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【摘要】目的:为研究医用一次性输血器的细胞毒性。方法:参照中华人民共和国关于输血器具生物学试验的标准，采用能快速评定细胞增殖率和细胞毒性的比色分析方法-MTT比色法，检测医用一次性输血器对小鼠成纤维细胞L929细胞相对增殖率的影响，评价其细胞毒性。结果:根据细胞毒性反应的评价标准，该次检测的医用一次性输血器呈现高的细胞相对增殖率，其细胞毒性为1级，即无细胞毒性。结论 一次性输血器采用MTT法检测表明，其无细胞毒性，具有良好的安全性。
【关键词】MTT；比色法；一次性输血器；细胞毒性
Evaluation on the Cytotoxicity of Disposable blood transfusion device for Medical Use by MTT assay
ZHOU Yixin PU Xiangke
【Abstract】Objective To explore the cell toxicity of a kind of medical disposable blood transfusion apparatus. MethodsMTT colorimetric analysis, a method which can quickly assess the cell proliferation rate and the cell toxicity, was used to detect the impact on the cell proliferation rate of L929(a mouse fibroblast cell line) caused by the medical disposable transfusion device. The experiment was carried out to evaluate the cell toxicity of the transfusion set according to the biological tests standard of the People's Republic of China(RPC). Results According to cell toxicity evaluation criteria, cells cocultured with the disposable transfusion apparatus still showed high relative growth rate and the cytotoxicity is grade 1 with the reference to the national stands. ConclusionThere is no obvious toxicity to cells by using the disposable transfusion device and it will be safe to patients.
【Key words】MTT; colorimetric analysis; disposable blood transfusion device;cells toxicity
【中图分类号】R385 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)07-0023-02
医用一次性输血器是医疗行业中常用的一类医疗器械，使用量极大，由于一次性输血器直接应用于人体，其材料的安全性直接关系到患者的生命安全。医用一次性输血器一般是采用高分子材料制成的，此类医疗器械在应用于人体之前，首先要进行材料的生物安全性评价。细胞毒性反应试验是医用生物材料生物安全性评价的初步筛选试验。细胞毒性反应试验是在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它在生物安全性评价体系中是最重要的检测指标之一，是首选和必选的项目。自从1983年Mosman首次提出了一种快速评定细胞增值和细胞毒性的比色分析方法，即MTT比色法。MTT比色法最初被广泛应用于肿瘤学、免疫学等生物学相关研究[1-2]，如今已经已经成为评价医用生物材料细胞毒性的重要试验。我们参照国家关于医用生物材料生物安全性测试的标准，对抽检的医用一次性输血器的细胞毒性进行了测试评估。
1 材料与方法
1.1 待测样品医用一次性输血器来自奥雅索医疗器件（昆山）有限公司，随机抽取二个不同批次的产品进行检测，批号分别为B5051、B5058。
1.2 对照样品 阴性对照采用经确认的不产生细胞毒性反应的高密度聚乙烯材料。阳性对照样品采用经确认的可重现细胞毒性反应的质量浓度为5g/L的苯酚溶液。
1.3 主要试剂MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）由苏州工业园区跃亚生物技术有限公司提供。RPMI1640培养基由美国Gibco BRL公司供应。二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），新鲜小牛血清，生理盐水等
1.4 细胞株 小鼠成纤维细胞株L929购自中国科学院细胞库。试验采用传代48－72h生长旺盛的细胞。
1.5 实验仪器和器材酶联免疫检测仪，微量可调移液器，96孔酶标板，二氧化碳培养箱，超净工作台等。
1.6 浸提液制备按每0．2g样品加入lrnl生理盐水的比例将无菌的待测样品加入生理盐水中，37℃放置72h即可制备浸提液。
1.7 细胞悬液制备将已经培养的48－72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，吸管吹打混匀后用血球计数板在显微镜下计数，根据实测细胞密度，加入适量细胞培养液配制成密度为1×104/ml的细胞悬液备用。
1.8 MTT比色法进行细胞毒性评价将制备好的细胞悬液接种于96孔培养板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和三个不同批次的样品组，每组各设6孔，每孔接种100uL细胞悬液。置于二氧化碳培养箱（5%CO2浓度）37℃培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液，样品组加入试验样品浸提液，每孔100uL，置于二氧化碳培养箱中继续培养72h。然后在显微镜下观察细胞形态，每孔加入20uL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150uL二甲基亚砜，在振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，根据国家标准GB/T 14233.2-2005[3]，细胞相对增殖率（RGR）＝（样品组吸光度值/空白对照组吸光度值）×100%。最后根据表1评定材料的细胞毒性。
2 结果
医用一次性输血器和对照组的吸光度值结果，见表2.
