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摘要：目的： 分别通过超声乳化法和超声初乳化结合SPG微膜乳化法制备非载药微泡超声造影剂。方法： 分别通过超声乳化法和超声初乳化结合SPG微膜乳化法进行非载药微泡制备的研究。 结果： 两种方法都能够制备出粒径适合的微泡超声造影剂，但超声初乳化结合SPG微膜乳化法制备的微泡粒径均匀度上要优于超声乳化法制备的微泡。结论： 超声乳法结合SPG微膜乳化法制备超声微泡造影剂具有更好的均匀度，适合于载药超声造影剂的制备。
关键词： 超声微泡造影剂；外消旋聚乳酸；超声乳化法；SPG微膜乳化技术
聚乳酸（PLA）以其所特有的良好的生物相容性和生物降解性而得到了广泛的研究，尤其是在生物医学领域，如医用可吸收缝合线、骨科固定装置以及组织工程支架和药物释放系统。由于结晶上的不同聚乳酸可分为右旋聚乳酸（PDLA），左旋聚乳酸（PLLA）和外消旋聚乳酸（PDLLA）。PDLLA降解和吸收速度较快，有利于药物均匀分布在基质中，因此非常适合于药物释放系统，主要作药物控缓释的载体和软组织修复材料[1-3]。复乳溶剂蒸发法是在药物释放系统应用很广的一种包囊技术，尤其适用于水溶性的化学类药物以及蛋白类药物，既避免了大量有机溶剂的毒性，也可以防止生物活性分子、蛋白类等药物在包囊过程中变性而影响药效，而且这种方法也适用于高分子聚合材料超声微泡造影剂的制备[4-8]。20世纪80年代后期，Nakashima等人[9]首次利用SPG（Shirasu Porous Glass）成功制备了粒径均一的煤油/水以及水/煤油的乳液滴。自此之后，膜乳化技术作为一种崭新的乳化技术日益受到各国学者的关注并得到了很大的发展。本文的研究设法对W/O/W复乳溶剂蒸发法进行了改进，在复乳制备过程中引入了SPG膜乳化技术，以其代替机械搅拌、超声、均质等传统乳化工艺用于复乳液的制备，以期得到粒径均一的载药超声造影剂微囊。
1.实验方法
1.1超声W/O/W复乳法制备PDLLA微泡造影剂条件研究
制备流程：超声波作用下将内水相用1ml医用注射器匀速注入溶解有PDLLA和1.0%Span80的10ml外油相中形成W/O初乳液后，用10ml的医用注射器匀速将W/O初乳液注入超声波作用下的含有1.0%吐温80乳化剂的外水相中形成W/O/W复乳液，将复乳液倾倒入1.0%PVA为稳定剂的外水相中，40℃恒温持续100rpm/min低速磁力搅拌过夜，使油相完全挥发，PDLLA固化成包膜，3000g离心10min，收集微泡沉淀，纯净水洗涤三次后，真空冷冻干燥。扫描电子显微境下观测微泡直径及均匀度。
1.2超声W/O/W复乳法结合SPG膜乳化器法制备PDLLA超声微泡造影剂
制备流程：超声波作用下将内水相用1ml医用注射器匀速注入溶解有PDLLA的10ml外油相中形成W/O初乳液后，将此初乳液倾入已清洗干净的微膜乳化器压力舱中，选择孔径为1.1m的SPG膜，以高压高纯氮气提供压力，设置压力参数分别为25kpa，50kpa，100kpa，打开循环泵使分散相1.0%PVA水溶液循环起来，打开通道阀，使初乳液匀速通过SPG膜进入分散相中形成复乳液，复乳液经40℃恒温100rpm/min低速磁力搅拌過夜，使油相溶剂充分挥发，PDLLA固化成微膜。3000g离心10min收集微泡沉淀，真空冷冻干燥后，充入空气，扫描电子显微镜检测微泡粒径及均匀度。
2.结果与分析
2.1复乳液制备超声波功率？时间对微泡粒径的影响
其他参数恒定的条件下，各复乳液超声功率时间恒定为200W10S，微泡粒径分布如图1，可见复乳超声功率时间与微泡粒径大小紧密相关。
2.3超声波初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA微泡研究
根据超声乳化法制备初乳液实验，选择以80W？10S？10次的超声方式制备10ml初乳液体系，再用高纯氮气将此初乳液压过SPG微膜进入分散液中获得适当粒径的W/O/W复乳，挥发形成固化的微泡。制备的微泡粒径大小主要与SPG膜的孔径和氮气压力相关。在压力较小（25kpa）的条件下，初乳液不能顺利的匀速通过SPG膜，虽然制备的微泡均匀度较好，但粒径大小不甚理想，在压力较大（100kpa）的条件下，制备的微泡均匀度较好，但粒径偏大。在50kpa的压力下制备的微泡，其粒径大小及均匀度都较好。
3.讨论与小结
通过超声W/O/W复乳法制备超声微泡造影剂的实验研究，本研究总结出超声初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA微泡方法制备的微泡粒径均匀度上要高于超声W/O/W复乳法制备的微泡。
由图2可知，超声初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA超声微泡造影剂粒径分布较超声W/O/W复乳法制备的超声微泡造影剂均匀度高出很多。其中93.6%的微泡平均粒径为4.124？m，6.4%的微泡平均粒径为274nm，没有微泡粒径超过7m。
综合超声造影剂的两个制备方法，本文研究认为超声乳法结合SPG微膜乳化法制备PDLLA超声微泡造影剂具有更好的均匀度，适合于载药超声造影剂的制备。
参考文献：
[1] 郭圣荣. 医药用生物降解性高分子材料[M]. 北京： 化学工业出版社， 2004.
