为31.6%、24.2%、22.7%、21.5%，一共定义了9种单倍型，共发现16个多态位点，得出9种单倍型，遗传距离为0.000 0～0.006 3，10个黑棘鲷群体的平均单倍型多样性（Hd）为0.393，平均核苷酸多样性指数（Pi）为0.003 19，说明10个群体表现出了较低的Hd和较低的Pi，其中厦门群体的遗传多样性最大，这与厦门的地理位置及气候有关。AMOVA模块和系统进化树均显示来自10个群体黑棘鲷间遗传分化不显著，说明来自南北方的黑棘鲷属于同一个管理单元，分子中性进化检验显示舟山群体显著偏离中性进化。[结论]该研究可为鲷科鱼类的进化以及遗传多样性研究提供依据。
关键词 黑棘鲷；16SrRNA；遗传变异
中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0122-05
Abstract [Objective]To compare 16S rRNA gene fragment of mitochondria from Acanthopagrus schlegelii.[Method]In this study， we used the 16S rRNA gene fragment of mitochondria from A.schlegelii to analyze the genetic diversity and genetic differentiation of 10 populations of wild A.schlegelii from the coast of China. [Result]The average content of bases A，C，G，T in 80 individuals in 10 groups was 31.6%，24.2%，22.7%，and 21.5%，respectively. A total of 9 haplotypes were defined， a total of 16 polymorphisms were found， and 9 haplotypes were obtained. The genetic distance was 0.000 0-0.006 3， the average Hd of 10 A. schlegelii groups was 0.393， and the average Pi was 0.003 19， indicating that 10 groups exhibit lower Hd and lower Pi， of which the Xiamen group had the largest genetic diversity. This was related to the geographical location and climate of Xiamen. Both the AMOVA module and the system evolution tree showed that the genetic differentiation between the A. schlegelii from 10 groups was not significant， indicating that the A. schlegelii from the North and South belonged to the same management unit， and the molecular neutral evolution test showed that the Zhoushan population was significantly deviated from the neutral evolution. [Conclusion]The study will provide evidence for the evolution and genetic diversity of A. schlegelii.
Key words Acanthopagrus schlegelii；16SrRNA；Genetic variation
黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii）又称黑鲷，隶属鲈形目（Percoidei）、鲷科（Sparidae）、棘鲷属（Acanthopagrus），具有生长迅速、抗病能力强、适应能力强等特点。黑棘鲷肉味鲜美，营养丰富，具有较高的经济价值，是海水养殖的名贵经济鱼类，广泛分布在北太平洋西部，我国沿海以及朝鲜、日本海域[1]。目前，对黑棘鲷的研究主要集中在基础生物学、增养殖学、疾病学和遗传学等方面。