3 讨论
MTT比色的原理是活细胞通过代谢活动能将MTT还原，产生紫色结晶物，该结晶物可以溶解于二甲基亚砜。采用酶标仪检测MTT还原产物的吸光度，反映出活细胞的数量，通过与空白对照组的比较得到待测样品的相对增殖率，从而评价样品的细胞毒性。根据细胞毒性分级判断标准[3]，阴性反应对照组的反应应不大于1级，阳性对照组的反应至少为3级反应。本实验中，阴性对照组的反应为1级，阳性对照组的反应为4级，符合要求。样品组的反应均为1级，说明该批次医用一次性输血器无明显细胞毒性。
传统的细胞毒性测试所采用的人工血小板计数测定活细胞数的方法存在周期长，误差大的缺点。而MTT比色法具有简单、快速、灵敏、准确、经济、安全等优点[4]，更适合于用来进行大批量的生物材料细胞毒性的评价。
参考文献
[1]Ratanasathien S, Wataha JC, Hanks CT, Dennison JB. Cytotoxic interactive effects of dentin bonding components on mouse fibroblasts. J Dent Res. 1995 Sep;74(9):1602-6
[2] Nouri AM, Hussain RF, Dos Santos AV, Mansouri M, Oliver RT. Intensity of class I antigen expression on human tumour cell lines and its relevance to the efficiency of non-MHC-restricted killing. Br J Cancer. 1993 Jun;67(6):1223-8
[3] GB/T 14233.2-2005
[4] 王昕，施嬿萍，朱雪涛等.MTT法评价医用高分子材料的细胞毒性.山东生物医学工程，2003，45-47
作者单位：215002 苏州市药品检验所1
213001 常州市第三人民医院2
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
【关键词】MTT；比色法；一次性输血器；细胞毒性
Evaluation on the Cytotoxicity of Disposable blood transfusion device for Medical Use by MTT assay
ZHOU Yixin PU Xiangke
【Abstract】Objective To explore the cell toxicity of a kind of medical disposable blood transfusion apparatus. MethodsMTT colorimetric analysis, a method which can quickly assess the cell proliferation rate and the cell toxicity, was used to detect the impact on the cell proliferation rate of L929(a mouse fibroblast cell line) caused by the medical disposable transfusion device. The experiment was carried out to evaluate the cell toxicity of the transfusion set according to the biological tests standard of the People's Republic of China(RPC). Results According to cell toxicity evaluation criteria, cells cocultured with the disposable transfusion apparatus still showed high relative growth rate and the cytotoxicity is grade 1 with the reference to the national stands. ConclusionThere is no obvious toxicity to cells by using the disposable transfusion device and it will be safe to patients.
