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【摘 要】目的：构建含有不同长度人FBXO31基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体，通过检测荧光素酶活性找到转录活性最强的启动子区域。方法：通过UCSC在线软件分析FBXO31基因启动子序列。从正常人血液基因组DNA中扩增不同长度FBXO31基因启动子片段，将这些启动子片段插入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体，构建pGL3-FBXO31-I，pGL3-FBXO31-Ⅱ，pGL3-FBXO31-Ⅲ重组载体。利用脂质体介导的转染技术将这3个重组载体分别导入HEK293，A549和HepG2细胞，检测荧光素酶活性，确定FBXO31启动子转录活性。结果：重组载体的荧光素酶活性由强至弱排列顺序为：pGL3-FBXO31-I，pGL3-FBXO31-Ⅲ，pGL3-FBXO31-Ⅱ。结论：pGL3-FBXO31-I重组载体中含有的FBXO31启动子片段转录活性最强。确定FBXO31启动子转录活性最强区域，为阐明FBXO31基因的转录调控机制奠定了坚实的基础，为运用FBXO31启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了理论依据。
【关键词】FBXO31；启动子；荧光素酶
【中图分类号】R749.053 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3851-03
Construction of FBXO31 promoter reporter vector and luciferase activity detection
LI Peng YANG La-wei HE Hui-juan CHEN Ting WANG Ya-hong CAI Yan-li HUANG Hai-li*
Clinical research center， Affiliated hospital of Guangdong medical college， Zhanjiang， China 524001
【Abstract】FBXO31 is a candidate tumor suppressor gene which is located at chromosome 16q24.3. Recent reports indicate that FBXO31 mediates cyclin D1 degradation to induce G1 arrest after DNA damage. There is no report about FBXO31 promoter. The aim of this study is to identify the core reign of FBXO31promoter. We analyzed the reign between upstream 2000bp and downstream 340bp from transcription start point of FBXO31 by using UCSC online tools and identify three possible reigns （FBXO31-I： -1309-+340， FBXO31-II： -600-+284， FBXO31-III： -500-+200）. These reigns was amplified and sub-cloned into pGL3-Basic vector. pGL3-FBXO31-I， pGL3-FBXO31-II， pGL3-FBXO31-III were transfected into HEK293， A549 and HepG2 cells by using lipofectamine 2000. Luciferase activity was detected by using Dual-Luciferase? Reporter Assay. Our results showed pGL3- FBXO31-I possess the strongest activity， which indicate FBXO31-I is the core reign of FBXO31promoter. Our study shed a new light on FBXO31 function.
【Keywords】FBXO31； promoter； luciferase
前言
FBXO31基因是F-box蛋白家族的成员，它位于16号染色体，在人类基因组中的位置为nt85974864-85920443之间。该基因在基因组中呈逆时针方向排列。FBXO31基因上游为MAP1LC3B基因，但两者的排列方向相反，序列并无重叠；下游为LOC730018，两者排列方向相同，序列并无重叠。FBXO31基因mRNA全长3635bp，共11个外显子，9个内含子。FBXO31基因的转录本具有一个极端的5’非编码区，长度仅为23bp。开放读码框全长1620bp，编码539个氨基酸[1，2]。
Kumar等人的研究表明FBXO31与衰老基因SEN16具有相似的特性。FBXO31在乳腺癌细胞系和组织样本中呈低表达，而FBXO31的过表达可诱导乳腺癌细胞系MCF-7衰老，抑制细胞增殖和克隆形成能力，并使细胞周期阻滞在G1期，推测它可能是一个乳腺癌候选抑癌基因[2]。Michael Green研究小组的研究表明，FBXO31还可能参与DNA损伤反应。FBXO31是ATM的靶蛋白之一，DNA损伤后，FBXO31的278位丝氨酸残基被ATM磷酸化，使蛋白构象稳定且表达水平上升。FBXO31可介导细胞周期素D1的降解从而使细胞周期阻滞在G1期[3-5]。
