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[摘要] 目的 研究URP1基因在肺癌组织中的表达及其意义。 方法 应用免疫组化SP法检测152例肺癌组织和152例配对癌旁正常肺组织中的URP1表达情况。 结果 URP1基因在肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织（P<0.05），在非小细胞肺癌中高表达，在小细胞肺癌中低表达；URP1在鳞癌的表达高于腺癌（P<0.05）和大细胞癌（P<0.05），腺癌与大细胞癌之间比较差异无统计学意义（P>0.05）；URP1基因表达水平与鳞癌的分化程度呈正相关（P<0.05）。结论 URP1基因参与肺癌的发生及发展过程。
[关键词] 肺肿瘤；基因表达；URP1；免疫组化；整合素
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）16-0004-03
[Abstract] Objective To study the expression and significance of URP1 gene in lung cancer tissues. Methods Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of URP1 in 152 cases of lung cancer tissues and 152 cases of paired paracancer normal lung tissues. Results The expression of URP1 in lung cancer tissues was significantly higher than that in normal lung tissues （P<0.05）. URP1 was highly expressed in non-small cell lung cancer and was lowly expressed in small cell lung cancer.The expression of URP1 in squamous cell carcinoma was higher than that in adenocarcinoma（P<0.05） and large cell carcinoma （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of UPR1 between adenocarcinoma and large cell carcinoma.The expression level of URP1 protein was positively correlated with the degree of differentiation of squamous cell carcinoma（P<0.05）. Conclusion URP1 gene is involved in the development and progression of lung cancer.
[Key words] Lung neoplasms； Gene expression； URP1； Immunohistochemistry； Integrin
肺癌作為严重危害人类健康的最常见恶性肿瘤，在我国癌症死因构成比中已超过20%，且发病率和死亡率一直呈上升趋势[1]；肺癌起源于肺泡上皮细胞和支气管黏膜柱状上皮细胞，其发展过程中机体多种基因和蛋白异常表达，并起促进作用[2]。URP1是新近研究证实的整合素激活分子，其可能具有调节整合素的作用，并促进细胞间黏附作用的改变，从而影响肿瘤的发生发展[3]。本实验应用免疫组化法检测正常肺组织及肺癌组织中的URP1表达，以探讨URP1基因表达与肺癌发生及发展的关系。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择2014年11月～2016年12月我院胸外科手术切除留取的新鲜肺癌组织及配对癌旁正常肺组织用于免疫组织化学染色分析，经病理学医师确诊后纳入。共入组152例，其中男83例，女69例；鳞癌65例，腺癌43例，大细胞癌21例，小细胞癌23例，术前均无化疗和放射治疗史，所有样本进行URP1基因免疫组织化学染色。
1.2 免疫组织化学法
采用URP1兔抗人多克隆抗体U1610-01（1∶1000美国United States Biological公司，Swampscott，MA）和Dako二步法抗兔免疫组织化学检测试剂盒（EnVision /HRP/Rb；显色剂：Dako Liquid DAB Substrate Chromogen System）进行检测。实验步骤：将石蜡切片脱蜡水化，过氧化氢消除内源性过氧化物酶后进行抗原修复（高压热修复法），滴入URP1兔抗人多克隆抗体，孵化过夜，洗涤，加入二抗，洗涤，苏木素复染，脱水，封片，镜检。