【Key words】MTT; colorimetric analysis; disposable blood transfusion device;cells toxicity
【中图分类号】R385 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)07-0023-02
医用一次性输血器是医疗行业中常用的一类医疗器械，使用量极大，由于一次性输血器直接应用于人体，其材料的安全性直接关系到患者的生命安全。医用一次性输血器一般是采用高分子材料制成的，此类医疗器械在应用于人体之前，首先要进行材料的生物安全性评价。细胞毒性反应试验是医用生物材料生物安全性评价的初步筛选试验。细胞毒性反应试验是在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它在生物安全性评价体系中是最重要的检测指标之一，是首选和必选的项目。自从1983年Mosman首次提出了一种快速评定细胞增值和细胞毒性的比色分析方法，即MTT比色法。MTT比色法最初被广泛应用于肿瘤学、免疫学等生物学相关研究[1-2]，如今已经已经成为评价医用生物材料细胞毒性的重要试验。我们参照国家关于医用生物材料生物安全性测试的标准，对抽检的医用一次性输血器的细胞毒性进行了测试评估。
1 材料与方法
1.1 待测样品医用一次性输血器来自奥雅索医疗器件（昆山）有限公司，随机抽取二个不同批次的产品进行检测，批号分别为B5051、B5058。
1.2 对照样品 阴性对照采用经确认的不产生细胞毒性反应的高密度聚乙烯材料。阳性对照样品采用经确认的可重现细胞毒性反应的质量浓度为5g/L的苯酚溶液。
1.3 主要试剂MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）由苏州工业园区跃亚生物技术有限公司提供。RPMI1640培养基由美国Gibco BRL公司供应。二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），新鲜小牛血清，生理盐水等
1.4 细胞株 小鼠成纤维细胞株L929购自中国科学院细胞库。试验采用传代48－72h生长旺盛的细胞。
1.5 实验仪器和器材酶联免疫检测仪，微量可调移液器，96孔酶标板，二氧化碳培养箱，超净工作台等。
1.6 浸提液制备按每0．2g样品加入lrnl生理盐水的比例将无菌的待测样品加入生理盐水中，37℃放置72h即可制备浸提液。
1.7 细胞悬液制备将已经培养的48－72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，吸管吹打混匀后用血球计数板在显微镜下计数，根据实测细胞密度，加入适量细胞培养液配制成密度为1×104/ml的细胞悬液备用。
1.8 MTT比色法进行细胞毒性评价将制备好的细胞悬液接种于96孔培养板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和三个不同批次的样品组，每组各设6孔，每孔接种100uL细胞悬液。置于二氧化碳培养箱（5%CO2浓度）37℃培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液，样品组加入试验样品浸提液，每孔100uL，置于二氧化碳培养箱中继续培养72h。然后在显微镜下观察细胞形态，每孔加入20uL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150uL二甲基亚砜，在振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，根据国家标准GB/T 14233.2-2005[3]，细胞相对增殖率（RGR）＝（样品组吸光度值/空白对照组吸光度值）×100%。最后根据表1评定材料的细胞毒性。
2 结果
医用一次性输血器和对照组的吸光度值结果，见表2.
3 讨论
MTT比色的原理是活细胞通过代谢活动能将MTT还原，产生紫色结晶物，该结晶物可以溶解于二甲基亚砜。采用酶标仪检测MTT还原产物的吸光度，反映出活细胞的数量，通过与空白对照组的比较得到待测样品的相对增殖率，从而评价样品的细胞毒性。根据细胞毒性分级判断标准[3]，阴性反应对照组的反应应不大于1级，阳性对照组的反应至少为3级反应。本实验中，阴性对照组的反应为1级，阳性对照组的反应为4级，符合要求。样品组的反应均为1级，说明该批次医用一次性输血器无明显细胞毒性。
传统的细胞毒性测试所采用的人工血小板计数测定活细胞数的方法存在周期长，误差大的缺点。而MTT比色法具有简单、快速、灵敏、准确、经济、安全等优点[4]，更适合于用来进行大批量的生物材料细胞毒性的评价。
参考文献
[1]Ratanasathien S, Wataha JC, Hanks CT, Dennison JB. Cytotoxic interactive effects of dentin bonding components on mouse fibroblasts. J Dent Res. 1995 Sep;74(9):1602-6
[2] Nouri AM, Hussain RF, Dos Santos AV, Mansouri M, Oliver RT. Intensity of class I antigen expression on human tumour cell lines and its relevance to the efficiency of non-MHC-restricted killing. Br J Cancer. 1993 Jun;67(6):1223-8
[3] GB/T 14233.2-2005
[4] 王昕，施嬿萍，朱雪涛等.MTT法评价医用高分子材料的细胞毒性.山东生物医学工程，2003，45-47
作者单位：215002 苏州市药品检验所1
213001 常州市第三人民医院2
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