线粒体（mitochondrion）是细胞中的“动力工厂”，是一种非常重要的细胞器，是细胞中氧化磷酸化及主要的供能场所，是一种半自主细胞器。动物的线粒体DNA具有以下特点：基因排列非常紧凑、核苷酸组成不均一、遗传行为较独立、增殖较快以及密码识别机制与核基因的编码规律不尽相同[2-3]。线粒体16S rRNA基因在线粒体基因组中进化速度较适中，常被应用于不同阶元物种的系统进化和分类研究[4]。目前国内关于黑棘鲷分子水平的研究有多方面，杨慧荣等[5]通过RAPD技术对3个不同地理群体黑鲷进行了群体内与群体间的遗传变异分析；林勉等[6]采用核型分析和AFLP技术对黑鲷及其杂交子代进行了遗传差异分析；郭昱嵩等[7]对9种常见鲷科鱼类进行了微卫星位点筛选和遗传多样性分析。笔者利用PCR扩增技术对黑棘鲷线粒体16S rRNA基因片段进行序列测定和分析，了解我国沿海10个群体野生黑棘鲷的遗传差异，以期为今后黑棘鲷的遗传选育及养殖生产提供分子遗传学依据。 1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的10个野生黑棘鲷群体分别采自烟台、威海、舟山、福鼎、厦门、漳浦、南澳、湛江、北海和海口。采样时间为2015年10月29日—2016年10月20日，具体采样地点及时间见表1。试验样品加冰运送到实验室，从黑棘鲷背部剪下肌肉组织，将其置于95%乙醇溶液中，存放于-80 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1
DNA提取。试验过程中，所用的基因组DNA均由试剂盒提取所得。提取过程严格按照说明书操作，具体步骤详见海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明书（北京天根生化科技有限公司）。
1.2.2
DNA检测。提取DNA，取2 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并经K5500超微紫外分光光度计检测其纯度和浓度。选取纯度较好、片段完整的DNA稀释到100 ng/μL，放-20 ℃冰箱备用。
1.2.3 黑棘鲷线粒体16S rRNA基因的PCR扩增。扩增引物选用F：5′-GGTAGGGCAATCACTTCTCT-3′和R：5′ -TAGCGGCTGGACCATTAGGA- 3′。 对其进行PCR扩增，PCR扩增反应总体系为50 μL，体系中各组分为DNA模板（100 ng/μL），2.5 μL；ddH2O，38.25 μL；10× Dream Taq buffer（Mg2+），5 μL；Primer F（10 μmol/L），1.25 μL；Primer R（10 μmol/L），1.25 μL；Dream Taq酶（5 U/μL），0.50 μL；dNTPs（10 mmol/L），1.25 μL。扩增的反应程序为94 ℃預变性2 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃保温10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统拍照保存。
1.2.4
基因片段的测序及数据分析。将PCR扩增产物送至上海英潍捷基公司测序，测序结果网上自行下载。结合DNAMAN 6.0软件人工去除序列两端的测序不可信碱基及非目的基因序列；运用BioEdit 7.0软件对10个群体野生黑棘鲷的线粒体16S rRNA基因片段的核苷酸序列进行比对以分析碱基组成；运用DNA SP 5.10软件分析各群体的单倍型数（number of haplotypes，h）、平均核苷酸差异数（average number of nucleotide differences，k）、核苷酸多样性指数（nucleotide diversity，Pi）等；利用Arliquin 3.5软件分析序列的遗传多样性、变异位点及序列单倍型。运用Arliquin 3.5软件的AMOVA模块分析得到遗传变异在群体间和群体内的分布；最后，运用MEGA 4.0软件构建10个野生黑棘鲷群体的NJ进化树。
2 线粒体16S rRNA基因片段结果分析
2.1 序列特征及群体遗传多样性
通过计算16S rRNA基因序列发现，各碱基组成在黑棘鲷10个群体80个个体中无明显差异。碱基组成A、C、G、T的平均含量分别为31.6%、24.2%、22.7%、21.5%，A+T平均含量为53.1%，G+C平均含量为46.9%（表2）。
在黑棘鲷10个群体80个个体中，共发现17个变异位点（total number of mutations），占439个分析位点数的3.87%，这其中包括1个碱基插入/缺失位点和16个多态位点（polymorphic site）。16个多态位点包括6个单一变异位点（singleton variable site）以及10个简约信息位点（parsimony informative site），而这些突变位点一共定义了9种单倍型。
