论文部分内容阅读
摘 要:RNAi作为一种调控特定基因表达的手段，被称为基因组的免疫现象，已成为最近生物医学领域的研究焦点之一，其发现为疾病治疗提供了全新的途径，并给整个生物理论界带来了巨大而深远的影响。简要介绍了其机制和应用。
关键词：RNAi；RNA；基因组免疫现象；生物医学
中图分类号：R329.2+8文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）12-025-04
RNAi（RNAi interference）是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的 [1] 。人工合成的siRNA（small interfering RNA）是长度为21～25 核苷酸大小的小RNA分子，可以与RISC共同发挥作用，使沉默复合物识别靶目标。在生物体中导入dsRNA，可引起体内同源基因特异性沉默，当病毒RNA侵入细胞后，RNAi就是机体监视系统的成员，可检测病毒信息，降解病毒核酸和蛋白，维持宿主基因组的稳定性，保护机体不受病毒侵犯[2] 。自从1998年Fire等[3]提出siRNA以来，几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的深入研究，为成功地应用RNAi研究与治疗病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病提供了理论基础。[4]
1 历史
1993年报道， 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望使紫色加深，可是，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称为“共抑制”。1995年，康奈尔大学Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA和正义RNA都阻断了基因表达，他们对这个结果百思不得其解[5]。1998年，Andrew Fire研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA，这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的，于是提出了RNAi这个词。2002 年，Zer2nicka -Coetz 等首次在哺乳动物中发现RNAi[6]。同年，Judy Lieberman 和Premlata Shankar 报道了在动物中利用RNAi 技术治疗疾病的研究进展[7]。研究发现,在出现共抑制现象的植物中有一类25 nt的RNA ;加入果蝇胚胎溶解物的dsRNA 会断裂为21～25 nt 的片断;内源性mRNA 在与导入dsRNA 的结合部位也被切割成21 ～ 25 nt 的片断, 为RNAi 机制的重要中间效应分子, 命名为siRNA (small interfering RNA) [8 , 9 ]。
2 生物进化
许多真核生物中都发现了RNAi现象，而在原核生物中却未发现，提示了RNAi的进化地位，但是其在进化中是如何出现，如何保存下来，在生物体中的意义有多大，目前均没有明确，还需要更多研究来阐明。 [5]
3 重要意义
RNAi 受到追捧的原因主要有两方面：①RNAi 可以说是基因功能检验的试金石，利用 RNAi 技术可以缩短对人类基因功能了解和认识的时间，在不久的将来有望将人类大部分基因的功能和作用全部弄清楚；②科研人员有望利用这种技术获得使致病基因失活的新型基因药物，而基因药物一直是生物技术界追捧的对象。[10]
4 RNAi 作用机制与特点
4.1 机制模型[11-14]
RNAi 发生过程大致为3阶段:①起始阶段。dsRNA在细胞内Dicer均匀切割成21~23nt大小siRNA。dsRNA 可以是外源的,也可以是内源的。siRNA长短是种族特异的,5′端是磷酸的,3′端往往突出2 个nt。②扩增阶段。siRNA 与mRNA 靶向性结合,并作为引物,在RdRp 作用下再次形成dsRNA ,dsRNA 又被Dicer切割成siRNA ,新形成的siRNA 又可以进入下一轮循环而达到扩增目的。③效应阶段。 siRNA 和内切核酸以及其它蛋白一起形成RISC (RNA-induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到靶向性作用,蛋白部分则起到降解mRNA 的作用[15] 。
4.2 作用特点
(1)21～23 nt dsRNA 为降解靶基因的中介分子。 Phillip 等发现，501bpPr-dsRNA、505bpPr-dsRNA 在胚胎裂解物中孵育时,约15 %生成了稳定存在的21～23 nt RNA 片段,而且不要求有相应的mRNA 存在， 这证实了小片段RNA 由长dsRNA 切割而来,而不是dsRNA 针对的靶基因mRNA 的产物。进一步研究表明，21～23nt dsRNA7 为降解靶基因的介质分子,决定切割位置。