[2] 王晓波. 药物运释系统[M]. 北京：中国医药科技出版社， 2007.
[3] Feril LB Jr， Tachibana K. Use of ultrasound in drug delivery systems： emphasis on experimental methodology and mechanisms[J]. Int J Hyperthermia， 2012， 28（4）： 282-289.
[4] Nomikou N， McHale AP. Exploiting ultrasound-mediated effects in delivering targeted， site-specific cancer therapy[J]. Cancer Lett， 2010， 296（2）： 133-143.
[5] Vrancken， M. N.； Hove.； Claeys， D. A. Method for encapsulating water and compounds in aqueous phase by extraction[P]. United states patent office. 3523907， 1970.
[6] Baseri B， Choi JJ， Deffieux T， et al. Activation of signaling pathways following localizeddelivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles[J]. Phys Med Biol， 2012， 57（7）： 65-81.
[7] 冉海涛，任红，王志刚等.一种新型高分子聚合材料超声微泡造影剂的制备与体外显影实验.[J].中华超声影像学杂志.2005，10，774-776.
[8] Feril LB Jr， Tachibana K. Use of ultrasound in drug delivery systems： emphasis on experimental methodology and mechanisms[J]. Int J Hyperthermia， 2012， 28（4）： 282-289.
[9] Rong Liu，Guang Hui Ma，Fan-Tao Meng，et al. Preparation of uniform-sized PLA microcapsules by combining Shirasu Porous Glass membrane emulsification technique and multiple emulsion-solvent evaporation method[J].Journal of Controlled Release，2005，103：31-43.
关键词： 超声微泡造影剂；外消旋聚乳酸；超声乳化法；SPG微膜乳化技术
聚乳酸（PLA）以其所特有的良好的生物相容性和生物降解性而得到了广泛的研究，尤其是在生物医学领域，如医用可吸收缝合线、骨科固定装置以及组织工程支架和药物释放系统。由于结晶上的不同聚乳酸可分为右旋聚乳酸（PDLA），左旋聚乳酸（PLLA）和外消旋聚乳酸（PDLLA）。PDLLA降解和吸收速度较快，有利于药物均匀分布在基质中，因此非常适合于药物释放系统，主要作药物控缓释的载体和软组织修复材料[1-3]。复乳溶剂蒸发法是在药物释放系统应用很广的一种包囊技术，尤其适用于水溶性的化学类药物以及蛋白类药物，既避免了大量有机溶剂的毒性，也可以防止生物活性分子、蛋白类等药物在包囊过程中变性而影响药效，而且这种方法也适用于高分子聚合材料超声微泡造影剂的制备[4-8]。20世纪80年代后期，Nakashima等人[9]首次利用SPG（Shirasu Porous Glass）成功制备了粒径均一的煤油/水以及水/煤油的乳液滴。自此之后，膜乳化技术作为一种崭新的乳化技术日益受到各国学者的关注并得到了很大的发展。本文的研究设法对W/O/W复乳溶剂蒸发法进行了改进，在复乳制备过程中引入了SPG膜乳化技术，以其代替机械搅拌、超声、均质等传统乳化工艺用于复乳液的制备，以期得到粒径均一的载药超声造影剂微囊。
1.实验方法
1.1超声W/O/W复乳法制备PDLLA微泡造影剂条件研究
制备流程：超声波作用下将内水相用1ml医用注射器匀速注入溶解有PDLLA和1.0%Span80的10ml外油相中形成W/O初乳液后，用10ml的医用注射器匀速将W/O初乳液注入超声波作用下的含有1.0%吐温80乳化剂的外水相中形成W/O/W复乳液，将复乳液倾倒入1.0%PVA为稳定剂的外水相中，40℃恒温持续100rpm/min低速磁力搅拌过夜，使油相完全挥发，PDLLA固化成包膜，3000g离心10min，收集微泡沉淀，纯净水洗涤三次后，真空冷冻干燥。扫描电子显微境下观测微泡直径及均匀度。
1.2超声W/O/W复乳法结合SPG膜乳化器法制备PDLLA超声微泡造影剂