80个黑棘鲷个体的平均核苷酸差异数为1.401，核苷酸多样性指数为0.003 19。在10个黑棘鲷群体中，厦门的平均核苷酸差异数最大，为2.143；核苷酸多样性指数也最大，为0.004 88（表3）。
2.2 群体间遗传变异分析
黑棘鲷10个群体间的遗传距离为0.000 0～0.006 3，其中漳浦群体与厦门群体之间的遗传距离最大，为0.006 3（表4）。
利用Arliquin3.5软件基于距离矩阵 pairwise difference 计算群体间的遗传分化系数FST。当FST为负值时，若P值大于0.05，则群体间并未出现显著的遗传分化；而FST为负值时，若P值小于0.05，则群体间出现显著的遗传分化。由表5可知，当群体间FST为负值时，P值均大于0.05。AMOVA分析也表明，黑棘鲷群体遗传变异5.19%来自群体间，94.81%来自群体内。群体间的遗传分化系数为0.051 91，P=0.000 00。说明黑棘鲷群体间未出现较为显著的遗传分化。
采用Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验对黑棘鲷群体进行中性进化检验。当Tajima’s D检验所得D值为负值时，若P值大于0.05，则说明该群体并没有显著偏离中性进化，表明该群体的种群大小以及遗传趋势都趋于稳定。而当Tajima’s D检验所得D值为负值时，若P值小于0.05，则说明该群体显著偏离中性进化。Tajima’s D检验显示10个野生黑棘鲷群体均未显著偏离中性进化，Fu’s Fs检验显示，舟山群体显著偏离中性进化，之前有研究表明Fu’s Fs检验较Fu’s Fs检验结果更加准确，所以10个黑棘鲷群体中，只有舟山群体显著偏离中性进化（表6）。且根据序列距离构建10个野生黑棘鲷群体80个个体的NJ进化树（图1），可以看出NJ进化树并无明显分支，10个群体并没有体现出地理差异性。 3 结论与讨论
线粒体DNA进化速率较核DNA快，在生物中应用广泛，线粒体16SrRNA基因具有适宜的进化速度，一般用于研究物种的分类和进化关系。目前，16SrRNA片段在多样性及分子系统学研究中应用广泛[8-9]，如罗氏沼虾[10]、石鲈科鱼类[11]、礁石珊瑚[12]等。但国内外关于黑棘鲷基于16SrRNA基因的分子水平研究较少，一些种属的分类地位仍然没有得到解决。
3.1 群体遗传多样性分析
10个黑棘鲷群体黑棘鲷A、C、G、T碱基组成在每个个体中相似，这与分析石首鱼类[13]、黄姑鱼[14]、中华虎头蟹[15]等鱼类的16S rRNA基因片段序列所得结果一致。共发现17个变异位点，比例为3.87%，该结果低于笛鲷属鱼类16S rRNA基因的结果，这可能与研究品种的差异、采样范围、所选取序列的片段及地理差异等有关。遗传多样性是多种学科的基础，被广泛运用在濒危动植物的保护、种群遗传、植物遗传育种等方面，对其进行深入研究，有利于生物体的优良进化。80个野生黑棘鲷个体的单倍型多样性指数（Hd）为0.393（Hd<0.5），核苷酸多样性指数（Pi）为0.003 19（Pi<0.05），呈现较低的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，说明遗传多样性水平总体处于较低状态。10个群体中，厦门黑棘鲷的遗传多样性最大，这与利用黑棘鲷Cytb基因片段研究结果相似，这可能与厦门优良的气候条件有关。厦门又称“鹭岛”，是东南沿海重要的中心城市，由鼓浪屿等许多小岛屿组成，海域终年水温较高，阳光充足，营养盐含量丰富，适合多种海洋生物的生存，前后共记录的海洋生物有2 000多种。黑棘鲷16S rRNA基因进化速率很慢，是一个相对保守的序列，其在不同群体间的分化程度均很低，不能有效检测到群体间的差异，不适合作为研究其多样性的工具，这与罗氏沼虾16S rRNA片段所得结论一致[16]。
全球性的气候变化和环境污染、人们对近海无节制开发以及为了一些商业利益对黑棘鲷野生群体进行大规模捕捞等均造成了野生黑棘鲷栖息地的破坏，导致其多样性水平降低。近年来，对黑棘鲷的人工标志放流技术逐渐成熟，在2017年6月6日，八闽放鱼日当天，包括黑棘鲷在内的4.5亿鱼苗得到放流，有助于改善鱼类多样性及生态水域环境，但不正确的放流将会使群体的多样性降低，如鱼苗的过量投放，超出了该海域的环境容纳量，甚至尸体还会对水体环境造成污染，对原有的野生黑棘鲷造成了不利影响，有的外来物种甚至会破坏地区的生态破坏，这就使得原有种的遗传多样性降低。同样过度捕捞也会降低物种的遗传多样性，历史上黑棘鲷曾受到过较高的捕捞压力，使得黑棘鲷群体在短期内迅速减少，即经历了遗传瓶颈效应，这与高天翔等[17]研究2种鱼类Cytb、16S rRNA片段序列得出的结论一致。所以要想恢复其多样性，必须遵从一定的增殖放流规定，放流前要对该海域的生态环境及环境容纳量做仔细研究，不可擅自随意放流。
3.2 黑棘鲷群体间的遗传变异分析