(2) 细胞RNAi 装置具有饱和性。Susan 等发现，RNAi 反应中特异性dsRNA 到达一定浓度后不可再增加,而非特异性dsRNA 浓度可以改变。研究还发现，随着非特异性dsRNA 浓度增加,特异阻抑反应逐渐减弱。
(3) RNAi 作用广泛。Fire 等在新小杆线虫中发现，dsRNA 介导RNAi 不仅在导入部位产生阻抑效应,而且可以跨越细胞界限弥散到其它腔道和组织,发挥阻抑作用。
(4) RNAi 需要ATP 参与。Phillip 等发现，当ATP 水平由250μmol 降至10μmol 以下,加入外源性ATP ,针对靶基因的dsRNA 没有阻抑基因的表达,因此证明在体外RNAi 是需要ATP 合成的,外源性ATP 不可取代。进一步研究发现，在ATP 合成缺失的裂解物中不能发生RNAi 。
(5) RNAi 过程不需蛋白辅助。Phillip 等用环己亚胺等合成拮抗剂,发现RNAi 仍以正常效率作用,说明RNAi 中不需合成蛋白辅助产生阻抑效应。
(6) RNAi 作用的靶基因有一定的选择性。Andrew 等发现，保守基因更易产生RNAi 效应,
而且神经元细胞较其它类型细胞对RNAi 不敏感。参与精子运动的基因也很少能够发生RNAi 效应。[17]
5 应用进展
5.1 肿瘤抑制中的进展
传统技术诱导的单个癌基因的阻断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的生长，也很难达到预期的治疗效果，而利用siRNA干涉技术能异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因过度表达，使基因保持静寂或休眠状态，且抑制效果互不干扰，从而有望达到抗肿瘤作用。
5.2 拯救病毒或创造新病毒
根据一些病毒的已知核酸序列,采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”
的病毒,得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒,这给通过获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了全新的途径。也可在生产疫苗时,将流行毒株与高产毒株进行基因重配,得到同时具有高产特性和流行毒株抗原性的重组毒株,以提高疫苗产量。[18]
5.3 凋亡辅因子研究中的应用[19]
人类flap 内切核酸酶(FEN21) 涉及DNA 复制及修复,FEN21 在DNA 复制期间对于处理冈崎片段很重要，但是Parrish 发现，编码线虫FEN21 同系物的crn21 ,其蛋白产物作为CPS26PEndoG的辅因子,可以介导凋亡DNA 片段化，而且其对凋亡的正常进行很重要[20]。细胞死亡相关核酸酶(cell death2related nucleases , CRN21) 定位于细胞核, 利用CPS26的内切核酸酶活性、CRN21的5′2 3′外切核酸酶活性及其缺口依赖性、内切核酸酶活性,CRN21 能结合并协同CPS26促进DNA 逐步片段化。用RNAi 减少crn21 的活性则会引起死亡细胞表型,这些表型类似于缺乏CPS26PEndoG的突变体所展示的表型。研究者证实，CRN21 能生理性结合CPS26 , 而CPS26PCRN21 蛋白相互作用也能在体外刺激蛋白核酸酶活性。这些结果表明，涉及DNA 复制和修复的CRN21 也能作为凋亡核酸酶CPS26 的辅因子。
5.4 基因治疗
针对有害基因序列设计dsRNA ,将dsRNA 导入生物体内,或让dsRNA 在生物体内转录,利用dsRNA 引发其同源内源有害基因的mRNA 序列的降解,从而可达到抑制该有害基因表达的目的,包括各种人类疾病,特别是肿瘤[21]和遗传病的相关基因。Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞,特异性抑制了癌基因K RAS(V12) 的表达。Scherr 等以引起慢性髓性白血病和bcrabl 阳性急性成淋巴细胞白血病的癌基因为靶基因设计了对应siRNA ,并获得了87 %的有效抑制率。Elbashir 等成功将Hela 细胞中编码核有丝蛋白、核纤蛋白的基因同时敲除。Wilda 等用siRNA 抑制白血病BCRPABL 融合基因表达也取得了成功[22]。Manus 等开展了对T 细胞的CD4PCD8 同时敲除的实验[21]。
5.5 自身免疫治疗
