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摘要：目的 观察益肺清化颗粒对Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤体中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体（KDR）含量的影响，以期阐明其抑瘤的作用机制。方法 80只C57BL/6近交系小鼠右腋皮下接种Lewis瘤细胞悬液0.2 mL（细胞浓度为1×107个/mL），随机分为空白组、对照组、益肺清化颗粒低剂量组、益肺清化颗粒中剂量组、益肺清化颗粒高剂量组、吉非替尼组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、环磷酰胺（CTX）组。每组10只。实验第2日开始给药，除CTX组第3日及第7日给药2次外，其余各组均给药14 d。实验第15日处死小鼠，取瘤，以蛋白质印迹法（Western Blot）检测瘤组织VEGF及其受体KDR的表达。结果 益肺清化颗粒低、中剂量组VEGF表达低于对照组（P<0.01），吉非替尼组VEGF表达低于对照组（P<0.05），益肺清化颗粒高剂量组、吉非替尼+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组VEGF表达低于对照组（P<0.001）；益肺清化颗粒低、中、高剂量组，吉非替尼组及CTX组KDR表达与对照组比较均有所降低（P<0.05）。结论 益肺清化颗粒可降低VEGF及其受体KDR的表达，进而发挥抑瘤作用。
关键词：益肺清化颗粒；肺癌；血管内皮细胞生长因子；血管内皮细胞生长因子受体；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0029-03
目前肺癌已成为首位恶性肿瘤死亡原因[1]，非小细胞肺癌占肺癌总数的85%以上，约85%以上非小细胞肺癌在确诊时属中晚期而失去根治性手术机会，主要依赖于化疗和生物靶向治疗[2]，但手术及放化疗、生物靶向治疗费用昂贵，给社会及家庭
带来沉重经济负担。Folkman首先在1971年提出肿瘤的生长依赖血管生成的假说，其认为当实体肿瘤直径大于1～2 mm后，周围组织已经不能满足肿瘤生长需要的氧供、营养物质供应和代谢物的清除，它的生长就必须依赖新生血管生成来维持营养供给和排泄代谢产物，否则肿瘤组织会发生退化，因此阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略。肿瘤的血管生成受“血管生成开关”系统精密调控，而血管生成促进因子和抑制因子是
“血管生成开关”的最主要组成部分，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前已知的作用最强的血管生成促进因子。益肺清化颗粒是本院朴炳奎教授以“益气养阴、化痰解毒”为组方原则研制而成的治疗非小细胞肺癌专方，我们应用蛋白质印迹法（Western Blot）检测益肺清化颗粒对Lewis肺癌小鼠移植瘤组织VEGF及其受体（KDR）的表达，从蛋白水平探讨益肺清化颗粒抗肿瘤的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
C57BL/6J小鼠80只，清洁级，雄性，体质量18～20 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009- 0007。中国中医科学院广安门医院Ⅱ级动物房饲养，饲以标准的小鼠合成饲料，自由饮用小鼠专用无菌水，环境温度（20±2）℃，相对湿度36%。
1.2 药物
益肺清化颗粒，北京华神制药有限公司，批号Z20050851；注射用环磷酰胺（CTX），山西普德药业股份有限公司，批号04110602；吉非替尼（Gefitinib），阿斯利康制药有限公司，批号H20040767。
1.3 试剂
一抗：小鼠抗VEGF单抗（abcam公司）、兔抗KDR多抗（Bioworld公司）、小鼠抗β-actin多抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。二抗：HRP标记的羊抗兔、羊抗小鼠（北京普利莱基因技术有限公司）。蛋白定量试剂盒BCATM （promega）、PVDF膜（Millipore）、蛋白预染Marker（Fermentas）、Western Blotting Luminol Reagent （Santa Cruz Biotechnology）。
2 实验方法
2.1 Lewis肺癌模型制备
将Lewis肺癌瘤株（广安门医院肿瘤实验室赠）从液氮中取出迅速放入37 ℃水中融化，14 000 r/min离心5 min，弃上清，用生理盐水-肿瘤（2∶1）稀释，镜下调整细胞浓度至1×107/mL。除空白组外其余小鼠每只右腋皮下接种0.2 mL瘤细胞悬液。传代2次，方法同上。随机分为空白组、对照组、益肺清化颗粒低剂量组、益肺清化颗粒中剂量组、益肺清化颗粒高剂量组、Gefitinib组、Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组。实验第2日开始给药，除CTX组第3日及第7日给药2次外，其余各组均给药14 d。给药剂量参考临床用药量，按人∶小鼠=1∶10换算。