我国沿海10个野生群体的遗传距离是0.000 0～0.006 3，黑棘鲷亲缘关系的远近和其所处的地理位置没有明显的关系，有学者基于线粒体控制区对12个黑棘鲷群体的遗传分化及系谱结构进行了分析，没有发现明显的地理群聚和系谱结构[18]；对来自我国沿海5个地理位置的黑棘鲷进行遗传分化研究，发现进化树无明显的系谱分支[19]，这与该研究的遗传分化结果一致。
遗传分化系数FST是遗传分化研究中一个有效指标，FST大小反映了各群体间相似性的大小，FST越大则说明群体间的相似性越小，反之，则说明相似性较大。该研究发现，舟山和福鼎群体之间遗传分化系数FST为负值，P大于0.05，表明10个群体间并没有出现显著的遗传分化。遗传分化系数FST为负值的情况在文昌鱼[20]、长蛸[21]的研究中均有发现，这是由于群体内的遗传分化和群体间不均衡造成的，群体内的大很多。结合AMOVA模块也可以得出，10个群体的遗传分化均属种内水平，并未出現种间水平的分化，黑棘鲷遗传变异在群体间和群体内分别为5.19%、94.81%，群体间遗传分化系数FST为0.051 91，P为0.189（P>0.05），说明我国沿海10个野生黑棘鲷群体间并未出现显著的遗传分化，各海域的黑棘鲷之间存在着较大基因交流，这与AFLP的研究结果一致。
3.3 分子中性进化分析
分子中性进化采用Tajima’s D和Fu’s Fs检验。当种群处于平衡选择时，Tajima’s D 值大于0；当群体受到外界环境的负选择、瓶颈效应和搭载效应等情况影响时，D值小于0。Tajima’s D结果显示，10个群体显示D值小于0，P大于0.05，说明我国沿海10个野生黑棘鲷群体并未显著偏离中性进化。
Fu’s Fs检验是另一种基于种内多态性的中性检验，Fu等[22]研究表明在中性假说检验方面，Fu’s Fs检验可能比Tajima’s D检验更加灵敏。Fu’s Fs法分析发现，舟山群体偏离中性进化比较显著。这说明，舟山群体在历史上由于环境剧烈恶化，为了后代的生存发育，可能经历了大规模的迁移，向一个环境较好的水域移动，这样就造成种群的大规模扩张，大量黑棘鲷涌入一个新海域，会发生瓶颈效应，即生物的个体数目及遗传信息含量在短时间内急剧下降，这样就会偏离中性进化；即使日后进行再次扩张，也只会达到原海域黑棘鲷的数目而生物体内的遗传变异是远远达不到以前的水平，从而产生了遗传漂变，而其他9个野生黑棘鲷群体的遗传趋势和大小趋于稳定。
3.4 10个群体黑棘鲷的系统发生关系
根据序列距离构建10个野生黑棘鲷群体80个个体的NJ进化树，可以看出该进化树未形成明显的地理结构，与各群体所处的地理位置无关。目前，针对其群体划分存在2种说法：一种认为南北方黑棘鲷共属同一个祖先，遗传分化不显著，可以归为同一个管理单元；另一种是认为南北黑棘鲷间存在明显的遗传分化，应该分为南、北方2个不同的管理单元，该研究显示南北方群体间的遗传分化并不显著，存在较强的基因交流。 近年来由于黑棘鲷种质资源遭到破坏，为了加大对黑棘鲷的保护，养殖业非常发达，人工选育以及杂交造成了非常嚴重的基因渗透和基因混杂。养殖业的快速发展有助于黑棘鲷增殖放流活动的顺利进行，为了提高其多样性，将养殖的黑棘鲷投入野生黑棘鲷生存海域，虽然提高了其多样性，但是也造成了一定程度的基因交流。有研究表明，地球上现存海洋生物的种群结构在很大程度上会受到以往地理历史事件的影响，在晚更新世纪冰期以来，地球经历了一系列的间冰期和冰期的周期性变化，导致气候和和海域面积也会在特定时间发生变化，这样就形成了不同海域之间生物的基因交流。该研究所采集的野生黑棘鲷样品来自多个海域，有资料表明它们在第四纪冰期曾经历了多次海进和海退，由于气候变化、地球自转速度变化及海面和陆地差异的变化等原因，造成海水反复多次从海洋向大陆扩展或是由大陆向海洋退缩，期间伴随着生物群落的多次交换，这样就造成了大面积、高强度的基因交流，甚至在盛冰期期间，多个海域出现了海水枯竭现象，导致了生物多样性的降低，正是由于第四纪冰期以来，多个海域反复的海进和海退，使得野生黑棘鲷的栖息地随之不断发生变化，造成了如今黑棘鲷群体间广泛的基因交流及遗传均质性。
4 展望
虽然未显示黑棘鲷群体的遗传多样性有剧烈的下降，但保护黑棘鲷的种质资源也是尤为重要的，可以从以下几个方面入手，为野生黑棘鲷资源的合理开发及保护提供必要的参考。
（1）号召各地举行定期的增殖放流，有助于改善水体环境，维持其生物多样性，比如每年6月6日的八闽放鱼日，在增殖放流时要采取正确的方法，切忌盲目随意放流，遵从该地区的最大环境容纳量，一旦超过环境容纳量，则会打破原有的生态平衡，对野生黑棘鲷群体产生负面影响。在具体实施过程中，要注意放流高度，民间放生要提前向有关部门申请。
（2）要保证人类的工业活动不会对野生黑棘鲷的洄游通道造成影响，比如在修建大坝时候，一定要考虑鱼类的洄游通道不被堵塞。
（3）建立相关法律、法规禁止过度捕捞，因为黑棘鲷具有一定的经济价值，每年都有许多人对其进行过度捕捞，政府应当加大对这些人的处罚力度，使黑棘鲷的数目相对稳定。