1.3 结果评定标准
采用染色广度及强度双评分标准评估蛋白表达[4]：染色广度计算染色细胞所占比例，染色深度分为4级0～3 。阴性：染色广度<10%；弱阳性：深度1 /广度<50%或深度2 /广度<30%；中等阳性：深度2 /广度30%～60%或深度3 /广度<30%；强阳性：深度2 /广度>60%或深度3 /广度>30%。阴性和弱阳性为低表达，中等阳性和强阳性为高表达。
1.4 统计学方法
使用SPSS 14.0统计分析软件，计数资料采用χ2检验，对于理论频数<5时，采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 URP1基因在正常肺组织和肺癌组织中的表达
URP1基因在正常肺组织和肺癌组织中的表达：URP1基因阳性表达呈棕黄色，其在肺癌组织和正常肺组织中的阳性表达率分别为53.3%（81/152）和8.6%（13/152），两者之间比较差异有统计学意义（χ2=69.5，P<0.05）。 2.2 URP1基因在不同病理类型肺癌组织中的表达
URP1基因在非小细胞癌的阳性表达率均高于小细胞癌（χ2=10.4，P<0.05）；在非小细胞肺癌亚型中，URP1基因阳性表达率：鳞癌大于腺癌（χ2=9.7，P<0.05）及大细胞癌（χ2=8.9，P<0.05），差异有统计学意义，大细胞癌与腺癌之间差异无统计学意义（χ2=0.2，P>0.05）。见表1。
2.3 URP1基因在高、中、低分化程度的肺癌组织中的表达
高、中、低分化鳞癌之间URP1基因阳性表达率差异有统计学意义（χ2=25.4，P<0.05），高分化鳞癌URP1基因阳性表达率高于中分化鳞癌（χ2=4.6，P<0.05），中分化鳞癌表达阳性率高于低分化鳞癌（χ2=4.8，P<0.05），分化越好者URP1基因表达阳性率越高。但腺癌分化程度与URP1基因阳性表达率之间差异无统计学意义（χ2=0.09，P>0.05）。见表2。
3 讨论
整合素分子是一种细胞黏附受体，在细胞黏附、细胞迁移、胚胎发育、损伤修复等过程中发挥关键作用，通过介导细胞外基质与细胞及细胞与细胞间的黏附作用，直接刺激细胞增殖、抑制凋亡并介导血管生成等过程，参与肿瘤的生长与发展[5-7]。
URP1是新近研究证实的整合素激活分子，位于染色体20p12.3，与新杆状线虫中的UNC-112蛋白同源，在整合素活化中发挥重要作用，参与整合素的双向信号传导[8，9]。近些年其与肿瘤的关系逐渐被揭示，Kloeker[10]研究显示URP1基因在70%的结肠癌和60%的肺癌中表达上调，定量PCR检测其在结肠癌表达上调4倍以上，肺癌表达上调60倍以上，国内研究也表明URP1基因mRNA和蛋白表达在结肠癌中均上调，提示URP1基因参与结肠癌发生发展，并与肿瘤转移相关[11]。
本研究通过免疫组织化学技术检测不同病理类型肺癌中URP1基因表达，发现URP1基因在肺癌组织表达明显高于正常肺组织，证实UPR1基因参与了肺癌的发生发展过程，其机制可能与依赖TGF-β信号通路的EMT上皮间质转化（EMT）有关，EMT在肿瘤的复发与转移过程中扮演着重要的作用[12]，URP1基因FERM功能域可与整合素B亚单位结合，形成黏着斑复合物，并通过TGF-β信号通路调控EMT，从而促进肺癌的发生和发展[4]。
肺癌按病理组织学可分两大类：小细胞癌和非小细胞癌，其中小细胞癌占比接近20%，非小细胞癌占比超过80%，非小细胞癌又包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，鳞癌、腺癌又可分为高分化、中分化、低分化，不同病理分化类型的肺癌的治疗及预后存在差异，分化越低其生长速度越快，越早出现转移，预后越差[13]。通过本实验我们发现不同病理类型的肺癌组织URP1阳性表达率也存在差异：鳞癌>腺癌>小细胞癌，揭示URP1基因表达可能与肺癌细胞起源相关联，起源于上皮细胞的鳞癌、腺癌阳性表达率高，而神经内分泌起源的小细胞癌阳性表达率低，另一方面，高分化鳞癌的URP1基因阳性表达率高于中分化鳞癌 ，中分化鳞癌表达阳性率高于低分化鳞癌，分化越好者URP1基因表達阳性率越高，提示URP1基因可能影响肺癌细胞的机动性、趋化性及侵袭性，URP1高表达的肿瘤侵袭、迁移能力相对较弱，恶性程度相对较低，反之亦然，其具体调节机制尚需进一步研究。
[参考文献]
[1] 陈万青，张思维，曾红梅，等. 中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 中国肿瘤，2014，23（1）：1-10.