2.2 给药
空白组：不予处理；对照组：纯净水0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒低剂量组：5 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒中剂量组：10 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒高剂量组：10 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日2次；Gefitinib组：100 mg/kg Gefitinib 0.4 mL灌胃，每日1次；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组：上午给予Gefitinib 100 mg/kg 0.4 mL灌胃，下午予益肺清化颗粒10 g/kg 0.4 mL灌胃；CTX组：60 mg/kg CTX 0.2 mL腹腔注射，第3、7日各1次。
2.3 标本与裂解
给药第14日将小鼠断颈处死，迅速剥离瘤块放入液氮中待用。取50 mg肿瘤组织于0.7 mL RIPA 裂解缓冲液（已加入蛋白酶抑制剂）中，匀浆后，转移到1.5 mL的Eppendorf管中，冰浴10 min。4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清。 2.4 蛋白定量
使用BCA蛋白定量试剂盒，按照说明书进行操作。在酶标仪测定590 nm处吸光度，把实验数据转入到统计软件STATISTICA 6.0中绘制回归直线，并计算回归方程，计算出各个样品的蛋白浓度，按照25 ?g或50 ?g蛋白分装，加入等体积的2倍上样缓冲液，煮沸变性5 min后，立即上样，或放置-70 ℃冰箱中保存。
2.5 SDS-PAGE电泳
按照说明配制7.5%、10%、15%的SDS-PAGE胶，凝固后按照说明安装电泳装置，加入电泳缓冲液后取下梳子，分别取各组蛋白样品和预染的蛋白Marker于80 V进行SDS电泳，进入分离胶后电压升至120 V。电泳完毕后打开玻璃板，取下胶，用于Western Blot检测。
2.6 蛋白质印迹法检测
电泳后根据预染Marker的位置，判断目的蛋白在胶上的位置，在合适范围内将胶切下，在转移Buffer中浸泡至少15 min，依照胶的范围分别剪下大小与胶一致的6张滤纸及PVDF膜，将PVDF膜先置于甲醇中1 min，再置于水中2 min，之后转移至转移Buffer中至少5 min，在半干转膜仪上将膜置于下层3张滤纸上，将胶置于膜上，再于胶上盖3层滤纸，之后夹好转膜仪，不要使里面的胶与膜错开，将夹子夹好后置于电泳槽中，按1 mA/cm2电流2.5 h将蛋白转到PVDF膜上。转完的膜浸于含1%（W/V）BSA的TBS-T溶液中室温振摇封闭2 h或过夜，TBS-T室温润洗3次，每次5～10 min，装入杂交袋，用含1%BSA的TBS-T溶液稀释第一抗体，室温振摇孵育3 h，TBS室温润洗3次，每次5～10 min。装入新的杂交袋内，用相应的二抗室温孵育3 h，TBS室温润洗3次，每次5～10 min。膜上滴加化学发光增强剂（Santa Cruz Biotechnology sc-2048），按照试剂说明进行操作，抗体的稀释比例按说明书进行。通过化学发光成像系统ChemiImager5500（Alpha Innotech.）捕获图像。用Gelpro3.2分析计算积分光密度（IOD）值进行统计。
3 统计学方法
数据采用Excel和SPSS16.0软件进行计算和统计，经正态分布和方差齐性检验后，进行方差分析，方差齐的用S-N-K两两比较，方差不齐的用Tamhane两两比较，数据用—x±s表示，检验水准：α=0.05。
4 结果
益肺清化颗粒低、中剂量组VEGF值低于对照组（P<0.01），Gefitinib组VEGF值低于对照组（P<0.05），益肺清化颗粒高剂量组、Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组VEGF值低于对照组（P<0.001）；益肺清化颗粒低、中、高剂量组，Gefitinib组及CTX组KDR值与对照组比较均有所降低（P<0.05）。见表1、图1。
5 讨论
益肺清化颗粒是国家“七五”攻关课题“益气养阴、清热解毒之剂治疗非小细胞肺癌的临床与实验研究”的研究成果，前期临床研究表明，益肺清化颗粒对中晚期肺癌患者具有改善症状、增强体质、减轻化疗引起的毒副反应、提高生存质量、稳定瘤灶、延长生存期等作用[3-7]；前期动物实验研究表明益肺清化颗粒有明显的抑制肿瘤生长和转移的作用[8-13]。