（4）加大对水体环境的保护，避免将工业、生活废水直接排入海域，这样会对野生黑棘鲷赖以生存的环境造成影响，影响其产卵和孵化，进而使其多样性慢慢降低，可以通过社区宣讲、设立警示标语等方法。
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关键词 黑棘鲷；16SrRNA；遗传变异
中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0122-05
Abstract [Objective]To compare 16S rRNA gene fragment of mitochondria from Acanthopagrus schlegelii.[Method]In this study， we used the 16S rRNA gene fragment of mitochondria from A.schlegelii to analyze the genetic diversity and genetic differentiation of 10 populations of wild A.schlegelii from the coast of China. [Result]The average content of bases A，C，G，T in 80 individuals in 10 groups was 31.6%，24.2%，22.7%，and 21.5%，respectively. A total of 9 haplotypes were defined， a total of 16 polymorphisms were found， and 9 haplotypes were obtained. The genetic distance was 0.000 0-0.006 3， the average Hd of 10 A. schlegelii groups was 0.393， and the average Pi was 0.003 19， indicating that 10 groups exhibit lower Hd and lower Pi， of which the Xiamen group had the largest genetic diversity. This was related to the geographical location and climate of Xiamen. Both the AMOVA module and the system evolution tree showed that the genetic differentiation between the A. schlegelii from 10 groups was not significant， indicating that the A. schlegelii from the North and South belonged to the same management unit， and the molecular neutral evolution test showed that the Zhoushan population was significantly deviated from the neutral evolution. [Conclusion]The study will provide evidence for the evolution and genetic diversity of A. schlegelii.
Key words Acanthopagrus schlegelii；16SrRNA；Genetic variation
黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii）又称黑鲷，隶属鲈形目（Percoidei）、鲷科（Sparidae）、棘鲷属（Acanthopagrus），具有生长迅速、抗病能力强、适应能力强等特点。黑棘鲷肉味鲜美，营养丰富，具有较高的经济价值，是海水养殖的名贵经济鱼类，广泛分布在北太平洋西部，我国沿海以及朝鲜、日本海域[1]。目前，对黑棘鲷的研究主要集中在基础生物学、增养殖学、疾病学和遗传学等方面。
