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摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定感冒疏风丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量的方法。方法 采用Agilent 5TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相为乙腈-水（49∶51），流速1.0 mL/min，检测波长330 nm，柱温30.0 ℃。结果 蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯线性范围分别为0.0451～1.3533μg（r=0.9999）和0.0164～0.4911μg（r=0.9999）;平均回收率分别为98.74%和97.09%，RSD分别为0.35%和0.29%。结论 该方法专属性强、结果准确、操作简便，可用于感冒疏风丸的质量控制。
关键词：感冒疏风丸;高效液相色谱法;蛇床子素;二氢欧山芹醇当归酸酯;含量测定
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）09-0072-04
Simultaneous Determination of Osthol and Dihydrooxanol AngelicaAcid Ester in Ganmao Shufeng Pills by HPLC
YANG Shen-ying1， LIU Chang-xun2， SHANG-guan Yun-lan3，TAO Ming-bao1， CHAI Lian-zhou2， ZHAO Xing-rui2
（1. Food and Drug Inspection and Testing Center of Baoshan City， Baoshan 678000， China;2. Baoshan Junior College of Traditional Chinese Medicine， Baoshan 678000， China; 3. School of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， China）
【Abstract】Objective： To establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of osthol and dihydrooxanol angelica acid ester in Ganmao Shufeng Pills. Methods： An agilent 5TC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the mobile phase was acetonitrile-water （49：51）， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 330 nm， and the column temperature was 30.0 ℃. Results： The linear ranges of osthole and dihydrooxanol angelica acid este were 0.0451～1.3533μg （r=0.9999） and 0.0164～0.4911μg （r=0.9999）， respectively and the average recoveries were 98.74% and 97.09% respectively， and the RSDs were0.35% and 0.29%. It is 0.35% and 0.29% respectively. Conclusion： The method has strong specificity， accurate results and simple operation， and can be used for the quality control of Ganmao Shufeng Pills.
【Key words】Ganmao Shufeng Pills; High Performance Liquid Chromatography; Osthole; Dihydrooxanol Angelica Acid Ester; Content Determination
感冒疏风丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十三册》，由麻黄绒（炙）、苦杏仁、桂枝、独活等十二味药组成，具有辛温解表、宣肺和中的功效，用于风寒感冒、发热咳嗽、头痛怕冷、鼻流清涕、骨节酸痛、四肢倦怠等症[1]。处方中独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛风除湿，通痹止痛的功效[2]。感冒疏风丸有水蜜丸和大蜜丸2种剂型，其质量标准中仅有显微鉴别及芍药苷的薄层色谱鉴别，无含量测定项目[1]，不利于控制药品的质量。现参考有关文献[2-10]，建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定感冒疏风丸中独活的有效成分蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量的方法，为提高感冒疏风丸的质量标准提供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;Sartorius BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）;SK2510LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;A2S-10-BE超纯水机（美国艾科浦国际有限公司）。
1.2 试药 蛇床子素对照品（批号：110822-201710，纯度为99.5%），二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号：111583-201605，纯度为98.6%），均购自中国食品药品检定研究院;感冒疏风丸（昆明中药厂有限公司生产，水蜜丸规格为6 g/袋，批号为200717，280780，281810，280262，271362，27128;大蜜丸规格为9 g/丸，批号为100070，180138，190024，190089，180136，190116，180187）;乙腈为色谱纯（默克股份两合公司）;水为超纯水。 2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent 5TC-C 18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（49∶51）;检测波长：330 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：30.0 ℃;进样量：10 μL;理论塔板数按二氢欧山芹醇当归酸酯峰计算应不低于6 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取蛇床子素对照品22.67 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，得蛇床子素对照品储备液;精密称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品16.60 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，得二氢欧山芹醇当归酸酯对照品储备液。再分别精密量取蛇床子素对照品储备液2 mL、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品储备液1 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素45.11 μg和二氢欧山芹醇当归酸酯16.37 μg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取水蜜丸，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中;或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取20 g，精密称定，精密加入硅藻土10 g，研匀，取7.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及工艺配制缺独活的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液。