VEGF又称血管渗透性因子，是一种分子量为34～45 kD的分泌性糖蛋白，是目前发现的作用最强的血管生成因子，VEGF主要有3种受体，即VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR、VEGFR-3/Flt-4。而Flk-1/KDR是VEGF发挥促血管生成作用的主要功能性受体，VEGF的生物活性通过表达于内皮细胞的VEGFR特异性介导，具有多重功能[14-15]。其主要作用有：①增强血管通透性，支持肿瘤细胞生长；②刺激血管内皮细胞增殖，并分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解细胞外基质，在整合素作用下形成毛细血管袢；③上调尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物的表达，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，以促进血管形成；④通过与表达于淋巴管内皮细胞的受体结合，淋巴管增殖，癌细胞由于与淋巴管接触点增多而易于侵犯淋巴管，发生淋巴结转移。
本实验采用Western Blot方法研究益肺清化颗粒对VEGF及其受体KDR的影响。结果表明，益肺清化颗粒低、中、高剂量组和Gefitinib组、CTX组及Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组VEGF值低于对照组（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；益肺清化颗粒低、中、高剂量组和Gefitinib组、CTX组KDR值与对照组比较均有所降低（P<0.05）。
益肺清化颗粒治疗非小细胞肺癌的可能作用机制为：降低
VEGF及受体KDR的表达，进而发挥抑瘤作用；益肺清化颗粒高剂量组VEGF表达低于益肺清化颗粒低、中剂量组，反映出中药复方益肺清化颗粒对VEGF的抑制作用有一定的量效关系；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组VEGF表达低于Gefitinib组及益肺清化颗粒中剂量组，说明益肺清化颗粒与Gefitinib具有一定的协同作用；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组KDR表达高于对照组，但差异无统计学意义。说明益肺清化颗粒对肿瘤血管生成不同环节的作用可能有所不同，抑或是实验个别环节的误差所致，有待进一步研究。
参考文献：
[1] Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. Cancer statistics[J]. CA：A Cancer Journal for Clinicians，2010，60（5）：277-300.
[2] Ettinger DS， Akerley W， Bepler G， et al. Non-small lung cancer[J]. J Natl Compr Canc Netw，2010，9（7）：740-801. [3] 朴炳奎.益肺清化颗粒的开发和研究[C]//国际中西医肿瘤研究论坛论文专辑.上海：中西医结合学报，2008：29-33.
[4] 冯利，花宝金，朴炳奎.肺瘤平Ⅱ号改善肺癌患者生存质量临床研究[J].中国中医药信息杂志，2006，13（12）：12-13.
[5] 李树奇，林红生，张宗歧，等.肺瘤平对中晚期肺癌患者血液流变学和抗凝血酶Ⅲ影响的临床研究[J].中国中西医结合外科杂志，1995，l（2）：84-88.
[6] 范明文，江瑜.益肺清化颗粒治疗晚期肺癌30例[J].光明中医，2009， 24（9）：1691-1692.
[7] 孙宏新，蒋士卿，朴炳奎，等.益肺清化膏对早期非小细胞肺癌术后患者治疗作用的随机对照研究[J].光明中医，2005，20（5）：55-58.
[8] 冯利，花宝金，朴炳奎，等.肺瘤平Ⅱ号对Lewis肺癌小鼠瘤细胞CD44V6及CD49表达的影响[J].中国新药杂志，2007，16（1）：33-35.
[9] 冯利，朴炳奎.肺瘤平Ⅱ号对Lewis肺癌小鼠瘤组织MMP-9及TIMP-1的mRNA表达的影响[J].中国新药杂志，2005，14（10）：1162-1165.
[10] 李树奇，李杰，孙桂芝，等.肺瘤平Ⅱ号对荷瘤大鼠血液流变学调节作用的研究[J].中国中西医结合杂志，1995，S1：249-251.
[11] 郑红刚，朴炳奎，花宝金，等.肺瘤平膏及其拆方对Lewis肺癌小鼠树突状细胞影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2010，30（12）：1288-1292.
[12] 蒋士卿，孙宏新，朴炳奎.益肺清化膏对荷瘤小鼠瘤组织CD44、CD44v6、E-cad等mRNA表达水平的影响[J].中医学报，2010，146（25）：17-20.