线粒体（mitochondrion）是细胞中的“动力工厂”，是一种非常重要的细胞器，是细胞中氧化磷酸化及主要的供能场所，是一种半自主细胞器。动物的线粒体DNA具有以下特点：基因排列非常紧凑、核苷酸组成不均一、遗传行为较独立、增殖较快以及密码识别机制与核基因的编码规律不尽相同[2-3]。线粒体16S rRNA基因在线粒体基因组中进化速度较适中，常被应用于不同阶元物种的系统进化和分类研究[4]。目前国内关于黑棘鲷分子水平的研究有多方面，杨慧荣等[5]通过RAPD技术对3个不同地理群体黑鲷进行了群体内与群体间的遗传变异分析；林勉等[6]采用核型分析和AFLP技术对黑鲷及其杂交子代进行了遗传差异分析；郭昱嵩等[7]对9种常见鲷科鱼类进行了微卫星位点筛选和遗传多样性分析。笔者利用PCR扩增技术对黑棘鲷线粒体16S rRNA基因片段进行序列测定和分析，了解我国沿海10个群体野生黑棘鲷的遗传差异，以期为今后黑棘鲷的遗传选育及养殖生产提供分子遗传学依据。 1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的10个野生黑棘鲷群体分别采自烟台、威海、舟山、福鼎、厦门、漳浦、南澳、湛江、北海和海口。采样时间为2015年10月29日—2016年10月20日，具体采样地点及时间见表1。试验样品加冰运送到实验室，从黑棘鲷背部剪下肌肉组织，将其置于95%乙醇溶液中，存放于-80 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1
DNA提取。试验过程中，所用的基因组DNA均由试剂盒提取所得。提取过程严格按照说明书操作，具体步骤详见海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明书（北京天根生化科技有限公司）。
1.2.2
DNA检测。提取DNA，取2 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并经K5500超微紫外分光光度计检测其纯度和浓度。选取纯度较好、片段完整的DNA稀释到100 ng/μL，放-20 ℃冰箱备用。
1.2.3 黑棘鲷线粒体16S rRNA基因的PCR扩增。扩增引物选用F：5′-GGTAGGGCAATCACTTCTCT-3′和R：5′ -TAGCGGCTGGACCATTAGGA- 3′。 对其进行PCR扩增，PCR扩增反应总体系为50 μL，体系中各组分为DNA模板（100 ng/μL），2.5 μL；ddH2O，38.25 μL；10× Dream Taq buffer（Mg2+），5 μL；Primer F（10 μmol/L），1.25 μL；Primer R（10 μmol/L），1.25 μL；Dream Taq酶（5 U/μL），0.50 μL；dNTPs（10 mmol/L），1.25 μL。扩增的反应程序为94 ℃預变性2 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃保温10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统拍照保存。
1.2.4
基因片段的测序及数据分析。将PCR扩增产物送至上海英潍捷基公司测序，测序结果网上自行下载。结合DNAMAN 6.0软件人工去除序列两端的测序不可信碱基及非目的基因序列；运用BioEdit 7.0软件对10个群体野生黑棘鲷的线粒体16S rRNA基因片段的核苷酸序列进行比对以分析碱基组成；运用DNA SP 5.10软件分析各群体的单倍型数（number of haplotypes，h）、平均核苷酸差异数（average number of nucleotide differences，k）、核苷酸多样性指数（nucleotide diversity，Pi）等；利用Arliquin 3.5软件分析序列的遗传多样性、变异位点及序列单倍型。运用Arliquin 3.5软件的AMOVA模块分析得到遗传变异在群体间和群体内的分布；最后，运用MEGA 4.0软件构建10个野生黑棘鲷群体的NJ进化树。
2 线粒体16S rRNA基因片段结果分析
2.1 序列特征及群体遗传多样性
通过计算16S rRNA基因序列发现，各碱基组成在黑棘鲷10个群体80个个体中无明显差异。碱基组成A、C、G、T的平均含量分别为31.6%、24.2%、22.7%、21.5%，A+T平均含量为53.1%，G+C平均含量为46.9%（表2）。
在黑棘鲷10个群体80个个体中，共发现17个变异位点（total number of mutations），占439个分析位点数的3.87%，这其中包括1个碱基插入/缺失位点和16个多态位点（polymorphic site）。16个多态位点包括6个单一变异位点（singleton variable site）以及10个简约信息位点（parsimony informative site），而这些突变位点一共定义了9种单倍型。
80个黑棘鲷个体的平均核苷酸差异数为1.401，核苷酸多样性指数为0.003 19。在10个黑棘鲷群体中，厦门的平均核苷酸差异数最大，为2.143；核苷酸多样性指数也最大，为0.004 88（表3）。
2.2 群体间遗传变异分析
黑棘鲷10个群体间的遗传距离为0.000 0～0.006 3，其中漳浦群体与厦门群体之间的遗传距离最大，为0.006 3（表4）。