国外有人用siRNA来考察对不同鼠急性肝衰竭模型的治疗效果。他们在腺病毒表达的Fas配体介导的肝衰竭过程中，在不同时间点给鼠注射caspase8siRNA，以抑制caspase8基因在肝脏的表达，结果防止了Fas介导的细胞凋亡，保护了肝脏，减弱了Fas抗体或腺病毒表达的Fas配体诱导的急性肝衰竭，使鼠的存活率有很大改善，说明siRNA有较大的希望用于治疗患者的急性肝衰竭。另外，使用RNAi技术还可直接干扰Fas的表达，达到治疗的目的。[23]
6 不足
Fraser等在研究中发现，RNAi不能作用于某些基因和细胞类型（如神经元），一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显，如果几个基因有相同或者近似的序列，RNAi会同时作用于它们，这样，所观察到的表型就不能肯定是由哪些基因被干扰所产生的。在医学上，RNAi主要用于抗RNA病毒感染，而对DNA病毒的尝试很少，从RNAi作用机制来看，RNAi技术同样可以用于DNA病毒的防治。另外，对RNAi的研究目前是在体外培养细胞中进行的，离临床运用还有距离。[25]
7 结论
siRNA与RNAi技术真正应用于日常生活还为时尚早，需要科学家们进一步广泛深入、细致持久的研究。尽管如此，我们依然可以预测，与其它基因技术一样， siRNA与RNAi技术将在不久的将来在基因治疗和基因应用中发挥极大作用，并将给整个生物理论界带来巨大而深远的影响。[5]
参考文献：
［1］ Zhu Rui，Zhang Kai-li，Zou Xiang-yang.RNA interference technique and dusing in study of functional genomics［J］.Journal of DaLian Medical University，2003，2（25）:105-107.
［2］ 康洁，刘福林.RNAi，生物体内的基因免疫［J］.生物学通报，2004，8（39）:16-17.
［3］ Fire A，Xu S，Montgometry MK.Potent and specific genetic inter-ference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）:806-811.
［4］ 于洋. RNA 干涉的研究历史、现状和展望［J］ . 黑龙江畜牧兽医,2003(11):68-69.
［5］ 邓凡,罗深秋. dsRNA 介导的RNA 干扰［J］ . 生命的化学2001(4):268-270.
［6］ 孟国良,汤富酬,张俊争. 小鼠胚胎干细胞中RNA 干涉现象［J］.生物化学与生物物理学报,2003 ,35(3) :238 -246.
［7］ 雷迎峰,薛小平,尹文. RNAi 研究进展［J］ . 国外医学(分子生物学分册) ,2002(4) :196 -199.
［8］ 孙建国,廖荣霞,陈正堂. RNA 干涉分子机制研究进展［J］.生物化学与生物物理进展,2002(5) :678 -681.
［9］ Wilda M，Fuchs U，Wossmann W.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference［J］.Oncogene，2002，21（37）:5716-5724.
［10］ Cioca D P，Aoki Y，Kiyosawa K.RNA interfering is a functional path-way with therapeutic potential in human mycloid leukemiaceu lines［J］.Can-cer Gene Therapy，2003，10（3）:125-133.
［11］ Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.Stable suppression of tumori-genicity by virus mediated RNA interference［J］.Cancer Cell，2002，（3）:243-247.
［12］ Elbashir S M，Harbotth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of21-nu-cleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells ［J］. Nature，2001，411（836）:494-498.
［13］ Lin S L，Chuong C M，Ying S Y.A novel mRNA-cDNA interference phenomenon for silencing bel-2expression in human LNCaP cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，281（3）:639-643.
