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摘 要 鲨烯合酶（SQS）是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷（Eriobotrya japonica L.）悬浮培养细胞为材料，采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS（Squalene synthase）基因的cDNA全长序列（GenBank，JQ294055），共1 775 bp，包含了5′非编码区为97 bp，开放阅读框为1 239 bp，3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列（含412个氨基酸）与其它植物SQS具有79%～94%同源性，包含Trans_IPPS_HH保守结构域，可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。
关键词 枇杷；鲨烯合酶基因；基因克隆；序列分析
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Cloning and Sequence Analysis of Squalene Synthase
Gene in Eriobotrya japonica L.
LI Huihua，LIU Xiaoying，WANG Wei，CHANG Qiang，SU Minghua*
Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China
Abstract The cDNA of SQS（Squalene Synthase Gene）， which was an importent enzyme of terpenes synthesis， was cloned with RT-PCR and RACE from cell suspension culture of Eriobotrya japonica L. The full length of Ej-SQS cDNA（GenBank， JQ294055）， about 1 775 bp， consisted of an open reading frame of 1 239 bp， and 5′ and 3′ un-translated regions of 97 bp and 439 bp respectively. The putative protein had 412 amino acids， and the identity to the other polypeptides varied between 79%～94%， contained Trans_IPPS_HH conserved domains， and belonged to isoprenoid biosynthesis enzymes， class 1 family. It was the foundation of the further regulation of loquat cell suspension cultures to extract the desired product， using genetic engineering.
Key words Eriobotrya japonica L.； Squalene synthase gene； Gene cloning； Sequence analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.009
枇杷（Eriobotrya japonica L.）属蔷薇科（Rosaceae）枇杷属，是原产中国东南部的一种重要的小乔木，果实在秋冬开花，春夏成熟，被称是“果木中独备四时之气者”，除此之外，叶、果、花都是传统的中药，枇杷中三萜酸类成分具有抗炎、降血糖、抗病毒以及抗癌的活性，其中熊果酸（Ursolic Acid，UA）、齐墩果酸、科罗索酸为主要的药用成分，市场十分紧缺，经济价值高[1-4]。
目前对此类化合物的生物合成途径已有一定的了解。整个代谢途径涉及众多酶促反应，其中鲨烯是三萜类、甾醇类、胆固醇类等烯萜类的共同前体，鲨烯合酶（SQS，Squalene synthase，EC2.5.1.21）是生物体中催化类异戊烯代谢途径向甾醇和三萜生物合成转化的第一个关键酶，其催化2分子的法尼基焦磷酸（FPP）尾尾缩合，形成鲨烯（SQ）[5-8]。
在甘草[9]、三七[10]、人参[11-12]等药用植物上已克隆到SQS cDNA全长序列，但枇杷上还没有SQS克隆的相关报道。利用植物细胞悬浮培养技术生产次生代谢产物是目前中药生产中极具潜力的技术路线[13-16]。本研究基于正在进行的枇杷细胞悬浮培养调控目标产物UA含量的试验，克隆枇杷三萜酸合成途径中的关键酶SQS基因的cDNA全长序列，为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采用枇杷（Eriobotrya japonica L.）品种早钟6号，其幼胚中诱导的愈伤组织经过多次继代后转液体培养，经人工调控后建立悬浮细胞系，以此为试验材料，由福建省亚热带植物研究所（厦门）细胞培养实验室保存，具体建立方法参见李惠华等[17]。试验于2011～2012年开展完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及逆转录 采用北京天恩泽公司的柱式植物RNAOUT 2.0参考试剂盒，按照说明书提取枇杷细胞悬浮培养物总RNA；采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以Oligo（dT）18为引物参照说明书进行逆转录。
关键词 枇杷；鲨烯合酶基因；基因克隆；序列分析
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Cloning and Sequence Analysis of Squalene Synthase
Gene in Eriobotrya japonica L.
LI Huihua，LIU Xiaoying，WANG Wei，CHANG Qiang，SU Minghua*
Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China
Abstract The cDNA of SQS（Squalene Synthase Gene）， which was an importent enzyme of terpenes synthesis， was cloned with RT-PCR and RACE from cell suspension culture of Eriobotrya japonica L. The full length of Ej-SQS cDNA（GenBank， JQ294055）， about 1 775 bp， consisted of an open reading frame of 1 239 bp， and 5′ and 3′ un-translated regions of 97 bp and 439 bp respectively. The putative protein had 412 amino acids， and the identity to the other polypeptides varied between 79%～94%， contained Trans_IPPS_HH conserved domains， and belonged to isoprenoid biosynthesis enzymes， class 1 family. It was the foundation of the further regulation of loquat cell suspension cultures to extract the desired product， using genetic engineering.
Key words Eriobotrya japonica L.； Squalene synthase gene； Gene cloning； Sequence analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.009
枇杷（Eriobotrya japonica L.）属蔷薇科（Rosaceae）枇杷属，是原产中国东南部的一种重要的小乔木，果实在秋冬开花，春夏成熟，被称是“果木中独备四时之气者”，除此之外，叶、果、花都是传统的中药，枇杷中三萜酸类成分具有抗炎、降血糖、抗病毒以及抗癌的活性，其中熊果酸（Ursolic Acid，UA）、齐墩果酸、科罗索酸为主要的药用成分，市场十分紧缺，经济价值高[1-4]。
目前对此类化合物的生物合成途径已有一定的了解。整个代谢途径涉及众多酶促反应，其中鲨烯是三萜类、甾醇类、胆固醇类等烯萜类的共同前体，鲨烯合酶（SQS，Squalene synthase，EC2.5.1.21）是生物体中催化类异戊烯代谢途径向甾醇和三萜生物合成转化的第一个关键酶，其催化2分子的法尼基焦磷酸（FPP）尾尾缩合，形成鲨烯（SQ）[5-8]。
在甘草[9]、三七[10]、人参[11-12]等药用植物上已克隆到SQS cDNA全长序列，但枇杷上还没有SQS克隆的相关报道。利用植物细胞悬浮培养技术生产次生代谢产物是目前中药生产中极具潜力的技术路线[13-16]。本研究基于正在进行的枇杷细胞悬浮培养调控目标产物UA含量的试验，克隆枇杷三萜酸合成途径中的关键酶SQS基因的cDNA全长序列，为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采用枇杷（Eriobotrya japonica L.）品种早钟6号，其幼胚中诱导的愈伤组织经过多次继代后转液体培养，经人工调控后建立悬浮细胞系，以此为试验材料，由福建省亚热带植物研究所（厦门）细胞培养实验室保存，具体建立方法参见李惠华等[17]。试验于2011～2012年开展完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及逆转录 采用北京天恩泽公司的柱式植物RNAOUT 2.0参考试剂盒，按照说明书提取枇杷细胞悬浮培养物总RNA；采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以Oligo（dT）18为引物参照说明书进行逆转录。