利用Arliquin3.5软件基于距离矩阵 pairwise difference 计算群体间的遗传分化系数FST。当FST为负值时，若P值大于0.05，则群体间并未出现显著的遗传分化；而FST为负值时，若P值小于0.05，则群体间出现显著的遗传分化。由表5可知，当群体间FST为负值时，P值均大于0.05。AMOVA分析也表明，黑棘鲷群体遗传变异5.19%来自群体间，94.81%来自群体内。群体间的遗传分化系数为0.051 91，P=0.000 00。说明黑棘鲷群体间未出现较为显著的遗传分化。
采用Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验对黑棘鲷群体进行中性进化检验。当Tajima’s D检验所得D值为负值时，若P值大于0.05，则说明该群体并没有显著偏离中性进化，表明该群体的种群大小以及遗传趋势都趋于稳定。而当Tajima’s D检验所得D值为负值时，若P值小于0.05，则说明该群体显著偏离中性进化。Tajima’s D检验显示10个野生黑棘鲷群体均未显著偏离中性进化，Fu’s Fs检验显示，舟山群体显著偏离中性进化，之前有研究表明Fu’s Fs检验较Fu’s Fs检验结果更加准确，所以10个黑棘鲷群体中，只有舟山群体显著偏离中性进化（表6）。且根据序列距离构建10个野生黑棘鲷群体80个个体的NJ进化树（图1），可以看出NJ进化树并无明显分支，10个群体并没有体现出地理差异性。 3 结论与讨论
线粒体DNA进化速率较核DNA快，在生物中应用广泛，线粒体16SrRNA基因具有适宜的进化速度，一般用于研究物种的分类和进化关系。目前，16SrRNA片段在多样性及分子系统学研究中应用广泛[8-9]，如罗氏沼虾[10]、石鲈科鱼类[11]、礁石珊瑚[12]等。但国内外关于黑棘鲷基于16SrRNA基因的分子水平研究较少，一些种属的分类地位仍然没有得到解决。
3.1 群体遗传多样性分析
10个黑棘鲷群体黑棘鲷A、C、G、T碱基组成在每个个体中相似，这与分析石首鱼类[13]、黄姑鱼[14]、中华虎头蟹[15]等鱼类的16S rRNA基因片段序列所得结果一致。共发现17个变异位点，比例为3.87%，该结果低于笛鲷属鱼类16S rRNA基因的结果，这可能与研究品种的差异、采样范围、所选取序列的片段及地理差异等有关。遗传多样性是多种学科的基础，被广泛运用在濒危动植物的保护、种群遗传、植物遗传育种等方面，对其进行深入研究，有利于生物体的优良进化。80个野生黑棘鲷个体的单倍型多样性指数（Hd）为0.393（Hd<0.5），核苷酸多样性指数（Pi）为0.003 19（Pi<0.05），呈现较低的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，说明遗传多样性水平总体处于较低状态。10个群体中，厦门黑棘鲷的遗传多样性最大，这与利用黑棘鲷Cytb基因片段研究结果相似，这可能与厦门优良的气候条件有关。厦门又称“鹭岛”，是东南沿海重要的中心城市，由鼓浪屿等许多小岛屿组成，海域终年水温较高，阳光充足，营养盐含量丰富，适合多种海洋生物的生存，前后共记录的海洋生物有2 000多种。黑棘鲷16S rRNA基因进化速率很慢，是一个相对保守的序列，其在不同群体间的分化程度均很低，不能有效检测到群体间的差异，不适合作为研究其多样性的工具，这与罗氏沼虾16S rRNA片段所得结论一致[16]。
全球性的气候变化和环境污染、人们对近海无节制开发以及为了一些商业利益对黑棘鲷野生群体进行大规模捕捞等均造成了野生黑棘鲷栖息地的破坏，导致其多样性水平降低。近年来，对黑棘鲷的人工标志放流技术逐渐成熟，在2017年6月6日，八闽放鱼日当天，包括黑棘鲷在内的4.5亿鱼苗得到放流，有助于改善鱼类多样性及生态水域环境，但不正确的放流将会使群体的多样性降低，如鱼苗的过量投放，超出了该海域的环境容纳量，甚至尸体还会对水体环境造成污染，对原有的野生黑棘鲷造成了不利影响，有的外来物种甚至会破坏地区的生态破坏，这就使得原有种的遗传多样性降低。同样过度捕捞也会降低物种的遗传多样性，历史上黑棘鲷曾受到过较高的捕捞压力，使得黑棘鲷群体在短期内迅速减少，即经历了遗传瓶颈效应，这与高天翔等[17]研究2种鱼类Cytb、16S rRNA片段序列得出的结论一致。所以要想恢复其多样性，必须遵从一定的增殖放流规定，放流前要对该海域的生态环境及环境容纳量做仔细研究，不可擅自随意放流。
3.2 黑棘鲷群体间的遗传变异分析
我国沿海10个野生群体的遗传距离是0.000 0～0.006 3，黑棘鲷亲缘关系的远近和其所处的地理位置没有明显的关系，有学者基于线粒体控制区对12个黑棘鲷群体的遗传分化及系谱结构进行了分析，没有发现明显的地理群聚和系谱结构[18]；对来自我国沿海5个地理位置的黑棘鲷进行遗传分化研究，发现进化树无明显的系谱分支[19]，这与该研究的遗传分化结果一致。
