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[摘要] 目的 研究高脂饮食喂养小鼠内脏脂肪和皮下脂肪组织中PAI-1、FOXC2及FOXO1表达水平，探讨不同类型肥胖的机制。 方法 20只小鼠随机分为对照组和高脂组，分别给予正常饮食和高脂饮食喂养12周。测定血清PAI-1以及附睾周围组织及皮下脂肪中PAI-1、FOXC2及FOXO1 mRNA的表达水平。 结果 高脂组小鼠体质量、血清PAI-1水平均显著高于对照组。组内比较小鼠附睾周围脂肪组织PAI-1、FOXC2mRNA表达显著高于皮下脂肪组织；FOXO1mRNA表达显著低于于皮下脂肪组织，差异有统计学意义。 结论 正常体重小鼠和肥胖小鼠血清PAI-1水平表达不同，内脏脂肪和皮下脂肪PAI-1、FOXC2及FOXO1表达也存在差别，这种差别可能是不同类型肥胖的机制之一。
[关键词] 血浆纤溶酶原激活物抑制物-1；FOXC2；FOXO1
[中图分类号] R589.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）16-26-04
Study of expression of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in adipose tissue of mice with high fat diet
LIU Yali1 YI Jiali2 LIU Jianhui3 NIU Lifeng3
1.Health Inspection Faculty Working Office of Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China；2.Dean's Office of Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China；3.Department of Inspection Technology， Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China
[Abstract] Objective To study the expression level of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in high fat diet of visceral fat and subcutaneous fat tissue，and to investigate the mechanism of different types of obesity. Methods 20 mouse were randomLy divided into control group and high fat group， and given normal diet and high fat diet for 12 weeks. Serum PAI-1，the expression level of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 mRNA in epididymal tissue and subcutaneous fat were determined. Results The body weight， serum PAI-1 levels of high fat group were significantly higher than those of the control group. Within the group， PAI-1，FOXC2， mRNA expression of mouse epididymal adipose tissue were significantly higher than those of the subcutaneous adipose tissue， and the expression of FOXO1mRNA of mouse epididymal adipose tissue was significantly lower than that of subcutaneous adipose tissue， with statistical significance difference. Conclusion Expression levels of serum PAI-1 are different between normal weight mice and obese mice，and expression of fat PAI-1， FOXC2and FOXO1 in visceral fat and subcutaneous are also different.This difference may be one of the mechanisms of different types of obesity.
[Key words] Plasminogen activator inhibitor -1； FOXC2； FOXO1