[2] 赫捷，陈万青. 2012年中国肿瘤登记年报[M]. 北京：军事医学科学出版社，2012：60-62.
[3] Jemal A，Siegel R，Xu J，et al. Cancer statistics，2010[J]. CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
[4] 樊军卫，王兆文，唐华美，等.UNC-112相关蛋白1基因在结肠癌中的表达及其意义[J]. 中华实验外科杂志，2010，27：597-599.
[5] Kanpanagiotou EM，Dilana KD，Gkiozos I，et al. Metastin is not involved in metastatic potential of non-small cell lung cancer[J].Medical Oncology，2011，28（2）：559-564.
[6] Souza MA，Kimble RM，McMillan JR，et al.Kindler syndrome pathogenesis and fermitin family homologue 1（kindlin-1）function[J].Dermatol Clin，2010，28：115-118.
[7] Schaller MD.UNC-112，A new regulator of cell-extracellular matrix adhesions？[J]. J Cell Biol，2000，150：F9-F11.
[8] Qadota H，Moerman DG，Benian GM. A molecular mechanism for the requirement of PAT4（integrin-linked kinase（ILK） for the localization of UNC-112（Kindlin） to integrin adhesion sites[J].J Biol Chem，2012，287：28537-28551.
[9] Moser M，Legate KR，Zent R，et al.The tail of intergrins，talin，and kindlins[J].Science，2009，324（5929）：895-899.
[10] Kloeker S，Major MB，Calderwood DA，et al. The kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin—mediated adhesion[J].J Biol Chem，2004，279（8）：6824-6833.
[11] Harburger DS，Calderwood DA. Integrin signalling at a glance[J].J CeU Sci，2009，122（2）：159-163.
[12] Weinstein EJ，Boumer M，Head R，et al.URPl：A member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas[J].Biochim Biophys Acta，2003，1637（3）：207-216.
[13] Sin S，Bonin F，Petit V，et al.Role of the focal adhesion protein kindlin-1 in breast cancer growth and lung metastasis[J].J Natl Cancer Inst，2011，103（17）：1323-1337.
[14] Margadant C，Sonnenberg A.Integrin-TGF-B crosstalk in fibrosis，cancer and wound healing[J].EMBO Pep，2010， 11（2）：97-105.
[15] Travis WD，Travis LB，Devesa SS. Lung cancer[J]. Cancer，1995，75（1 Suppl）：191-202.
（收稿日期：2017-04-05）
[关键词] 肺肿瘤；基因表达；URP1；免疫组化；整合素
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）16-0004-03
[Abstract] Objective To study the expression and significance of URP1 gene in lung cancer tissues. Methods Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of URP1 in 152 cases of lung cancer tissues and 152 cases of paired paracancer normal lung tissues. Results The expression of URP1 in lung cancer tissues was significantly higher than that in normal lung tissues （P<0.05）. URP1 was highly expressed in non-small cell lung cancer and was lowly expressed in small cell lung cancer.The expression of URP1 in squamous cell carcinoma was higher than that in adenocarcinoma（P<0.05） and large cell carcinoma （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of UPR1 between adenocarcinoma and large cell carcinoma.The expression level of URP1 protein was positively correlated with the degree of differentiation of squamous cell carcinoma（P<0.05）. Conclusion URP1 gene is involved in the development and progression of lung cancer.