[13] 孙宏新，蒋士卿，朴炳奎.益肺清化膏含药血清对肺癌细胞株的抑制作用[J].中医研究，2005，18（10）：12-13.
[14] Gille H， Kowalski J， Li B， et al. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1（VEGFR-1） and KDR（VEGFR-2）. A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants[J]. J Biol Chem， 2001，276（5）：3222-3230.
[15] Gershenwald JE， Fidler IJ. Targeting lymphatic metastasis[J]. Science，2002，296（5574）：1811-1812.
（收稿日期：2012-11-26，编辑：华强）
关键词：益肺清化颗粒；肺癌；血管内皮细胞生长因子；血管内皮细胞生长因子受体；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0029-03
目前肺癌已成为首位恶性肿瘤死亡原因[1]，非小细胞肺癌占肺癌总数的85%以上，约85%以上非小细胞肺癌在确诊时属中晚期而失去根治性手术机会，主要依赖于化疗和生物靶向治疗[2]，但手术及放化疗、生物靶向治疗费用昂贵，给社会及家庭
带来沉重经济负担。Folkman首先在1971年提出肿瘤的生长依赖血管生成的假说，其认为当实体肿瘤直径大于1～2 mm后，周围组织已经不能满足肿瘤生长需要的氧供、营养物质供应和代谢物的清除，它的生长就必须依赖新生血管生成来维持营养供给和排泄代谢产物，否则肿瘤组织会发生退化，因此阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略。肿瘤的血管生成受“血管生成开关”系统精密调控，而血管生成促进因子和抑制因子是
“血管生成开关”的最主要组成部分，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前已知的作用最强的血管生成促进因子。益肺清化颗粒是本院朴炳奎教授以“益气养阴、化痰解毒”为组方原则研制而成的治疗非小细胞肺癌专方，我们应用蛋白质印迹法（Western Blot）检测益肺清化颗粒对Lewis肺癌小鼠移植瘤组织VEGF及其受体（KDR）的表达，从蛋白水平探讨益肺清化颗粒抗肿瘤的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
C57BL/6J小鼠80只，清洁级，雄性，体质量18～20 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009- 0007。中国中医科学院广安门医院Ⅱ级动物房饲养，饲以标准的小鼠合成饲料，自由饮用小鼠专用无菌水，环境温度（20±2）℃，相对湿度36%。
1.2 药物
益肺清化颗粒，北京华神制药有限公司，批号Z20050851；注射用环磷酰胺（CTX），山西普德药业股份有限公司，批号04110602；吉非替尼（Gefitinib），阿斯利康制药有限公司，批号H20040767。
1.3 试剂
一抗：小鼠抗VEGF单抗（abcam公司）、兔抗KDR多抗（Bioworld公司）、小鼠抗β-actin多抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。二抗：HRP标记的羊抗兔、羊抗小鼠（北京普利莱基因技术有限公司）。蛋白定量试剂盒BCATM （promega）、PVDF膜（Millipore）、蛋白预染Marker（Fermentas）、Western Blotting Luminol Reagent （Santa Cruz Biotechnology）。
2 实验方法
2.1 Lewis肺癌模型制备
将Lewis肺癌瘤株（广安门医院肿瘤实验室赠）从液氮中取出迅速放入37 ℃水中融化，14 000 r/min离心5 min，弃上清，用生理盐水-肿瘤（2∶1）稀释，镜下调整细胞浓度至1×107/mL。除空白组外其余小鼠每只右腋皮下接种0.2 mL瘤细胞悬液。传代2次，方法同上。随机分为空白组、对照组、益肺清化颗粒低剂量组、益肺清化颗粒中剂量组、益肺清化颗粒高剂量组、Gefitinib组、Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组。实验第2日开始给药，除CTX组第3日及第7日给药2次外，其余各组均给药14 d。给药剂量参考临床用药量，按人∶小鼠=1∶10换算。
2.2 给药