隨着生活方式和饮食习惯的改变，肥胖已成为全球的常见病，而与肥胖相关的冠心病、高血压、2型糖尿病等许多代谢性疾病则成为严重危害人类健康的杀手。研究发现[1]肥胖者脂肪堆积部位的差异强烈影响上述疾病的发病风险，与外周肥胖相比，腹型肥胖（内脏肥胖，即内脏脂肪过度堆积）更易造成胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱和心血管疾病。因此，关于不同部位脂肪组织差异性的研究对于揭示相关疾病的发病机制具有重要作用。血浆纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）是一种由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子[2]，PAI-1水平的升高将直接导致纤溶活性受损，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关[3]。近来发现的翼状螺旋叉头转录因子家族的叉头框（Forkhead box）蛋白C2（FOXC2）和叉头框蛋白O1（FOXO1）在调控胰岛素诱导的PAI-1表达方面发挥重要作用，但具体的调控机制尚不明确。因此，本研究以肥胖小鼠的内脏脂肪和皮下脂肪为研究对象，研究PAI-1、FOXC2及FOXO1表达水平，探讨不同类型肥胖的可能机制。 1 材料與方法
1.1 主要试剂
Triozol Reagent购于美国Invitrogen Life technologies公司，PAI-1、FOXC2及FOXO1荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，引物合成由北京华大基因公司提供。
1.2 实验动物和分组
3 讨论
小鼠在连续高脂饮食喂养后，体重逐渐增加，在第9周，与普通饮食组小鼠比较，有统计学差异（P<0.05），说明本实验高脂饮食喂养可以成功诱导C57BL/6小鼠肥胖。此造模方法与人类高脂肪、高蛋白，缺乏运动导致肥胖的过程相相似。继续喂养4周后取小鼠血清及脂肪组织，本课题的前期研究结果显示：高脂饮食诱导肥胖大鼠血清胰岛素水平升高，存在高胰岛素血症，胰岛素抵抗[5]，本实验中小鼠存在着肥胖和高胰岛素血症。
PAI-1是一种可由脂肪组织合成和分泌的细胞因子[6]，主要灭活组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），作为纤溶活性的中心环节，PAI-1水平的升高将直接导致纤溶活性受损，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关[7]本实验检测肥胖小鼠血清PAI-1水平发现，高脂组PAI-1水平升高，与对照组比较有统计学差异，肥胖小鼠存在着高胰岛素血症，胰岛素可诱导PAI-1表达，与文献报道一致。
脂肪组织作为循环中PAI-1浓度增加的主要来源，但仅仅是内脏型肥胖而非外周肥胖与PAI-1浓度显著相关，进而增加2型糖尿病、心血管疾病的易患性。并且无论肥胖与否，腹部大网膜脂肪细胞PAI-1 mRNA表达水平均高于皮下脂肪细胞[8]，那么PAI-1基因的转录调节在内脏脂肪和皮下脂肪中是否有所不同
FOXC2可调控脂肪细胞分化，调节血脂、体脂及胰岛素敏感性，减轻高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[9-11]，同时可能通过调控一系列基因表达，最终使产热增加，参与肥胖的发生。FOXC2和FOXO1在调控胰岛素诱导的PAI-1表达方面发挥重要作用。其调控过程可归纳为：胰岛素刺激FOXC2的表达，而激活的FOXC2通过结合到PAI-1启动子的胰岛素反应原件（insulin response element，IRE）和邻近Smad结合位点的叉头框结合原件（foxhead-binding element，FBE）上调PAI-1表达，在此过程中可能涉及到TGF-β/Smad信号途径[12]。FOXO1则通过抑制TGF-β/Smad信号途径抑制PAI-1表达，但在高胰岛素状态下，由于PI3K/Akt信号通路激活使下游的FOXO1磷酸化而失活，使其失去抑制TGF-β诱导的PAI-1表达[13-14]。另一方面FOXO1可通过与FOXC2竞争IRE来拮抗FOXC2而调节PAI-1启动子。研究发现PAI-1基因敲除小鼠能抵抗高脂饮食诱导的肥胖，且机体能量的消耗、胰岛素和葡萄糖的敏感性均有所增加[15]。Cederberg等[16]体外实验表明，用胰岛素或TNF来刺激小鼠脂肪细胞后，小鼠FOXO2 mRNA水平增高，而生长激素无此作用。研究显示肥胖者血浆PAI-1水平和脂肪细胞PAI-1 mRNA的表达均高于非肥胖者。
本实验通过检测肥胖小鼠不同部位脂肪组织中PAI-1、FOXC2、FOXO1mRNA的表达水平，探讨是否是脂肪细胞中FOXC2、FOXO1表达水平的差异影响PAI-1水平的表达。结果显示：肥胖小鼠附睾周围脂肪组织和皮下脂肪组织FOXC2、FOXO1的表达均有影响，可使PAI-1、FOXC2 mRNA表达水平增高，FOXO1mRNA表达降低，与对照组比较，均有统计学差异。因此，在内脏型及外周型肥胖状态下，由于内脏脂肪和皮下脂肪在FOXC2、FOXO1 mRNA表达上的差异，或者FOXC2、FOXO1对PAI-1启动子的相互竞争作用，或者两者对胰岛素反应能力的差异，导致内脏脂肪和皮下脂肪PAI-1合成和表达的不同，从而使罹患糖脂代谢紊乱和心血管疾病的风险不同。
[参考文献]
[1] 刘国良.肥胖症[J].中国实用内科杂志，2003，23（9）：513-522.