目前，关于FBXO31基因调控机制的研究报道不多。本文通过UCSC在线软件分析FBXO31基因启动子序列，構建含有不同长度人FBXO31基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体，通过检测荧光素酶活性找到转录活性最强的启动子区域，为阐明FBXO31基因的转录调控机制奠定了基础。 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细菌品系和细胞系 pGL3-basic、pRL-SV40 荧光素酶双报告载体质粒购自Promega公司，大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司，HEK293，A549和HepG2细胞为本实验保存。
1.1.2 试剂
人血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶Hind III、Kpn I，T4 DNA连接酶，琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，DNA 片段纯化试剂盒及250bp DNA ladder Marker均购自TAKARA 公司，Lipofectamine2000 转染试剂盒及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity购自Invitrogen 公司，引物及克隆测序均由英潍捷基（上海）公司提供。
1.2 方法
1.2.1 软件分析人FBXO31基因启动子
UCSC在线软件（http：//genome.ucsc.edu/）分析FBXO31基因启动子序列。
1.2.2 人FBXO31基因启动子序列的扩增
以人血液基因组DNA为模板，利用Primer Premier 5.0 软件设计合适引物，通过PCR扩增得到人FBXO31基因启动子区域不同长度的3个片段，分别命名为：FBXO31-I，FBXO31-Ⅱ，FBXO31-III。PCR 引物的sense 链5’端带Kpn I 酶切位点， 1.2.3 人FBXO31报告基因的构建及鉴定
FBXO31不同片段PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分离，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，与pGL3-Basic载体同时进行Hind III、Kpn I双酶切，酶切后产物进行回收纯化，然后分别将酶切后的FBXO31-I～FBXO31-III 与酶切后的pGL3-Basic在T4 DNA 连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的固体LB 培养皿上，37℃14 h后挑取单克隆菌落，以质粒小量抽提试剂盒提取质粒。双酶切鉴定阳性克隆的重组质粒，再经DNA测序确证。
1.2.4 重组质粒转染HEK293、A549及HepG2细胞
将HEK293、A549及HepG2细胞分别接种于24孔板中（1×105/个孔）培养，待细胞融合度达到70%时，脂质体法将重组质粒pGL3-FBXO31-I～pGL3-FBXO31-III分别与pRL-SV40共转染至HEK293、A549及HepG2细胞。转染时使用OPTI-MEM， 其中pRL-SV40作为转染率内参照，另外，设置阴性对照组pGL3-Basic空载体。转染后6h更换培养基， 正常含血清培养基继续培养。24 h后细胞裂解液裂解细胞， 收集裂解物， 进行双荧光素酶活性分析。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测pGL3-FBXO31启动子活性
质粒转染HEK293、A549、HepG2细胞24h 后，每孔加入PLB（细胞裂解液）将细胞裂解，收集裂解物，用单管式化学发光仪检测FBXO31基因启动子质粒的荧光活性。其中，目的基因的荧光素酶活性标记为M1，内参照pRL-SV40质粒的海肾荧光素酶活性标记为M2，M1/M2即为被检测质粒的相对荧光素酶活性（RLU），每次实验设2个复孔，重复3次实验，取平均值。
1.2.6统计学处理
结果数据以均数±标准差表示，采用SPSS12. 0统计软件，进行多组均数间比较，方差齐性检验后进行单因素方差分析，以P﹤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 人FBXO31基因启动子软件分析结果
3 讨论
FBXO31基因是F-box蛋白家族的成员。它与Skp1、Cullin类蛋白组成SCF类E3，参与泛素-蛋白酶水解途径。通过介导底物蛋白的降解，参与细胞增殖、发育、衰老，细胞周期调控等重要的事件[2]。目前FBXO31基因功能研究主要是与肿瘤相关：FBXO31可以抑制乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌细胞的衰老[2]。另外，它的蛋白表达水平与食管癌的预后也有密切关系[6]。我们的前期研究发现，在肝癌组织中FBXO31呈过表达，可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力[7]。FBXO31功能与肿瘤发生发展的密切关系使其可能成为癌症治疗的新靶标。
基因治疗的一个前提就是要清楚的了解靶基因的表达调控机制。调控基因表达的因素包含DNA水平调控，转录水平调控和翻译水平调控。DNA水平调控包含启动子CpG岛的甲基化和杂合子缺失（Loss of heterozygosity， LOH）。转录水平调控主要是转录因子与启动子结合并调控靶基因的转录。翻译水平的调控包括蛋白的泛素化，乙酰化，磷酸化和甲基化。
目前关于FBXO31基因调控机制的研究不多。本文通过UCSC在线软件分析FBXO31基因启动子序列，构建含有不同长度人FBXO31基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体，通过检测荧光素酶活性找到转录活性最强的启动子区域。本文报道的3个启动子区域分别是FBXO31-I：-1309至+340bp；FBXO31-II：-600至+284bp；FBXO31-III：-500至+200bp。荧光素酶活性检测结果表明，转录活性最强的启动子区域是转录起始位点上游-1309bp至+340bp的启动子片段，表明这一区段是FBXO31基因启动子的关键调控区域。找到转录活性最强的启动子区域只是阐明FBXO31基因转录调控机制的第一步。下一步研究应将重点放在转录水平调控机制，主要是弄清楚哪些轉录因子可与FBXO31启动子结合并对其表达进行调控。另外，启动子的关键调控区域CpG岛的甲基化也是FBXO31基因表达调控机制的一个重要内容。 綜上所述，本研究初步探讨了FBXO31基因启动子的关键调控区域，这为今后进一步研究FBXO31基因表达调控机制奠定了基础。