空白组：不予处理；对照组：纯净水0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒低剂量组：5 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒中剂量组：10 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日1次；益肺清化颗粒高剂量组：10 g/kg益肺清化颗粒0.4 mL灌胃，每日2次；Gefitinib组：100 mg/kg Gefitinib 0.4 mL灌胃，每日1次；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组：上午给予Gefitinib 100 mg/kg 0.4 mL灌胃，下午予益肺清化颗粒10 g/kg 0.4 mL灌胃；CTX组：60 mg/kg CTX 0.2 mL腹腔注射，第3、7日各1次。
2.3 标本与裂解
给药第14日将小鼠断颈处死，迅速剥离瘤块放入液氮中待用。取50 mg肿瘤组织于0.7 mL RIPA 裂解缓冲液（已加入蛋白酶抑制剂）中，匀浆后，转移到1.5 mL的Eppendorf管中，冰浴10 min。4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清。 2.4 蛋白定量
使用BCA蛋白定量试剂盒，按照说明书进行操作。在酶标仪测定590 nm处吸光度，把实验数据转入到统计软件STATISTICA 6.0中绘制回归直线，并计算回归方程，计算出各个样品的蛋白浓度，按照25 ?g或50 ?g蛋白分装，加入等体积的2倍上样缓冲液，煮沸变性5 min后，立即上样，或放置-70 ℃冰箱中保存。
2.5 SDS-PAGE电泳
按照说明配制7.5%、10%、15%的SDS-PAGE胶，凝固后按照说明安装电泳装置，加入电泳缓冲液后取下梳子，分别取各组蛋白样品和预染的蛋白Marker于80 V进行SDS电泳，进入分离胶后电压升至120 V。电泳完毕后打开玻璃板，取下胶，用于Western Blot检测。
2.6 蛋白质印迹法检测
电泳后根据预染Marker的位置，判断目的蛋白在胶上的位置，在合适范围内将胶切下，在转移Buffer中浸泡至少15 min，依照胶的范围分别剪下大小与胶一致的6张滤纸及PVDF膜，将PVDF膜先置于甲醇中1 min，再置于水中2 min，之后转移至转移Buffer中至少5 min，在半干转膜仪上将膜置于下层3张滤纸上，将胶置于膜上，再于胶上盖3层滤纸，之后夹好转膜仪，不要使里面的胶与膜错开，将夹子夹好后置于电泳槽中，按1 mA/cm2电流2.5 h将蛋白转到PVDF膜上。转完的膜浸于含1%（W/V）BSA的TBS-T溶液中室温振摇封闭2 h或过夜，TBS-T室温润洗3次，每次5～10 min，装入杂交袋，用含1%BSA的TBS-T溶液稀释第一抗体，室温振摇孵育3 h，TBS室温润洗3次，每次5～10 min。装入新的杂交袋内，用相应的二抗室温孵育3 h，TBS室温润洗3次，每次5～10 min。膜上滴加化学发光增强剂（Santa Cruz Biotechnology sc-2048），按照试剂说明进行操作，抗体的稀释比例按说明书进行。通过化学发光成像系统ChemiImager5500（Alpha Innotech.）捕获图像。用Gelpro3.2分析计算积分光密度（IOD）值进行统计。
3 统计学方法
数据采用Excel和SPSS16.0软件进行计算和统计，经正态分布和方差齐性检验后，进行方差分析，方差齐的用S-N-K两两比较，方差不齐的用Tamhane两两比较，数据用—x±s表示，检验水准：α=0.05。
4 结果
益肺清化颗粒低、中剂量组VEGF值低于对照组（P<0.01），Gefitinib组VEGF值低于对照组（P<0.05），益肺清化颗粒高剂量组、Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组、CTX组VEGF值低于对照组（P<0.001）；益肺清化颗粒低、中、高剂量组，Gefitinib组及CTX组KDR值与对照组比较均有所降低（P<0.05）。见表1、图1。
5 讨论
益肺清化颗粒是国家“七五”攻关课题“益气养阴、清热解毒之剂治疗非小细胞肺癌的临床与实验研究”的研究成果，前期临床研究表明，益肺清化颗粒对中晚期肺癌患者具有改善症状、增强体质、减轻化疗引起的毒副反应、提高生存质量、稳定瘤灶、延长生存期等作用[3-7]；前期动物实验研究表明益肺清化颗粒有明显的抑制肿瘤生长和转移的作用[8-13]。
VEGF又称血管渗透性因子，是一种分子量为34～45 kD的分泌性糖蛋白，是目前发现的作用最强的血管生成因子，VEGF主要有3种受体，即VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR、VEGFR-3/Flt-4。而Flk-1/KDR是VEGF发挥促血管生成作用的主要功能性受体，VEGF的生物活性通过表达于内皮细胞的VEGFR特异性介导，具有多重功能[14-15]。其主要作用有：①增强血管通透性，支持肿瘤细胞生长；②刺激血管内皮细胞增殖，并分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解细胞外基质，在整合素作用下形成毛细血管袢；③上调尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物的表达，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子，以促进血管形成；④通过与表达于淋巴管内皮细胞的受体结合，淋巴管增殖，癌细胞由于与淋巴管接触点增多而易于侵犯淋巴管，发生淋巴结转移。