2.3 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，依法测定，记录色谱图。结果阴性对照色谱图中在与对照品以及供试品色谱相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性好。色谱图见图1。
2.4 线性关系考察 分别精密吸取每1 mL含蛇床子素45.11 μg和二氢欧山芹醇当归酸酯16.37 μg的混合对照品溶液1、5、10、15、20、25、30μL，进行测定，记录峰面积，以对照品进样质量为横坐标（X）、色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，分别得蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯回归方程为Y=3144.66X+7.68，r=0.9999（n=7）;Y=2767.62X+2.15，r=0.9999（n=7）。结果表明，蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯进样质量分别在0.0451～1.3533μg和0.0164～0.4911μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为0.62%和0.66%（n=6），表明该仪器精密度良好。
1.蛇床子素;2.二氢欧山芹醇当归酸酯;A.对照品;B.供试品;C.阴性对照图1 高效液相色谱图
2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下制备好的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、32h进样10 μL，记录峰面积。结果蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为1.44%和1.19%，表明供试品溶液在32h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：200717）6份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，测定蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的平均含量为0.2102mg/g和0.0803mg/g，RSD分别为0.71%和0.73%（n=6）。表明方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验 称取已知含量的感冒疏风丸（批号：200717）6份，每份约1.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入每1mL分别含蛇床子素0.0632mg、二氢欧山芹醇当归酸酯0.0242mg的混合对照品溶液液5mL，再精密加入甲醇20mL，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，进行测定，计算回收率。结果见表1。
2.9 样品含量测定 取不同批号的样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件测定样品中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的含量。结果见表2。
3 讨论
3.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长下对蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液进行紫外扫描，结果蛇床子素在322 nm处有最大吸收，二氢欧山芹醇当归酸酯在330 nm处有最大吸收，参考《中华人民共和国药典》2020年版一部“独活”项下含量测定的检测波长，故本实验选用330 nm作为检测波长。
3.2 提取条件的选择 经查阅文献，选择提取溶剂为甲醇;考察了超声、加热回流2种提取方式，结果表明两者提取效率相当，但超声提取操作简便，故选用超声提取;分别考察了超声30、40、50、60 min的提取情况，结果表明超声40 min待测成分已提取完全，因此確定超声时间为40 min。
3.3 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水体系、乙腈-水体系，结果表明乙腈的洗脱能力更强，峰形较好，通过考察不同比例的流动相，最终选择以乙腈-水（49∶51）为流动相，该流动相基线较平稳，保留时间适中，分离度、拖尾因子等色谱参数都能达到要求。
综上所述，本实验建立的HPLC法测定感冒疏风丸中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯含量的方法，操作简便，重复性好，专属性高，可作为感冒疏风丸的质量控制的检测方法。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂第十三册[S].1997：212.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版（1部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020：274-275.
[3]周璐丽，曾建国.独活化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代中药，2019，21（12）：1739-1748.
[4]陈宇.独活化学成分研究进展[J].辽宁中医药大学报，2014，16（5）：255-256.
[5]郭晓霞，李冬华，马潇，等.独活饮片中4种化学成分的含量测定[J].中国现代中药，2020，22（2）：266-270.
[6]薛磊冰，周燕，金佩芬.HPLC法测定尪痹片中蛇床子素和二氢欧芹醇当归酸酯含量[J].中国药师，2014，17（4）：697-699.
[7]蒋季明，王男，朱凤娟，等.不同采收期及生长年限独活中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量的比较[J].华西药学杂志，2021，36（1）：85-89.
[8]韩凤，林茂祥，罗川，等.不同产地独活及其混伪品的质量差异性分析[J].西南师范大学学报（自然科学版），2019，44（10）：34-39.
[9]王卫钢，黄丽杰，崔燕贞，等.不同厂家独活饮片中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量比较[J].亚太传统医药，2019，15（10）：70-71.