遗传分化系数FST是遗传分化研究中一个有效指标，FST大小反映了各群体间相似性的大小，FST越大则说明群体间的相似性越小，反之，则说明相似性较大。该研究发现，舟山和福鼎群体之间遗传分化系数FST为负值，P大于0.05，表明10个群体间并没有出现显著的遗传分化。遗传分化系数FST为负值的情况在文昌鱼[20]、长蛸[21]的研究中均有发现，这是由于群体内的遗传分化和群体间不均衡造成的，群体内的大很多。结合AMOVA模块也可以得出，10个群体的遗传分化均属种内水平，并未出現种间水平的分化，黑棘鲷遗传变异在群体间和群体内分别为5.19%、94.81%，群体间遗传分化系数FST为0.051 91，P为0.189（P>0.05），说明我国沿海10个野生黑棘鲷群体间并未出现显著的遗传分化，各海域的黑棘鲷之间存在着较大基因交流，这与AFLP的研究结果一致。
3.3 分子中性进化分析
分子中性进化采用Tajima’s D和Fu’s Fs检验。当种群处于平衡选择时，Tajima’s D 值大于0；当群体受到外界环境的负选择、瓶颈效应和搭载效应等情况影响时，D值小于0。Tajima’s D结果显示，10个群体显示D值小于0，P大于0.05，说明我国沿海10个野生黑棘鲷群体并未显著偏离中性进化。
Fu’s Fs检验是另一种基于种内多态性的中性检验，Fu等[22]研究表明在中性假说检验方面，Fu’s Fs检验可能比Tajima’s D检验更加灵敏。Fu’s Fs法分析发现，舟山群体偏离中性进化比较显著。这说明，舟山群体在历史上由于环境剧烈恶化，为了后代的生存发育，可能经历了大规模的迁移，向一个环境较好的水域移动，这样就造成种群的大规模扩张，大量黑棘鲷涌入一个新海域，会发生瓶颈效应，即生物的个体数目及遗传信息含量在短时间内急剧下降，这样就会偏离中性进化；即使日后进行再次扩张，也只会达到原海域黑棘鲷的数目而生物体内的遗传变异是远远达不到以前的水平，从而产生了遗传漂变，而其他9个野生黑棘鲷群体的遗传趋势和大小趋于稳定。
3.4 10个群体黑棘鲷的系统发生关系
根据序列距离构建10个野生黑棘鲷群体80个个体的NJ进化树，可以看出该进化树未形成明显的地理结构，与各群体所处的地理位置无关。目前，针对其群体划分存在2种说法：一种认为南北方黑棘鲷共属同一个祖先，遗传分化不显著，可以归为同一个管理单元；另一种是认为南北黑棘鲷间存在明显的遗传分化，应该分为南、北方2个不同的管理单元，该研究显示南北方群体间的遗传分化并不显著，存在较强的基因交流。 近年来由于黑棘鲷种质资源遭到破坏，为了加大对黑棘鲷的保护，养殖业非常发达，人工选育以及杂交造成了非常嚴重的基因渗透和基因混杂。养殖业的快速发展有助于黑棘鲷增殖放流活动的顺利进行，为了提高其多样性，将养殖的黑棘鲷投入野生黑棘鲷生存海域，虽然提高了其多样性，但是也造成了一定程度的基因交流。有研究表明，地球上现存海洋生物的种群结构在很大程度上会受到以往地理历史事件的影响，在晚更新世纪冰期以来，地球经历了一系列的间冰期和冰期的周期性变化，导致气候和和海域面积也会在特定时间发生变化，这样就形成了不同海域之间生物的基因交流。该研究所采集的野生黑棘鲷样品来自多个海域，有资料表明它们在第四纪冰期曾经历了多次海进和海退，由于气候变化、地球自转速度变化及海面和陆地差异的变化等原因，造成海水反复多次从海洋向大陆扩展或是由大陆向海洋退缩，期间伴随着生物群落的多次交换，这样就造成了大面积、高强度的基因交流，甚至在盛冰期期间，多个海域出现了海水枯竭现象，导致了生物多样性的降低，正是由于第四纪冰期以来，多个海域反复的海进和海退，使得野生黑棘鲷的栖息地随之不断发生变化，造成了如今黑棘鲷群体间广泛的基因交流及遗传均质性。
4 展望
虽然未显示黑棘鲷群体的遗传多样性有剧烈的下降，但保护黑棘鲷的种质资源也是尤为重要的，可以从以下几个方面入手，为野生黑棘鲷资源的合理开发及保护提供必要的参考。
（1）号召各地举行定期的增殖放流，有助于改善水体环境，维持其生物多样性，比如每年6月6日的八闽放鱼日，在增殖放流时要采取正确的方法，切忌盲目随意放流，遵从该地区的最大环境容纳量，一旦超过环境容纳量，则会打破原有的生态平衡，对野生黑棘鲷群体产生负面影响。在具体实施过程中，要注意放流高度，民间放生要提前向有关部门申请。
（2）要保证人类的工业活动不会对野生黑棘鲷的洄游通道造成影响，比如在修建大坝时候，一定要考虑鱼类的洄游通道不被堵塞。
（3）建立相关法律、法规禁止过度捕捞，因为黑棘鲷具有一定的经济价值，每年都有许多人对其进行过度捕捞，政府应当加大对这些人的处罚力度，使黑棘鲷的数目相对稳定。
（4）加大对水体环境的保护，避免将工业、生活废水直接排入海域，这样会对野生黑棘鲷赖以生存的环境造成影响，影响其产卵和孵化，进而使其多样性慢慢降低，可以通过社区宣讲、设立警示标语等方法。
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