[Key words] Lung neoplasms； Gene expression； URP1； Immunohistochemistry； Integrin
肺癌作為严重危害人类健康的最常见恶性肿瘤，在我国癌症死因构成比中已超过20%，且发病率和死亡率一直呈上升趋势[1]；肺癌起源于肺泡上皮细胞和支气管黏膜柱状上皮细胞，其发展过程中机体多种基因和蛋白异常表达，并起促进作用[2]。URP1是新近研究证实的整合素激活分子，其可能具有调节整合素的作用，并促进细胞间黏附作用的改变，从而影响肿瘤的发生发展[3]。本实验应用免疫组化法检测正常肺组织及肺癌组织中的URP1表达，以探讨URP1基因表达与肺癌发生及发展的关系。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择2014年11月～2016年12月我院胸外科手术切除留取的新鲜肺癌组织及配对癌旁正常肺组织用于免疫组织化学染色分析，经病理学医师确诊后纳入。共入组152例，其中男83例，女69例；鳞癌65例，腺癌43例，大细胞癌21例，小细胞癌23例，术前均无化疗和放射治疗史，所有样本进行URP1基因免疫组织化学染色。
1.2 免疫组织化学法
采用URP1兔抗人多克隆抗体U1610-01（1∶1000美国United States Biological公司，Swampscott，MA）和Dako二步法抗兔免疫组织化学检测试剂盒（EnVision /HRP/Rb；显色剂：Dako Liquid DAB Substrate Chromogen System）进行检测。实验步骤：将石蜡切片脱蜡水化，过氧化氢消除内源性过氧化物酶后进行抗原修复（高压热修复法），滴入URP1兔抗人多克隆抗体，孵化过夜，洗涤，加入二抗，洗涤，苏木素复染，脱水，封片，镜检。
1.3 结果评定标准
采用染色广度及强度双评分标准评估蛋白表达[4]：染色广度计算染色细胞所占比例，染色深度分为4级0～3 。阴性：染色广度<10%；弱阳性：深度1 /广度<50%或深度2 /广度<30%；中等阳性：深度2 /广度30%～60%或深度3 /广度<30%；强阳性：深度2 /广度>60%或深度3 /广度>30%。阴性和弱阳性为低表达，中等阳性和强阳性为高表达。
1.4 统计学方法
使用SPSS 14.0统计分析软件，计数资料采用χ2检验，对于理论频数<5时，采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 URP1基因在正常肺组织和肺癌组织中的表达
URP1基因在正常肺组织和肺癌组织中的表达：URP1基因阳性表达呈棕黄色，其在肺癌组织和正常肺组织中的阳性表达率分别为53.3%（81/152）和8.6%（13/152），两者之间比较差异有统计学意义（χ2=69.5，P<0.05）。 2.2 URP1基因在不同病理类型肺癌组织中的表达
URP1基因在非小细胞癌的阳性表达率均高于小细胞癌（χ2=10.4，P<0.05）；在非小细胞肺癌亚型中，URP1基因阳性表达率：鳞癌大于腺癌（χ2=9.7，P<0.05）及大细胞癌（χ2=8.9，P<0.05），差异有统计学意义，大细胞癌与腺癌之间差异无统计学意义（χ2=0.2，P>0.05）。见表1。
2.3 URP1基因在高、中、低分化程度的肺癌组织中的表达
高、中、低分化鳞癌之间URP1基因阳性表达率差异有统计学意义（χ2=25.4，P<0.05），高分化鳞癌URP1基因阳性表达率高于中分化鳞癌（χ2=4.6，P<0.05），中分化鳞癌表达阳性率高于低分化鳞癌（χ2=4.8，P<0.05），分化越好者URP1基因表达阳性率越高。但腺癌分化程度与URP1基因阳性表达率之间差异无统计学意义（χ2=0.09，P>0.05）。见表2。
3 讨论
整合素分子是一种细胞黏附受体，在细胞黏附、细胞迁移、胚胎发育、损伤修复等过程中发挥关键作用，通过介导细胞外基质与细胞及细胞与细胞间的黏附作用，直接刺激细胞增殖、抑制凋亡并介导血管生成等过程，参与肿瘤的生长与发展[5-7]。
URP1是新近研究证实的整合素激活分子，位于染色体20p12.3，与新杆状线虫中的UNC-112蛋白同源，在整合素活化中发挥重要作用，参与整合素的双向信号传导[8，9]。近些年其与肿瘤的关系逐渐被揭示，Kloeker[10]研究显示URP1基因在70%的结肠癌和60%的肺癌中表达上调，定量PCR检测其在结肠癌表达上调4倍以上，肺癌表达上调60倍以上，国内研究也表明URP1基因mRNA和蛋白表达在结肠癌中均上调，提示URP1基因参与结肠癌发生发展，并与肿瘤转移相关[11]。
本研究通过免疫组织化学技术检测不同病理类型肺癌中URP1基因表达，发现URP1基因在肺癌组织表达明显高于正常肺组织，证实UPR1基因参与了肺癌的发生发展过程，其机制可能与依赖TGF-β信号通路的EMT上皮间质转化（EMT）有关，EMT在肿瘤的复发与转移过程中扮演着重要的作用[12]，URP1基因FERM功能域可与整合素B亚单位结合，形成黏着斑复合物，并通过TGF-β信号通路调控EMT，从而促进肺癌的发生和发展[4]。