[2] 万惠，郭常辉.PAI-1与胰岛素抵抗研究进展[J].医学综述，2004，11，688-690.
[3] Serrano R，Barrenetxe J，Orbe J，et al.Tissue-specific PAI-1 gene expression and glycosylation pattern in insulin-resistant old rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297（5）：R1563-R1569.
[4] Li X，Lindquist S，Chen R，et al.Depot-specific messenger RNA expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and leptin in adipose tissue of children and adults[J].Int J Obes Lond），2007， 31（5）：820-828.
[5] 刘亚莉，张庆彤，刘莉.2型糖尿病大鼠血浆及脂肪组织抵抗素水平的研究[J].中国现代医学杂志，2010，20（24）：3728-3731.
[6] He G，Pedersen SB，Bruun JM，et al.Differences in plasminogen activator inhibitor 1 in subcutaneous versus omental adipose tissue in non-obese and obese subjects[J].Horm Metab Res，2003，35（3）：178-182. [7] Serrano R，Barrenetxe J，Orbe J，et al.Tissue-specific PAI-1 gene expression and glycosylation pattern in insulin-resistant old rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297（5）：R1563-R1569.
[8] Lefebvre AM，Laville M，Vega N，et al.Depot-specific differences in adipose tissue gene expression in lean and obese subjects[J].Diabetes，1998，47（1）：98-103.
[9] 彭晓韧，邹大进.脂肪组织FOXC2表达水平与肥胖和胰岛素抵抗的关系[J].医学研究生学报，2008，6：614-618.
[10] 念馨，卫俊杰，苏艳丹，等.内脏脂肪组织FOXC2 mRNA表达水平与2型糖尿病的关系[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（50）：9496-9500.
[11] 彭晓韧.脂肪组织FOXC2蛋白表达与肥胖和胰岛素抵抗的关系[D].上海：第二军医大学，2013.
[12] Fujita H，Kang M，Eren M，et al.Foxc2 is a common mediator of insulin and transforming growth factor beta signaling to regulate plasminogen activator inhibitor type I gene expression[J].Circ Res，2006， 98（5）：626-634.
[13] Jung YA，Lee KM，Kim MK，et al.Forkhead transcription factor FoxO1 inhibits insulin and transforming growth factor-beta-stimulated plasminogen activator inhibitor expression[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，386（4）：757-761.
[14] 王芳.代謝综合征相关基因多态性的研究进展[J].医学综述，2013，19（7）：1267-1269.
[15] Ma LJ，Mao SL，Taylor KL，et al.Prevention of obesity and insulin resistance in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1[J].Diabetes，2004，53（2）：336-346.
[16] Cerd erberg A，Gronning LM，Ahren B，et al.FOXC2 is a winged helix gene that counteracts obesity， hypertrig lyceridemia， and diet induced insulin resistance[J].Cell，2001，106（5）：563-573.
（收稿日期：2014-05-30）
[关键词] 血浆纤溶酶原激活物抑制物-1；FOXC2；FOXO1
[中图分类号] R589.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）16-26-04
Study of expression of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in adipose tissue of mice with high fat diet
LIU Yali1 YI Jiali2 LIU Jianhui3 NIU Lifeng3
1.Health Inspection Faculty Working Office of Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China；2.Dean's Office of Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China；3.Department of Inspection Technology， Liaoning Medicine Career Academy， Shenyang 110101，China
[Abstract] Objective To study the expression level of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in high fat diet of visceral fat and subcutaneous fat tissue，and to investigate the mechanism of different types of obesity. Methods 20 mouse were randomLy divided into control group and high fat group， and given normal diet and high fat diet for 12 weeks. Serum PAI-1，the expression level of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 mRNA in epididymal tissue and subcutaneous fat were determined. Results The body weight， serum PAI-1 levels of high fat group were significantly higher than those of the control group. Within the group， PAI-1，FOXC2， mRNA expression of mouse epididymal adipose tissue were significantly higher than those of the subcutaneous adipose tissue， and the expression of FOXO1mRNA of mouse epididymal adipose tissue was significantly lower than that of subcutaneous adipose tissue， with statistical significance difference. Conclusion Expression levels of serum PAI-1 are different between normal weight mice and obese mice，and expression of fat PAI-1， FOXC2and FOXO1 in visceral fat and subcutaneous are also different.This difference may be one of the mechanisms of different types of obesity.