［14］ Schrijver ED，Brusselmans K，Heyns W.RNA interference mediat-ed silencing of fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cell［J］.Cancer Res，2003，63（6）:3799-3804.
［15］ 许小亮, 李君武. RNAi技术在临床中的运用［J］. 广东医学院学报， 2005 （3）：23-24.
［16］ Neema Agrawal, P. V. N. Dasaradhi, Asif Mohmmed, Pawan Malhotra,Raj K. Bhatnagar, Sunil K. Mukherjee.*RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications［J］.International Center for Genetic Engineering and Biotechnology, 2006,35(5):2354-2357.
［17］ 陈燕飞.RNAi技术及其应用［J］.韶关学院学报•自然科学， 2006 (12):33-34.
［18］ 蒋玲艳,王林果.反向遗传学技术及其应用［J］.韶关学院学报•自然科学,2006(32):19-21.
［19］ 黄璐,李新平,霍黉琦.RNAi 技术在凋亡研究中的应用［J］.医学综述，2006(12):12-14.
［20］ Parrish JZ ,Yan Chongling ,Shen Binghui . CRN21 ,a C. elegans FEN21 homologue ,cooperates with CPS26PEndoG to promote apoptotic DNA degradation［J ］ . EMBO J ,2003 ,22(13) :345123460.
［21］ 朱睿,张开立,邹向阳. RNA 干扰(RNAi) 技术及其在功能基因组学研究中的应用［J ］ . 大连医科大学学报，2003 (6) :105.
［22］ 李刚,李湘平. RNAi 研究现状与进展［J ］ . 广东医学,2003(3) :327 -329.
［23］ 李小燕.RNAi技术在药物研究中应用范围日趋广泛［J］.中国医药报，2004(5):67-69.
［24］ 高民. RNAi技术在医学上的应用研究进展［J］.中华医学研究杂志，2005,5（3）:89-93.
［25］ Fraser A G，Kmath R S，Zipperlen P.Functional genomic analysis of C elegans chromosome1by systematic RNA interference［J］.Nature，2004(08):325-330.
关键词：RNAi；RNA；基因组免疫现象；生物医学
中图分类号：R329.2+8文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）12-025-04
RNAi（RNAi interference）是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的 [1] 。人工合成的siRNA（small interfering RNA）是长度为21～25 核苷酸大小的小RNA分子，可以与RISC共同发挥作用，使沉默复合物识别靶目标。在生物体中导入dsRNA，可引起体内同源基因特异性沉默，当病毒RNA侵入细胞后，RNAi就是机体监视系统的成员，可检测病毒信息，降解病毒核酸和蛋白，维持宿主基因组的稳定性，保护机体不受病毒侵犯[2] 。自从1998年Fire等[3]提出siRNA以来，几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的深入研究，为成功地应用RNAi研究与治疗病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病提供了理论基础。[4]
1 历史
