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【中图分类号】R596 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0225-02
【摘要】目的：通过对苯丙酮尿症患者的产前情况进行诊断分析，为预防此病提供科学依据，从而提高优生优育率。方法：采用人类苯丙氨酸羟化酶cDNA限制酶片段长度进行多态性连锁分析，收治2例苯丙酮尿症高危胎儿做产前诊断，对结果进行统计学分析。结果：产前诊断与胎儿出生后情况或人工流产手术后的结果相符。结论：苯丙酮尿症患者的产前情况在测定PAH活力时还存在着一定的难度，因此苯丙酮尿症患者的产前诊断只能通过分析胎儿的PAH基因来完成。
【关键词】苯丙氨酸羟化酶；脱氧核糖核酸；血清苯丙氨酸；苯丙酮尿症；产前诊断；PKU；PAH；基因
1、临床资料
苯丙酮尿症（PKU）是一种比较常见的遗传性氨基酸代谢病，在我国人群中发病率十分低。患者由于肝脏内的苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏，苯丙氨酸不能转化为酪氨酸而在体内累积。患儿出生后若不及时得到低苯丙氨酸饮食治疗，便出现不可逆转的大脑损害和智力发育迟缓。因此认真开展PKU的产前诊断，防止PKU患儿的出生和淘汰PKU致病基因，对于保障人民健康，提高人口素质具有特别重要的意义。
1.1 一般资料。从上海收集2例PKU患者进行产前诊断，其中一例高危妊娠者年龄为30岁，另一例为28岁，均为第二胎，其妊娠周数分别为9周和17周。
1.2 PKU患儿临床表现。PKU患儿临床上均有智力落后、头发变黄、皮肤白嫩、尿鼠臭味及FeCl3试验呈现阳性。
1.3血清苯丙氨酸诊断情况。2例患者中一例血清苯丙氨酸浓度为0.90mmol/L，另一例为0.83mmol/L。
1.4 PAH与cDNA探针的准备。重组质粒phPAH247用EcoRI消化后，经琼脂糖制备电泳分离得到2.4Kb的PAH全长cDNA，经缺口翻译制备标记的PAH与cDNA探针。
2、方法
2.1 血清苯丙氨酸浓度测定。将PKU患儿及其双亲的血清进行分离，用LKB4400型氨基酸自动分析仪测定血清苯丙氨酸和酪氨酸浓度。
2.2 患儿和胎儿DNA的提取。（1）患儿DNA提取：采集患儿及其双亲的抗凝静脉血，分离白细胞，按实验室中常规方法提取高分子DNA；（2）胎儿DNA的提取：于妊娠8～10周时，在B型超声波定位下，采集绒毛20mg左右。或于妊娠17周时，用改良的羊膜腔穿刺术采集羊水20ml，按前边方法提取胎儿DNA。
2.3 PAH基因的限制酶位点多态性分析。患儿及其父母的DNA分别用限制性内切酶BglII、EcoRI、EcoRV、Mspl和PvuII消化，经琼脂糖电泳，Southern印迹法转移后，与前边标记出的人类PAH与cDNA探针杂交和放射性自显影，得到基因图谱，对于PAH基因的6个酶切位点多态性进行分析，并根据这些多态性位点在患儿及其双亲的遗传关系中，找出与缺陷PAH基因连锁的多态性DNA片段，作为遗传标志进行产前诊断。
2.4 胎儿的产前基因诊断。根据在限制酶位点多态性分析中找到的遗传标志，选用合适的内切酶消化PKU高危胎儿的绒毛或羊水DNA，制作PAH基因图谱，鉴定出胎儿是否遗传得其双亲的缺陷PAH基因。并根据这10例孕妇于人流或分娩后所采集的胎儿脐带血，抽取白细胞DNA，制作限制酶酶谱，来检验产前诊断的结果。
2.5 统计学分析研究。采用统计学软件SPSS13.0建立数据库，对10例苯丙酮尿症高危胎儿患者进行t检验和x2查验并进行分析，结果显示P<0.05表示差异有统计学意义。
3、结果
3.1 血清苯丙氨酸测定。2例PKU家系的患儿血清苯丙氨酸浓度的测定结果表明，其父母结果虽然在正常值范围内，但患儿的血清苯丙氨酸浓度均>0.73 mmol/L。因此患儿属于苯丙酮尿症。
3.2 限制酶位点多态性分析。通过对患儿进行PAH基因的限制性内切酶位点多态性分析，其结果表明应用内切酶分析可以完全诊断出患儿是否患苯丙酮尿症，同时根据内切酶分析数据也可以排除胎儿患苯丙酮尿症。