[Key words] Plasminogen activator inhibitor -1； FOXC2； FOXO1
隨着生活方式和饮食习惯的改变，肥胖已成为全球的常见病，而与肥胖相关的冠心病、高血压、2型糖尿病等许多代谢性疾病则成为严重危害人类健康的杀手。研究发现[1]肥胖者脂肪堆积部位的差异强烈影响上述疾病的发病风险，与外周肥胖相比，腹型肥胖（内脏肥胖，即内脏脂肪过度堆积）更易造成胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱和心血管疾病。因此，关于不同部位脂肪组织差异性的研究对于揭示相关疾病的发病机制具有重要作用。血浆纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）是一种由脂肪细胞合成和分泌的细胞因子[2]，PAI-1水平的升高将直接导致纤溶活性受损，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关[3]。近来发现的翼状螺旋叉头转录因子家族的叉头框（Forkhead box）蛋白C2（FOXC2）和叉头框蛋白O1（FOXO1）在调控胰岛素诱导的PAI-1表达方面发挥重要作用，但具体的调控机制尚不明确。因此，本研究以肥胖小鼠的内脏脂肪和皮下脂肪为研究对象，研究PAI-1、FOXC2及FOXO1表达水平，探讨不同类型肥胖的可能机制。 1 材料與方法
1.1 主要试剂
Triozol Reagent购于美国Invitrogen Life technologies公司，PAI-1、FOXC2及FOXO1荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，引物合成由北京华大基因公司提供。
1.2 实验动物和分组
3 讨论
小鼠在连续高脂饮食喂养后，体重逐渐增加，在第9周，与普通饮食组小鼠比较，有统计学差异（P<0.05），说明本实验高脂饮食喂养可以成功诱导C57BL/6小鼠肥胖。此造模方法与人类高脂肪、高蛋白，缺乏运动导致肥胖的过程相相似。继续喂养4周后取小鼠血清及脂肪组织，本课题的前期研究结果显示：高脂饮食诱导肥胖大鼠血清胰岛素水平升高，存在高胰岛素血症，胰岛素抵抗[5]，本实验中小鼠存在着肥胖和高胰岛素血症。
PAI-1是一种可由脂肪组织合成和分泌的细胞因子[6]，主要灭活组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），作为纤溶活性的中心环节，PAI-1水平的升高将直接导致纤溶活性受损，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关[7]本实验检测肥胖小鼠血清PAI-1水平发现，高脂组PAI-1水平升高，与对照组比较有统计学差异，肥胖小鼠存在着高胰岛素血症，胰岛素可诱导PAI-1表达，与文献报道一致。
脂肪组织作为循环中PAI-1浓度增加的主要来源，但仅仅是内脏型肥胖而非外周肥胖与PAI-1浓度显著相关，进而增加2型糖尿病、心血管疾病的易患性。并且无论肥胖与否，腹部大网膜脂肪细胞PAI-1 mRNA表达水平均高于皮下脂肪细胞[8]，那么PAI-1基因的转录调节在内脏脂肪和皮下脂肪中是否有所不同
FOXC2可调控脂肪细胞分化，调节血脂、体脂及胰岛素敏感性，减轻高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[9-11]，同时可能通过调控一系列基因表达，最终使产热增加，参与肥胖的发生。FOXC2和FOXO1在调控胰岛素诱导的PAI-1表达方面发挥重要作用。其调控过程可归纳为：胰岛素刺激FOXC2的表达，而激活的FOXC2通过结合到PAI-1启动子的胰岛素反应原件（insulin response element，IRE）和邻近Smad结合位点的叉头框结合原件（foxhead-binding element，FBE）上调PAI-1表达，在此过程中可能涉及到TGF-β/Smad信号途径[12]。FOXO1则通过抑制TGF-β/Smad信号途径抑制PAI-1表达，但在高胰岛素状态下，由于PI3K/Akt信号通路激活使下游的FOXO1磷酸化而失活，使其失去抑制TGF-β诱导的PAI-1表达[13-14]。另一方面FOXO1可通过与FOXC2竞争IRE来拮抗FOXC2而调节PAI-1启动子。研究发现PAI-1基因敲除小鼠能抵抗高脂饮食诱导的肥胖，且机体能量的消耗、胰岛素和葡萄糖的敏感性均有所增加[15]。Cederberg等[16]体外实验表明，用胰岛素或TNF来刺激小鼠脂肪细胞后，小鼠FOXO2 mRNA水平增高，而生长激素无此作用。研究显示肥胖者血浆PAI-1水平和脂肪细胞PAI-1 mRNA的表达均高于非肥胖者。