本实验采用Western Blot方法研究益肺清化颗粒对VEGF及其受体KDR的影响。结果表明，益肺清化颗粒低、中、高剂量组和Gefitinib组、CTX组及Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组VEGF值低于对照组（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；益肺清化颗粒低、中、高剂量组和Gefitinib组、CTX组KDR值与对照组比较均有所降低（P<0.05）。
益肺清化颗粒治疗非小细胞肺癌的可能作用机制为：降低
VEGF及受体KDR的表达，进而发挥抑瘤作用；益肺清化颗粒高剂量组VEGF表达低于益肺清化颗粒低、中剂量组，反映出中药复方益肺清化颗粒对VEGF的抑制作用有一定的量效关系；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组VEGF表达低于Gefitinib组及益肺清化颗粒中剂量组，说明益肺清化颗粒与Gefitinib具有一定的协同作用；Gefitinib+益肺清化颗粒中剂量组KDR表达高于对照组，但差异无统计学意义。说明益肺清化颗粒对肿瘤血管生成不同环节的作用可能有所不同，抑或是实验个别环节的误差所致，有待进一步研究。
参考文献：
[1] Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. Cancer statistics[J]. CA：A Cancer Journal for Clinicians，2010，60（5）：277-300.
[2] Ettinger DS， Akerley W， Bepler G， et al. Non-small lung cancer[J]. J Natl Compr Canc Netw，2010，9（7）：740-801. [3] 朴炳奎.益肺清化颗粒的开发和研究[C]//国际中西医肿瘤研究论坛论文专辑.上海：中西医结合学报，2008：29-33.
[4] 冯利，花宝金，朴炳奎.肺瘤平Ⅱ号改善肺癌患者生存质量临床研究[J].中国中医药信息杂志，2006，13（12）：12-13.
[5] 李树奇，林红生，张宗歧，等.肺瘤平对中晚期肺癌患者血液流变学和抗凝血酶Ⅲ影响的临床研究[J].中国中西医结合外科杂志，1995，l（2）：84-88.
[6] 范明文，江瑜.益肺清化颗粒治疗晚期肺癌30例[J].光明中医，2009， 24（9）：1691-1692.
[7] 孙宏新，蒋士卿，朴炳奎，等.益肺清化膏对早期非小细胞肺癌术后患者治疗作用的随机对照研究[J].光明中医，2005，20（5）：55-58.
[8] 冯利，花宝金，朴炳奎，等.肺瘤平Ⅱ号对Lewis肺癌小鼠瘤细胞CD44V6及CD49表达的影响[J].中国新药杂志，2007，16（1）：33-35.
[9] 冯利，朴炳奎.肺瘤平Ⅱ号对Lewis肺癌小鼠瘤组织MMP-9及TIMP-1的mRNA表达的影响[J].中国新药杂志，2005，14（10）：1162-1165.
[10] 李树奇，李杰，孙桂芝，等.肺瘤平Ⅱ号对荷瘤大鼠血液流变学调节作用的研究[J].中国中西医结合杂志，1995，S1：249-251.
[11] 郑红刚，朴炳奎，花宝金，等.肺瘤平膏及其拆方对Lewis肺癌小鼠树突状细胞影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2010，30（12）：1288-1292.
[12] 蒋士卿，孙宏新，朴炳奎.益肺清化膏对荷瘤小鼠瘤组织CD44、CD44v6、E-cad等mRNA表达水平的影响[J].中医学报，2010，146（25）：17-20.
[13] 孙宏新，蒋士卿，朴炳奎.益肺清化膏含药血清对肺癌细胞株的抑制作用[J].中医研究，2005，18（10）：12-13.
[14] Gille H， Kowalski J， Li B， et al. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1（VEGFR-1） and KDR（VEGFR-2）. A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants[J]. J Biol Chem， 2001，276（5）：3222-3230.
[15] Gershenwald JE， Fidler IJ. Targeting lymphatic metastasis[J]. Science，2002，296（5574）：1811-1812.
（收稿日期：2012-11-26，编辑：华强）