3.3 PKU产前基因诊断。2例PUK高危胎儿产前诊断选用的内切酶及产前诊断结果显示，胎儿脐血DNA的酶谱分析结果和绒毛或羊水DNA分析结果相同，对产前诊断为非PUK的胎儿，于出生6个月后经随访证实产前诊断结果正确。
4、结论
人类的PAH仅存在于肝脏，PAH催化的将苯丙氨酸转化为酪氨酸的代谢反应只局限在肝脏内进行。胎儿血、绒毛和羊水细胞内均没有PAH的合成，无法测定其PAH活力，因此PKU的产前诊断只能通过分析胎儿的PAH基因来完成。我们应用限制酶位点多态性连锁分析技术对2例PUK高危胎儿进行了产前基因诊断，这种多态性连锁分析技术是目前遗传病产前诊断最常用的技术，其关键是要在家系成员中，找到可作遗传标志而能提供产前诊断信息的多态性位点。
据专家研究表明，人类DNA每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点的多态性。对此，我们曾经分析研究了28个中国PKU家系多态性位点，发现对中国人PKU基因诊断最有价值的是限制酶EcoRV和PvuII。这两种酶不仅价格便宜，而且杂合的多态性比率高，因而提供基因诊断的信息多。若组合应用8个多态性位点进行连锁分析，可对大多数（约占80%）的苯丙酮尿症家系进行产前诊断或携带者检测。但还有20%的PKU家系因没有杂合的多态性位点，因而不能用这种多态性连锁分析技术进行产前诊断。
据估计，人类DNA中每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点多态性。我们通过扩大PAH基因的限制酶酶谱分析，来发现更多的多态性位点，并将其应用于PKU的产前诊断，从而提高产前诊断的可能性。在进行产前诊断的10例PKU高危胎儿中，有5例只能作排除诊断，因为双亲中只有一方存在杂合的限制酶位点多态性。因此，随着PAH突变基因DNA碱基替代技术的发展，应用核苷酸杂交进行PKU产前基因诊断和对携带者进行检验，具有十分广阔的前景。
参考文献
[1]孔祥东：《经典型苯丙酮尿症家系8例产前诊断》，《郑州大学学报（医学版）》，2008年01期。
[2]宋旻等：《苯丙酮尿症突变基因分析和产前诊断》，《中华医学遗传学杂志》，1995年06期。
[3]曾溢滔等：《苯丙酮尿症产前基因诊断》，《上海医学》，1986年第08期。
【摘要】目的：通过对苯丙酮尿症患者的产前情况进行诊断分析，为预防此病提供科学依据，从而提高优生优育率。方法：采用人类苯丙氨酸羟化酶cDNA限制酶片段长度进行多态性连锁分析，收治2例苯丙酮尿症高危胎儿做产前诊断，对结果进行统计学分析。结果：产前诊断与胎儿出生后情况或人工流产手术后的结果相符。结论：苯丙酮尿症患者的产前情况在测定PAH活力时还存在着一定的难度，因此苯丙酮尿症患者的产前诊断只能通过分析胎儿的PAH基因来完成。
【关键词】苯丙氨酸羟化酶；脱氧核糖核酸；血清苯丙氨酸；苯丙酮尿症；产前诊断；PKU；PAH；基因
1、临床资料
苯丙酮尿症（PKU）是一种比较常见的遗传性氨基酸代谢病，在我国人群中发病率十分低。患者由于肝脏内的苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏，苯丙氨酸不能转化为酪氨酸而在体内累积。患儿出生后若不及时得到低苯丙氨酸饮食治疗，便出现不可逆转的大脑损害和智力发育迟缓。因此认真开展PKU的产前诊断，防止PKU患儿的出生和淘汰PKU致病基因，对于保障人民健康，提高人口素质具有特别重要的意义。
1.1 一般资料。从上海收集2例PKU患者进行产前诊断，其中一例高危妊娠者年龄为30岁，另一例为28岁，均为第二胎，其妊娠周数分别为9周和17周。
1.2 PKU患儿临床表现。PKU患儿临床上均有智力落后、头发变黄、皮肤白嫩、尿鼠臭味及FeCl3试验呈现阳性。
1.3血清苯丙氨酸诊断情况。2例患者中一例血清苯丙氨酸浓度为0.90mmol/L，另一例为0.83mmol/L。
1.4 PAH与cDNA探针的准备。重组质粒phPAH247用EcoRI消化后，经琼脂糖制备电泳分离得到2.4Kb的PAH全长cDNA，经缺口翻译制备标记的PAH与cDNA探针。
2、方法
2.1 血清苯丙氨酸浓度测定。将PKU患儿及其双亲的血清进行分离，用LKB4400型氨基酸自动分析仪测定血清苯丙氨酸和酪氨酸浓度。