本实验通过检测肥胖小鼠不同部位脂肪组织中PAI-1、FOXC2、FOXO1mRNA的表达水平，探讨是否是脂肪细胞中FOXC2、FOXO1表达水平的差异影响PAI-1水平的表达。结果显示：肥胖小鼠附睾周围脂肪组织和皮下脂肪组织FOXC2、FOXO1的表达均有影响，可使PAI-1、FOXC2 mRNA表达水平增高，FOXO1mRNA表达降低，与对照组比较，均有统计学差异。因此，在内脏型及外周型肥胖状态下，由于内脏脂肪和皮下脂肪在FOXC2、FOXO1 mRNA表达上的差异，或者FOXC2、FOXO1对PAI-1启动子的相互竞争作用，或者两者对胰岛素反应能力的差异，导致内脏脂肪和皮下脂肪PAI-1合成和表达的不同，从而使罹患糖脂代谢紊乱和心血管疾病的风险不同。
[参考文献]
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[3] Serrano R，Barrenetxe J，Orbe J，et al.Tissue-specific PAI-1 gene expression and glycosylation pattern in insulin-resistant old rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297（5）：R1563-R1569.
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[8] Lefebvre AM，Laville M，Vega N，et al.Depot-specific differences in adipose tissue gene expression in lean and obese subjects[J].Diabetes，1998，47（1）：98-103.
[9] 彭晓韧，邹大进.脂肪组织FOXC2表达水平与肥胖和胰岛素抵抗的关系[J].医学研究生学报，2008，6：614-618.
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[11] 彭晓韧.脂肪组织FOXC2蛋白表达与肥胖和胰岛素抵抗的关系[D].上海：第二军医大学，2013.
[12] Fujita H，Kang M，Eren M，et al.Foxc2 is a common mediator of insulin and transforming growth factor beta signaling to regulate plasminogen activator inhibitor type I gene expression[J].Circ Res，2006， 98（5）：626-634.
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[14] 王芳.代謝综合征相关基因多态性的研究进展[J].医学综述，2013，19（7）：1267-1269.
[15] Ma LJ，Mao SL，Taylor KL，et al.Prevention of obesity and insulin resistance in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1[J].Diabetes，2004，53（2）：336-346.
[16] Cerd erberg A，Gronning LM，Ahren B，et al.FOXC2 is a winged helix gene that counteracts obesity， hypertrig lyceridemia， and diet induced insulin resistance[J].Cell，2001，106（5）：563-573.
（收稿日期：2014-05-30）