[10]赵向阳.HPLC法测定祛风止痛片中蛇床子素和二氢欧芹醇当归酸酯[J].中国医院用药评价与分析，2016，16（1）：112-113.
（收稿日期：2021-04-22）
关键词：感冒疏风丸;高效液相色谱法;蛇床子素;二氢欧山芹醇当归酸酯;含量测定
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）09-0072-04
Simultaneous Determination of Osthol and Dihydrooxanol AngelicaAcid Ester in Ganmao Shufeng Pills by HPLC
YANG Shen-ying1， LIU Chang-xun2， SHANG-guan Yun-lan3，TAO Ming-bao1， CHAI Lian-zhou2， ZHAO Xing-rui2
（1. Food and Drug Inspection and Testing Center of Baoshan City， Baoshan 678000， China;2. Baoshan Junior College of Traditional Chinese Medicine， Baoshan 678000， China; 3. School of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， China）
【Abstract】Objective： To establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of osthol and dihydrooxanol angelica acid ester in Ganmao Shufeng Pills. Methods： An agilent 5TC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the mobile phase was acetonitrile-water （49：51）， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 330 nm， and the column temperature was 30.0 ℃. Results： The linear ranges of osthole and dihydrooxanol angelica acid este were 0.0451～1.3533μg （r=0.9999） and 0.0164～0.4911μg （r=0.9999）， respectively and the average recoveries were 98.74% and 97.09% respectively， and the RSDs were0.35% and 0.29%. It is 0.35% and 0.29% respectively. Conclusion： The method has strong specificity， accurate results and simple operation， and can be used for the quality control of Ganmao Shufeng Pills.
【Key words】Ganmao Shufeng Pills; High Performance Liquid Chromatography; Osthole; Dihydrooxanol Angelica Acid Ester; Content Determination
感冒疏风丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十三册》，由麻黄绒（炙）、苦杏仁、桂枝、独活等十二味药组成，具有辛温解表、宣肺和中的功效，用于风寒感冒、发热咳嗽、头痛怕冷、鼻流清涕、骨节酸痛、四肢倦怠等症[1]。处方中独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛风除湿，通痹止痛的功效[2]。感冒疏风丸有水蜜丸和大蜜丸2种剂型，其质量标准中仅有显微鉴别及芍药苷的薄层色谱鉴别，无含量测定项目[1]，不利于控制药品的质量。现参考有关文献[2-10]，建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定感冒疏风丸中独活的有效成分蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量的方法，为提高感冒疏风丸的质量标准提供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;Sartorius BP211D型电子天平（德国赛多利斯公司）;SK2510LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;A2S-10-BE超纯水机（美国艾科浦国际有限公司）。
1.2 试药 蛇床子素对照品（批号：110822-201710，纯度为99.5%），二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号：111583-201605，纯度为98.6%），均购自中国食品药品检定研究院;感冒疏风丸（昆明中药厂有限公司生产，水蜜丸规格为6 g/袋，批号为200717，280780，281810，280262，271362，27128;大蜜丸规格为9 g/丸，批号为100070，180138，190024，190089，180136，190116，180187）;乙腈为色谱纯（默克股份两合公司）;水为超纯水。 2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent 5TC-C 18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（49∶51）;检测波长：330 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：30.0 ℃;进样量：10 μL;理论塔板数按二氢欧山芹醇当归酸酯峰计算应不低于6 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取蛇床子素对照品22.67 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，得蛇床子素对照品储备液;精密称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品16.60 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，得二氢欧山芹醇当归酸酯对照品储备液。再分别精密量取蛇床子素对照品储备液2 mL、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品储备液1 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素45.11 μg和二氢欧山芹醇当归酸酯16.37 μg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取水蜜丸，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中;或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取20 g，精密称定，精密加入硅藻土10 g，研匀，取7.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及工艺配制缺独活的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液。