参考文献：
[1] 黄海丽， 郑文岭， 赵蕊等. 人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备[J].中国生物工程， 2010， 30： 24-27.
[2] Kumar R， Neilsen PM， Crawford J， et al. FBXO31 is the chromosome 16q24.3 senescence gene， a candidate breast tumor suppressor， and a component of an SCF complex[J]. Cancer Res， 2005， 65： 11304-11313.
[3] Jia L， Sun Y. F-box proteins FBXO31 and FBX4 in regulation of cyclin D1 degradation upon DNA damage[J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2009， 22： 518-519.
[4] Santra MK， Wajapeyee N， Green MR. F-box protein FBXO31 mediates cyclin D1 degradation to induce G1 arrest after DNA damage[J]. Nature， 2009， 459： 722-725.
[5] Shiloh Y. FBXO31： a new player in the ever-expanding DNA damage response orchestra[J]. Sci Signal， 2009， 2（96）： pe73.
[6] Kogo R， Mimori K， Tanaka F， et al. FBXO31 determines poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol 2011， 39： 155-159.
[7] Huang HL， Zheng WL， Zhao R， et al. FBXO31 is down-regulated and may function as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep 2010， 24： 715-720.
【关键词】FBXO31；启动子；荧光素酶
【中图分类号】R749.053 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3851-03
Construction of FBXO31 promoter reporter vector and luciferase activity detection
LI Peng YANG La-wei HE Hui-juan CHEN Ting WANG Ya-hong CAI Yan-li HUANG Hai-li*
Clinical research center， Affiliated hospital of Guangdong medical college， Zhanjiang， China 524001
【Abstract】FBXO31 is a candidate tumor suppressor gene which is located at chromosome 16q24.3. Recent reports indicate that FBXO31 mediates cyclin D1 degradation to induce G1 arrest after DNA damage. There is no report about FBXO31 promoter. The aim of this study is to identify the core reign of FBXO31promoter. We analyzed the reign between upstream 2000bp and downstream 340bp from transcription start point of FBXO31 by using UCSC online tools and identify three possible reigns （FBXO31-I： -1309-+340， FBXO31-II： -600-+284， FBXO31-III： -500-+200）. These reigns was amplified and sub-cloned into pGL3-Basic vector. pGL3-FBXO31-I， pGL3-FBXO31-II， pGL3-FBXO31-III were transfected into HEK293， A549 and HepG2 cells by using lipofectamine 2000. Luciferase activity was detected by using Dual-Luciferase? Reporter Assay. Our results showed pGL3- FBXO31-I possess the strongest activity， which indicate FBXO31-I is the core reign of FBXO31promoter. Our study shed a new light on FBXO31 function.