1993年报道， 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望使紫色加深，可是，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称为“共抑制”。1995年，康奈尔大学Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA和正义RNA都阻断了基因表达，他们对这个结果百思不得其解[5]。1998年，Andrew Fire研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA，这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的，于是提出了RNAi这个词。2002 年，Zer2nicka -Coetz 等首次在哺乳动物中发现RNAi[6]。同年，Judy Lieberman 和Premlata Shankar 报道了在动物中利用RNAi 技术治疗疾病的研究进展[7]。研究发现,在出现共抑制现象的植物中有一类25 nt的RNA ;加入果蝇胚胎溶解物的dsRNA 会断裂为21～25 nt 的片断;内源性mRNA 在与导入dsRNA 的结合部位也被切割成21 ～ 25 nt 的片断, 为RNAi 机制的重要中间效应分子, 命名为siRNA (small interfering RNA) [8 , 9 ]。
2 生物进化
许多真核生物中都发现了RNAi现象，而在原核生物中却未发现，提示了RNAi的进化地位，但是其在进化中是如何出现，如何保存下来，在生物体中的意义有多大，目前均没有明确，还需要更多研究来阐明。 [5]
3 重要意义
RNAi 受到追捧的原因主要有两方面：①RNAi 可以说是基因功能检验的试金石，利用 RNAi 技术可以缩短对人类基因功能了解和认识的时间，在不久的将来有望将人类大部分基因的功能和作用全部弄清楚；②科研人员有望利用这种技术获得使致病基因失活的新型基因药物，而基因药物一直是生物技术界追捧的对象。[10]
4 RNAi 作用机制与特点
4.1 机制模型[11-14]
RNAi 发生过程大致为3阶段:①起始阶段。dsRNA在细胞内Dicer均匀切割成21~23nt大小siRNA。dsRNA 可以是外源的,也可以是内源的。siRNA长短是种族特异的,5′端是磷酸的,3′端往往突出2 个nt。②扩增阶段。siRNA 与mRNA 靶向性结合,并作为引物,在RdRp 作用下再次形成dsRNA ,dsRNA 又被Dicer切割成siRNA ,新形成的siRNA 又可以进入下一轮循环而达到扩增目的。③效应阶段。 siRNA 和内切核酸以及其它蛋白一起形成RISC (RNA-induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到靶向性作用,蛋白部分则起到降解mRNA 的作用[15] 。
4.2 作用特点
(1)21～23 nt dsRNA 为降解靶基因的中介分子。 Phillip 等发现，501bpPr-dsRNA、505bpPr-dsRNA 在胚胎裂解物中孵育时,约15 %生成了稳定存在的21～23 nt RNA 片段,而且不要求有相应的mRNA 存在， 这证实了小片段RNA 由长dsRNA 切割而来,而不是dsRNA 针对的靶基因mRNA 的产物。进一步研究表明，21～23nt dsRNA7 为降解靶基因的介质分子,决定切割位置。
(2) 细胞RNAi 装置具有饱和性。Susan 等发现，RNAi 反应中特异性dsRNA 到达一定浓度后不可再增加,而非特异性dsRNA 浓度可以改变。研究还发现，随着非特异性dsRNA 浓度增加,特异阻抑反应逐渐减弱。
(3) RNAi 作用广泛。Fire 等在新小杆线虫中发现，dsRNA 介导RNAi 不仅在导入部位产生阻抑效应,而且可以跨越细胞界限弥散到其它腔道和组织,发挥阻抑作用。
(4) RNAi 需要ATP 参与。Phillip 等发现，当ATP 水平由250μmol 降至10μmol 以下,加入外源性ATP ,针对靶基因的dsRNA 没有阻抑基因的表达,因此证明在体外RNAi 是需要ATP 合成的,外源性ATP 不可取代。进一步研究发现，在ATP 合成缺失的裂解物中不能发生RNAi 。
(5) RNAi 过程不需蛋白辅助。Phillip 等用环己亚胺等合成拮抗剂,发现RNAi 仍以正常效率作用,说明RNAi 中不需合成蛋白辅助产生阻抑效应。
(6) RNAi 作用的靶基因有一定的选择性。Andrew 等发现，保守基因更易产生RNAi 效应,
而且神经元细胞较其它类型细胞对RNAi 不敏感。参与精子运动的基因也很少能够发生RNAi 效应。[17]
5 应用进展
5.1 肿瘤抑制中的进展
传统技术诱导的单个癌基因的阻断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的生长，也很难达到预期的治疗效果，而利用siRNA干涉技术能异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因过度表达，使基因保持静寂或休眠状态，且抑制效果互不干扰，从而有望达到抗肿瘤作用。