2.3 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，依法测定，记录色谱图。结果阴性对照色谱图中在与对照品以及供试品色谱相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明该方法专属性好。色谱图见图1。
2.4 线性关系考察 分别精密吸取每1 mL含蛇床子素45.11 μg和二氢欧山芹醇当归酸酯16.37 μg的混合对照品溶液1、5、10、15、20、25、30μL，进行测定，记录峰面积，以对照品进样质量为横坐标（X）、色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，分别得蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯回归方程为Y=3144.66X+7.68，r=0.9999（n=7）;Y=2767.62X+2.15，r=0.9999（n=7）。结果表明，蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯进样质量分别在0.0451～1.3533μg和0.0164～0.4911μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，记录峰面积。结果蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为0.62%和0.66%（n=6），表明该仪器精密度良好。
1.蛇床子素;2.二氢欧山芹醇当归酸酯;A.对照品;B.供试品;C.阴性对照图1 高效液相色谱图
2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下制备好的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、32h进样10 μL，记录峰面积。结果蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为1.44%和1.19%，表明供试品溶液在32h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：200717）6份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，测定蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的平均含量为0.2102mg/g和0.0803mg/g，RSD分别为0.71%和0.73%（n=6）。表明方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验 称取已知含量的感冒疏风丸（批号：200717）6份，每份约1.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入每1mL分别含蛇床子素0.0632mg、二氢欧山芹醇当归酸酯0.0242mg的混合对照品溶液液5mL，再精密加入甲醇20mL，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，进行测定，计算回收率。结果见表1。
2.9 样品含量测定 取不同批号的样品，按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件测定样品中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯的含量。结果见表2。
3 讨论
3.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长下对蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液进行紫外扫描，结果蛇床子素在322 nm处有最大吸收，二氢欧山芹醇当归酸酯在330 nm处有最大吸收，参考《中华人民共和国药典》2020年版一部“独活”项下含量测定的检测波长，故本实验选用330 nm作为检测波长。
3.2 提取条件的选择 经查阅文献，选择提取溶剂为甲醇;考察了超声、加热回流2种提取方式，结果表明两者提取效率相当，但超声提取操作简便，故选用超声提取;分别考察了超声30、40、50、60 min的提取情况，结果表明超声40 min待测成分已提取完全，因此確定超声时间为40 min。
3.3 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水体系、乙腈-水体系，结果表明乙腈的洗脱能力更强，峰形较好，通过考察不同比例的流动相，最终选择以乙腈-水（49∶51）为流动相，该流动相基线较平稳，保留时间适中，分离度、拖尾因子等色谱参数都能达到要求。
综上所述，本实验建立的HPLC法测定感冒疏风丸中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯含量的方法，操作简便，重复性好，专属性高，可作为感冒疏风丸的质量控制的检测方法。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂第十三册[S].1997：212.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版（1部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020：274-275.
[3]周璐丽，曾建国.独活化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代中药，2019，21（12）：1739-1748.
[4]陈宇.独活化学成分研究进展[J].辽宁中医药大学报，2014，16（5）：255-256.
[5]郭晓霞，李冬华，马潇，等.独活饮片中4种化学成分的含量测定[J].中国现代中药，2020，22（2）：266-270.
[6]薛磊冰，周燕，金佩芬.HPLC法测定尪痹片中蛇床子素和二氢欧芹醇当归酸酯含量[J].中国药师，2014，17（4）：697-699.
[7]蒋季明，王男，朱凤娟，等.不同采收期及生长年限独活中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量的比较[J].华西药学杂志，2021，36（1）：85-89.
[8]韩凤，林茂祥，罗川，等.不同产地独活及其混伪品的质量差异性分析[J].西南师范大学学报（自然科学版），2019，44（10）：34-39.
[9]王卫钢，黄丽杰，崔燕贞，等.不同厂家独活饮片中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量比较[J].亚太传统医药，2019，15（10）：70-71.
[10]赵向阳.HPLC法测定祛风止痛片中蛇床子素和二氢欧芹醇当归酸酯[J].中国医院用药评价与分析，2016，16（1）：112-113.
（收稿日期：2021-04-22）