【Keywords】FBXO31； promoter； luciferase
前言
FBXO31基因是F-box蛋白家族的成员，它位于16号染色体，在人类基因组中的位置为nt85974864-85920443之间。该基因在基因组中呈逆时针方向排列。FBXO31基因上游为MAP1LC3B基因，但两者的排列方向相反，序列并无重叠；下游为LOC730018，两者排列方向相同，序列并无重叠。FBXO31基因mRNA全长3635bp，共11个外显子，9个内含子。FBXO31基因的转录本具有一个极端的5’非编码区，长度仅为23bp。开放读码框全长1620bp，编码539个氨基酸[1，2]。
Kumar等人的研究表明FBXO31与衰老基因SEN16具有相似的特性。FBXO31在乳腺癌细胞系和组织样本中呈低表达，而FBXO31的过表达可诱导乳腺癌细胞系MCF-7衰老，抑制细胞增殖和克隆形成能力，并使细胞周期阻滞在G1期，推测它可能是一个乳腺癌候选抑癌基因[2]。Michael Green研究小组的研究表明，FBXO31还可能参与DNA损伤反应。FBXO31是ATM的靶蛋白之一，DNA损伤后，FBXO31的278位丝氨酸残基被ATM磷酸化，使蛋白构象稳定且表达水平上升。FBXO31可介导细胞周期素D1的降解从而使细胞周期阻滞在G1期[3-5]。
目前，关于FBXO31基因调控机制的研究报道不多。本文通过UCSC在线软件分析FBXO31基因启动子序列，構建含有不同长度人FBXO31基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体，通过检测荧光素酶活性找到转录活性最强的启动子区域，为阐明FBXO31基因的转录调控机制奠定了基础。 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细菌品系和细胞系 pGL3-basic、pRL-SV40 荧光素酶双报告载体质粒购自Promega公司，大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司，HEK293，A549和HepG2细胞为本实验保存。
1.1.2 试剂
人血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司，限制性内切酶Hind III、Kpn I，T4 DNA连接酶，琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，DNA 片段纯化试剂盒及250bp DNA ladder Marker均购自TAKARA 公司，Lipofectamine2000 转染试剂盒及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity购自Invitrogen 公司，引物及克隆测序均由英潍捷基（上海）公司提供。
1.2 方法
1.2.1 软件分析人FBXO31基因启动子
UCSC在线软件（http：//genome.ucsc.edu/）分析FBXO31基因启动子序列。
1.2.2 人FBXO31基因启动子序列的扩增
以人血液基因组DNA为模板，利用Primer Premier 5.0 软件设计合适引物，通过PCR扩增得到人FBXO31基因启动子区域不同长度的3个片段，分别命名为：FBXO31-I，FBXO31-Ⅱ，FBXO31-III。PCR 引物的sense 链5’端带Kpn I 酶切位点， 1.2.3 人FBXO31报告基因的构建及鉴定
FBXO31不同片段PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分离，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，与pGL3-Basic载体同时进行Hind III、Kpn I双酶切，酶切后产物进行回收纯化，然后分别将酶切后的FBXO31-I～FBXO31-III 与酶切后的pGL3-Basic在T4 DNA 连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的固体LB 培养皿上，37℃14 h后挑取单克隆菌落，以质粒小量抽提试剂盒提取质粒。双酶切鉴定阳性克隆的重组质粒，再经DNA测序确证。
1.2.4 重组质粒转染HEK293、A549及HepG2细胞
将HEK293、A549及HepG2细胞分别接种于24孔板中（1×105/个孔）培养，待细胞融合度达到70%时，脂质体法将重组质粒pGL3-FBXO31-I～pGL3-FBXO31-III分别与pRL-SV40共转染至HEK293、A549及HepG2细胞。转染时使用OPTI-MEM， 其中pRL-SV40作为转染率内参照，另外，设置阴性对照组pGL3-Basic空载体。转染后6h更换培养基， 正常含血清培养基继续培养。24 h后细胞裂解液裂解细胞， 收集裂解物， 进行双荧光素酶活性分析。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测pGL3-FBXO31启动子活性