5.2 拯救病毒或创造新病毒
根据一些病毒的已知核酸序列,采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”
的病毒,得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒,这给通过获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了全新的途径。也可在生产疫苗时,将流行毒株与高产毒株进行基因重配,得到同时具有高产特性和流行毒株抗原性的重组毒株,以提高疫苗产量。[18]
5.3 凋亡辅因子研究中的应用[19]
人类flap 内切核酸酶(FEN21) 涉及DNA 复制及修复,FEN21 在DNA 复制期间对于处理冈崎片段很重要，但是Parrish 发现，编码线虫FEN21 同系物的crn21 ,其蛋白产物作为CPS26PEndoG的辅因子,可以介导凋亡DNA 片段化，而且其对凋亡的正常进行很重要[20]。细胞死亡相关核酸酶(cell death2related nucleases , CRN21) 定位于细胞核, 利用CPS26的内切核酸酶活性、CRN21的5′2 3′外切核酸酶活性及其缺口依赖性、内切核酸酶活性,CRN21 能结合并协同CPS26促进DNA 逐步片段化。用RNAi 减少crn21 的活性则会引起死亡细胞表型,这些表型类似于缺乏CPS26PEndoG的突变体所展示的表型。研究者证实，CRN21 能生理性结合CPS26 , 而CPS26PCRN21 蛋白相互作用也能在体外刺激蛋白核酸酶活性。这些结果表明，涉及DNA 复制和修复的CRN21 也能作为凋亡核酸酶CPS26 的辅因子。
5.4 基因治疗
针对有害基因序列设计dsRNA ,将dsRNA 导入生物体内,或让dsRNA 在生物体内转录,利用dsRNA 引发其同源内源有害基因的mRNA 序列的降解,从而可达到抑制该有害基因表达的目的,包括各种人类疾病,特别是肿瘤[21]和遗传病的相关基因。Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞,特异性抑制了癌基因K RAS(V12) 的表达。Scherr 等以引起慢性髓性白血病和bcrabl 阳性急性成淋巴细胞白血病的癌基因为靶基因设计了对应siRNA ,并获得了87 %的有效抑制率。Elbashir 等成功将Hela 细胞中编码核有丝蛋白、核纤蛋白的基因同时敲除。Wilda 等用siRNA 抑制白血病BCRPABL 融合基因表达也取得了成功[22]。Manus 等开展了对T 细胞的CD4PCD8 同时敲除的实验[21]。
5.5 自身免疫治疗
国外有人用siRNA来考察对不同鼠急性肝衰竭模型的治疗效果。他们在腺病毒表达的Fas配体介导的肝衰竭过程中，在不同时间点给鼠注射caspase8siRNA，以抑制caspase8基因在肝脏的表达，结果防止了Fas介导的细胞凋亡，保护了肝脏，减弱了Fas抗体或腺病毒表达的Fas配体诱导的急性肝衰竭，使鼠的存活率有很大改善，说明siRNA有较大的希望用于治疗患者的急性肝衰竭。另外，使用RNAi技术还可直接干扰Fas的表达，达到治疗的目的。[23]
6 不足
Fraser等在研究中发现，RNAi不能作用于某些基因和细胞类型（如神经元），一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显，如果几个基因有相同或者近似的序列，RNAi会同时作用于它们，这样，所观察到的表型就不能肯定是由哪些基因被干扰所产生的。在医学上，RNAi主要用于抗RNA病毒感染，而对DNA病毒的尝试很少，从RNAi作用机制来看，RNAi技术同样可以用于DNA病毒的防治。另外，对RNAi的研究目前是在体外培养细胞中进行的，离临床运用还有距离。[25]
7 结论
siRNA与RNAi技术真正应用于日常生活还为时尚早，需要科学家们进一步广泛深入、细致持久的研究。尽管如此，我们依然可以预测，与其它基因技术一样， siRNA与RNAi技术将在不久的将来在基因治疗和基因应用中发挥极大作用，并将给整个生物理论界带来巨大而深远的影响。[5]
参考文献：
［1］ Zhu Rui，Zhang Kai-li，Zou Xiang-yang.RNA interference technique and dusing in study of functional genomics［J］.Journal of DaLian Medical University，2003，2（25）:105-107.