制备流程：超声波作用下将内水相用1ml医用注射器匀速注入溶解有PDLLA的10ml外油相中形成W/O初乳液后，将此初乳液倾入已清洗干净的微膜乳化器压力舱中，选择孔径为1.1m的SPG膜，以高压高纯氮气提供压力，设置压力参数分别为25kpa，50kpa，100kpa，打开循环泵使分散相1.0%PVA水溶液循环起来，打开通道阀，使初乳液匀速通过SPG膜进入分散相中形成复乳液，复乳液经40℃恒温100rpm/min低速磁力搅拌過夜，使油相溶剂充分挥发，PDLLA固化成微膜。3000g离心10min收集微泡沉淀，真空冷冻干燥后，充入空气，扫描电子显微镜检测微泡粒径及均匀度。
2.结果与分析
2.1复乳液制备超声波功率？时间对微泡粒径的影响
其他参数恒定的条件下，各复乳液超声功率时间恒定为200W10S，微泡粒径分布如图1，可见复乳超声功率时间与微泡粒径大小紧密相关。
2.3超声波初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA微泡研究
根据超声乳化法制备初乳液实验，选择以80W？10S？10次的超声方式制备10ml初乳液体系，再用高纯氮气将此初乳液压过SPG微膜进入分散液中获得适当粒径的W/O/W复乳，挥发形成固化的微泡。制备的微泡粒径大小主要与SPG膜的孔径和氮气压力相关。在压力较小（25kpa）的条件下，初乳液不能顺利的匀速通过SPG膜，虽然制备的微泡均匀度较好，但粒径大小不甚理想，在压力较大（100kpa）的条件下，制备的微泡均匀度较好，但粒径偏大。在50kpa的压力下制备的微泡，其粒径大小及均匀度都较好。
3.讨论与小结
通过超声W/O/W复乳法制备超声微泡造影剂的实验研究，本研究总结出超声初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA微泡方法制备的微泡粒径均匀度上要高于超声W/O/W复乳法制备的微泡。
由图2可知，超声初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA超声微泡造影剂粒径分布较超声W/O/W复乳法制备的超声微泡造影剂均匀度高出很多。其中93.6%的微泡平均粒径为4.124？m，6.4%的微泡平均粒径为274nm，没有微泡粒径超过7m。
综合超声造影剂的两个制备方法，本文研究认为超声乳法结合SPG微膜乳化法制备PDLLA超声微泡造影剂具有更好的均匀度，适合于载药超声造影剂的制备。
参考文献：
[1] 郭圣荣. 医药用生物降解性高分子材料[M]. 北京： 化学工业出版社， 2004.
[2] 王晓波. 药物运释系统[M]. 北京：中国医药科技出版社， 2007.
[3] Feril LB Jr， Tachibana K. Use of ultrasound in drug delivery systems： emphasis on experimental methodology and mechanisms[J]. Int J Hyperthermia， 2012， 28（4）： 282-289.
[4] Nomikou N， McHale AP. Exploiting ultrasound-mediated effects in delivering targeted， site-specific cancer therapy[J]. Cancer Lett， 2010， 296（2）： 133-143.
[5] Vrancken， M. N.； Hove.； Claeys， D. A. Method for encapsulating water and compounds in aqueous phase by extraction[P]. United states patent office. 3523907， 1970.
[6] Baseri B， Choi JJ， Deffieux T， et al. Activation of signaling pathways following localizeddelivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles[J]. Phys Med Biol， 2012， 57（7）： 65-81.
[7] 冉海涛，任红，王志刚等.一种新型高分子聚合材料超声微泡造影剂的制备与体外显影实验.[J].中华超声影像学杂志.2005，10，774-776.
[8] Feril LB Jr， Tachibana K. Use of ultrasound in drug delivery systems： emphasis on experimental methodology and mechanisms[J]. Int J Hyperthermia， 2012， 28（4）： 282-289.
[9] Rong Liu，Guang Hui Ma，Fan-Tao Meng，et al. Preparation of uniform-sized PLA microcapsules by combining Shirasu Porous Glass membrane emulsification technique and multiple emulsion-solvent evaporation method[J].Journal of Controlled Release，2005，103：31-43.