肺癌按病理组织学可分两大类：小细胞癌和非小细胞癌，其中小细胞癌占比接近20%，非小细胞癌占比超过80%，非小细胞癌又包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，鳞癌、腺癌又可分为高分化、中分化、低分化，不同病理分化类型的肺癌的治疗及预后存在差异，分化越低其生长速度越快，越早出现转移，预后越差[13]。通过本实验我们发现不同病理类型的肺癌组织URP1阳性表达率也存在差异：鳞癌>腺癌>小细胞癌，揭示URP1基因表达可能与肺癌细胞起源相关联，起源于上皮细胞的鳞癌、腺癌阳性表达率高，而神经内分泌起源的小细胞癌阳性表达率低，另一方面，高分化鳞癌的URP1基因阳性表达率高于中分化鳞癌 ，中分化鳞癌表达阳性率高于低分化鳞癌，分化越好者URP1基因表達阳性率越高，提示URP1基因可能影响肺癌细胞的机动性、趋化性及侵袭性，URP1高表达的肿瘤侵袭、迁移能力相对较弱，恶性程度相对较低，反之亦然，其具体调节机制尚需进一步研究。
[参考文献]
[1] 陈万青，张思维，曾红梅，等. 中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 中国肿瘤，2014，23（1）：1-10.
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[6] Souza MA，Kimble RM，McMillan JR，et al.Kindler syndrome pathogenesis and fermitin family homologue 1（kindlin-1）function[J].Dermatol Clin，2010，28：115-118.
[7] Schaller MD.UNC-112，A new regulator of cell-extracellular matrix adhesions？[J]. J Cell Biol，2000，150：F9-F11.
[8] Qadota H，Moerman DG，Benian GM. A molecular mechanism for the requirement of PAT4（integrin-linked kinase（ILK） for the localization of UNC-112（Kindlin） to integrin adhesion sites[J].J Biol Chem，2012，287：28537-28551.
[9] Moser M，Legate KR，Zent R，et al.The tail of intergrins，talin，and kindlins[J].Science，2009，324（5929）：895-899.
[10] Kloeker S，Major MB，Calderwood DA，et al. The kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin—mediated adhesion[J].J Biol Chem，2004，279（8）：6824-6833.
[11] Harburger DS，Calderwood DA. Integrin signalling at a glance[J].J CeU Sci，2009，122（2）：159-163.
[12] Weinstein EJ，Boumer M，Head R，et al.URPl：A member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas[J].Biochim Biophys Acta，2003，1637（3）：207-216.
[13] Sin S，Bonin F，Petit V，et al.Role of the focal adhesion protein kindlin-1 in breast cancer growth and lung metastasis[J].J Natl Cancer Inst，2011，103（17）：1323-1337.
[14] Margadant C，Sonnenberg A.Integrin-TGF-B crosstalk in fibrosis，cancer and wound healing[J].EMBO Pep，2010， 11（2）：97-105.
[15] Travis WD，Travis LB，Devesa SS. Lung cancer[J]. Cancer，1995，75（1 Suppl）：191-202.
（收稿日期：2017-04-05）