［2］ 康洁，刘福林.RNAi，生物体内的基因免疫［J］.生物学通报，2004，8（39）:16-17.
［3］ Fire A，Xu S，Montgometry MK.Potent and specific genetic inter-ference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）:806-811.
［4］ 于洋. RNA 干涉的研究历史、现状和展望［J］ . 黑龙江畜牧兽医,2003(11):68-69.
［5］ 邓凡,罗深秋. dsRNA 介导的RNA 干扰［J］ . 生命的化学2001(4):268-270.
［6］ 孟国良,汤富酬,张俊争. 小鼠胚胎干细胞中RNA 干涉现象［J］.生物化学与生物物理学报,2003 ,35(3) :238 -246.
［7］ 雷迎峰,薛小平,尹文. RNAi 研究进展［J］ . 国外医学(分子生物学分册) ,2002(4) :196 -199.
［8］ 孙建国,廖荣霞,陈正堂. RNA 干涉分子机制研究进展［J］.生物化学与生物物理进展,2002(5) :678 -681.
［9］ Wilda M，Fuchs U，Wossmann W.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference［J］.Oncogene，2002，21（37）:5716-5724.
［10］ Cioca D P，Aoki Y，Kiyosawa K.RNA interfering is a functional path-way with therapeutic potential in human mycloid leukemiaceu lines［J］.Can-cer Gene Therapy，2003，10（3）:125-133.
［11］ Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.Stable suppression of tumori-genicity by virus mediated RNA interference［J］.Cancer Cell，2002，（3）:243-247.
［12］ Elbashir S M，Harbotth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of21-nu-cleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells ［J］. Nature，2001，411（836）:494-498.
［13］ Lin S L，Chuong C M，Ying S Y.A novel mRNA-cDNA interference phenomenon for silencing bel-2expression in human LNCaP cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2001，281（3）:639-643.
［14］ Schrijver ED，Brusselmans K，Heyns W.RNA interference mediat-ed silencing of fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cell［J］.Cancer Res，2003，63（6）:3799-3804.
［15］ 许小亮, 李君武. RNAi技术在临床中的运用［J］. 广东医学院学报， 2005 （3）：23-24.
［16］ Neema Agrawal, P. V. N. Dasaradhi, Asif Mohmmed, Pawan Malhotra,Raj K. Bhatnagar, Sunil K. Mukherjee.*RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications［J］.International Center for Genetic Engineering and Biotechnology, 2006,35(5):2354-2357.
［17］ 陈燕飞.RNAi技术及其应用［J］.韶关学院学报•自然科学， 2006 (12):33-34.
［18］ 蒋玲艳,王林果.反向遗传学技术及其应用［J］.韶关学院学报•自然科学,2006(32):19-21.
［19］ 黄璐,李新平,霍黉琦.RNAi 技术在凋亡研究中的应用［J］.医学综述，2006(12):12-14.
［20］ Parrish JZ ,Yan Chongling ,Shen Binghui . CRN21 ,a C. elegans FEN21 homologue ,cooperates with CPS26PEndoG to promote apoptotic DNA degradation［J ］ . EMBO J ,2003 ,22(13) :345123460.
［21］ 朱睿,张开立,邹向阳. RNA 干扰(RNAi) 技术及其在功能基因组学研究中的应用［J ］ . 大连医科大学学报，2003 (6) :105.
［22］ 李刚,李湘平. RNAi 研究现状与进展［J ］ . 广东医学,2003(3) :327 -329.
［23］ 李小燕.RNAi技术在药物研究中应用范围日趋广泛［J］.中国医药报，2004(5):67-69.
［24］ 高民. RNAi技术在医学上的应用研究进展［J］.中华医学研究杂志，2005,5（3）:89-93.
［25］ Fraser A G，Kmath R S，Zipperlen P.Functional genomic analysis of C elegans chromosome1by systematic RNA interference［J］.Nature，2004(08):325-330.