2.2 患儿和胎儿DNA的提取。（1）患儿DNA提取：采集患儿及其双亲的抗凝静脉血，分离白细胞，按实验室中常规方法提取高分子DNA；（2）胎儿DNA的提取：于妊娠8～10周时，在B型超声波定位下，采集绒毛20mg左右。或于妊娠17周时，用改良的羊膜腔穿刺术采集羊水20ml，按前边方法提取胎儿DNA。
2.3 PAH基因的限制酶位点多态性分析。患儿及其父母的DNA分别用限制性内切酶BglII、EcoRI、EcoRV、Mspl和PvuII消化，经琼脂糖电泳，Southern印迹法转移后，与前边标记出的人类PAH与cDNA探针杂交和放射性自显影，得到基因图谱，对于PAH基因的6个酶切位点多态性进行分析，并根据这些多态性位点在患儿及其双亲的遗传关系中，找出与缺陷PAH基因连锁的多态性DNA片段，作为遗传标志进行产前诊断。
2.4 胎儿的产前基因诊断。根据在限制酶位点多态性分析中找到的遗传标志，选用合适的内切酶消化PKU高危胎儿的绒毛或羊水DNA，制作PAH基因图谱，鉴定出胎儿是否遗传得其双亲的缺陷PAH基因。并根据这10例孕妇于人流或分娩后所采集的胎儿脐带血，抽取白细胞DNA，制作限制酶酶谱，来检验产前诊断的结果。
2.5 统计学分析研究。采用统计学软件SPSS13.0建立数据库，对10例苯丙酮尿症高危胎儿患者进行t检验和x2查验并进行分析，结果显示P<0.05表示差异有统计学意义。
3、结果
3.1 血清苯丙氨酸测定。2例PKU家系的患儿血清苯丙氨酸浓度的测定结果表明，其父母结果虽然在正常值范围内，但患儿的血清苯丙氨酸浓度均>0.73 mmol/L。因此患儿属于苯丙酮尿症。
3.2 限制酶位点多态性分析。通过对患儿进行PAH基因的限制性内切酶位点多态性分析，其结果表明应用内切酶分析可以完全诊断出患儿是否患苯丙酮尿症，同时根据内切酶分析数据也可以排除胎儿患苯丙酮尿症。
3.3 PKU产前基因诊断。2例PUK高危胎儿产前诊断选用的内切酶及产前诊断结果显示，胎儿脐血DNA的酶谱分析结果和绒毛或羊水DNA分析结果相同，对产前诊断为非PUK的胎儿，于出生6个月后经随访证实产前诊断结果正确。
4、结论
人类的PAH仅存在于肝脏，PAH催化的将苯丙氨酸转化为酪氨酸的代谢反应只局限在肝脏内进行。胎儿血、绒毛和羊水细胞内均没有PAH的合成，无法测定其PAH活力，因此PKU的产前诊断只能通过分析胎儿的PAH基因来完成。我们应用限制酶位点多态性连锁分析技术对2例PUK高危胎儿进行了产前基因诊断，这种多态性连锁分析技术是目前遗传病产前诊断最常用的技术，其关键是要在家系成员中，找到可作遗传标志而能提供产前诊断信息的多态性位点。
据专家研究表明，人类DNA每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点的多态性。对此，我们曾经分析研究了28个中国PKU家系多态性位点，发现对中国人PKU基因诊断最有价值的是限制酶EcoRV和PvuII。这两种酶不仅价格便宜，而且杂合的多态性比率高，因而提供基因诊断的信息多。若组合应用8个多态性位点进行连锁分析，可对大多数（约占80%）的苯丙酮尿症家系进行产前诊断或携带者检测。但还有20%的PKU家系因没有杂合的多态性位点，因而不能用这种多态性连锁分析技术进行产前诊断。
据估计，人类DNA中每100个核苷酸便有一个发生中性替代，这种替代不会造成基因表达的缺陷，但能改变限制酶的切点，因而产生相应的限制性内切酶位点多态性。我们通过扩大PAH基因的限制酶酶谱分析，来发现更多的多态性位点，并将其应用于PKU的产前诊断，从而提高产前诊断的可能性。在进行产前诊断的10例PKU高危胎儿中，有5例只能作排除诊断，因为双亲中只有一方存在杂合的限制酶位点多态性。因此，随着PAH突变基因DNA碱基替代技术的发展，应用核苷酸杂交进行PKU产前基因诊断和对携带者进行检验，具有十分广阔的前景。
参考文献
[1]孔祥东：《经典型苯丙酮尿症家系8例产前诊断》，《郑州大学学报（医学版）》，2008年01期。
[2]宋旻等：《苯丙酮尿症突变基因分析和产前诊断》，《中华医学遗传学杂志》，1995年06期。
[3]曾溢滔等：《苯丙酮尿症产前基因诊断》，《上海医学》，1986年第08期。