质粒转染HEK293、A549、HepG2细胞24h 后，每孔加入PLB（细胞裂解液）将细胞裂解，收集裂解物，用单管式化学发光仪检测FBXO31基因启动子质粒的荧光活性。其中，目的基因的荧光素酶活性标记为M1，内参照pRL-SV40质粒的海肾荧光素酶活性标记为M2，M1/M2即为被检测质粒的相对荧光素酶活性（RLU），每次实验设2个复孔，重复3次实验，取平均值。
1.2.6统计学处理
结果数据以均数±标准差表示，采用SPSS12. 0统计软件，进行多组均数间比较，方差齐性检验后进行单因素方差分析，以P﹤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 人FBXO31基因启动子软件分析结果
3 讨论
FBXO31基因是F-box蛋白家族的成员。它与Skp1、Cullin类蛋白组成SCF类E3，参与泛素-蛋白酶水解途径。通过介导底物蛋白的降解，参与细胞增殖、发育、衰老，细胞周期调控等重要的事件[2]。目前FBXO31基因功能研究主要是与肿瘤相关：FBXO31可以抑制乳腺癌细胞的增殖并促进乳腺癌细胞的衰老[2]。另外，它的蛋白表达水平与食管癌的预后也有密切关系[6]。我们的前期研究发现，在肝癌组织中FBXO31呈过表达，可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力[7]。FBXO31功能与肿瘤发生发展的密切关系使其可能成为癌症治疗的新靶标。
基因治疗的一个前提就是要清楚的了解靶基因的表达调控机制。调控基因表达的因素包含DNA水平调控，转录水平调控和翻译水平调控。DNA水平调控包含启动子CpG岛的甲基化和杂合子缺失（Loss of heterozygosity， LOH）。转录水平调控主要是转录因子与启动子结合并调控靶基因的转录。翻译水平的调控包括蛋白的泛素化，乙酰化，磷酸化和甲基化。
目前关于FBXO31基因调控机制的研究不多。本文通过UCSC在线软件分析FBXO31基因启动子序列，构建含有不同长度人FBXO31基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体，通过检测荧光素酶活性找到转录活性最强的启动子区域。本文报道的3个启动子区域分别是FBXO31-I：-1309至+340bp；FBXO31-II：-600至+284bp；FBXO31-III：-500至+200bp。荧光素酶活性检测结果表明，转录活性最强的启动子区域是转录起始位点上游-1309bp至+340bp的启动子片段，表明这一区段是FBXO31基因启动子的关键调控区域。找到转录活性最强的启动子区域只是阐明FBXO31基因转录调控机制的第一步。下一步研究应将重点放在转录水平调控机制，主要是弄清楚哪些轉录因子可与FBXO31启动子结合并对其表达进行调控。另外，启动子的关键调控区域CpG岛的甲基化也是FBXO31基因表达调控机制的一个重要内容。 綜上所述，本研究初步探讨了FBXO31基因启动子的关键调控区域，这为今后进一步研究FBXO31基因表达调控机制奠定了基础。
参考文献：
[1] 黄海丽， 郑文岭， 赵蕊等. 人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备[J].中国生物工程， 2010， 30： 24-27.
[2] Kumar R， Neilsen PM， Crawford J， et al. FBXO31 is the chromosome 16q24.3 senescence gene， a candidate breast tumor suppressor， and a component of an SCF complex[J]. Cancer Res， 2005， 65： 11304-11313.
[3] Jia L， Sun Y. F-box proteins FBXO31 and FBX4 in regulation of cyclin D1 degradation upon DNA damage[J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2009， 22： 518-519.
[4] Santra MK， Wajapeyee N， Green MR. F-box protein FBXO31 mediates cyclin D1 degradation to induce G1 arrest after DNA damage[J]. Nature， 2009， 459： 722-725.
[5] Shiloh Y. FBXO31： a new player in the ever-expanding DNA damage response orchestra[J]. Sci Signal， 2009， 2（96）： pe73.
[6] Kogo R， Mimori K， Tanaka F， et al. FBXO31 determines poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol 2011， 39： 155-159.
[7] Huang HL， Zheng WL， Zhao R， et al. FBXO31 is down-regulated and may function as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Rep 2010， 24： 715-720.