论文部分内容阅读
摘 要：为筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺，保证疫苗产品质量及免疫效果，更好地服务于畜牧业。本试验从冻干保护剂配方与冻干曲线入手，将含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV_ILTVgB）抗原按规定配比，分别在21、24.5、28 h的冻干曲线下完成冻干，并对冻干后的制品检测其效价、真空度、剩余水分及物理性状。结果表明，有1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线和1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线三种冻干工艺，其制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均符合标准。因而采用1.0%明胶5%蔗糖的保护剂配方及24.5 h的冻干曲线是该制品较为理想的冻干工艺。
关键词：鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗;保护剂配方;冻干曲线
近几年，人民生活水平日益提高，对畜产品的需求不断增大，而保障畜禽安全尤为重要，兽用疫苗在预防疫病方面发挥着举足轻重的作用，因冻干制品不但会延长了制品的保存期，而且作为基础免疫广泛使用。冷冻干燥技术是指把欲冻溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待大量水分升华结束后再进行解析干燥，除去部分结合水的干燥方法。冻干时需添加一些辅助物，在干燥后起支撑与保护制品作用，该种物质称为冻干保护剂。在兽用生物制品保护剂中，常用的有牛奶、蔗糖和明胶。由于明胶蔗糖保护剂成本低、制备容易、保存方便及与抗原配比时用量小，可增加冻干苗的单位（瓶）产量等优点[1]。本试验选择不同浓度的明胶5%蔗糖保护剂与表达鸡传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒（rFPV_ILTVgB）按规定配比混匀后，采用不同冻干曲线进行制品冻干试验，旨在筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺（即设定冻干机板层的不同温度及其经过时间），以保障兽用疫苗的产品质量。
1 材料与方法
1.1 主要设备 GLZZQ-1型冻干机，北京速原真空技术有限公司;真空干燥箱（BZX-6090），上海福玛实验设备有限公司。
1.2 病毒液 按《鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程》中方法[2]生产其合格病毒液，来源于杨凌绿方生物工程有限公司冻干苗车间细胞班，批号20190403。
1.3 明胶 分析纯，国药集团化药试剂有限公司，批号F20180620。
1.4 冻干样品制备
1.4.1 将已灭菌的含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒液按规定的配比混匀后，分装于10 mL西林瓶，2.5 mL/瓶，分别在21、24.5、28h的冻干曲线下冻干，冻干后抽样检验，冻干曲线见图1、2、3。
如图1所示，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持9.5 h完成产品升华干燥;在2.5 h内将板层升温至28 ℃，维持4.5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
如图2所示，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持13 h完成产品升华干燥;在2h内将板层升温至28 ℃，维持5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
如图3所示，28 h冻干曲线，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持16.5 h完成产品升华干燥;在1.5 h内将板层升温至28 ℃，维持5.5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
1.4.2 按1.4.1方法再重复冻干两次。
1.5 冻干制品检测
1.5.1 物理性状、真空度及剩余水分检测 按《中华人民共和国兽药典》中方法[3]及标准[5]进行。合格标准认定：物理性状，淡黄色疏松团状，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解成粉红色液体;真空度，将高频火花真空测定器指向容器内无制品的部位，容器内出现白色或粉色或紫色辉光;剩余水分，应不超过4%[4]。
1.5.2 效价测定 按《鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程》中方法[2]及标准[5]进行。合格标准：鸡传染性喉气管炎要达对照鸡≥7/10发病，免疫鸡≥7/10保护;鸡痘每羽份病毒含量≥1.0×104 PFU。
2 结果
冻干制品的检测结果见表1、2、3。
从表1看出，此冻干曲线下，只有选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品效价、真空度、物理性状均合格，但是剩余水分含量高于国标4.0%[4]，综合判定全为不合格制品。
从表2看出，此冻干曲线下，只有选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品的效价、真空度、剩余水分、物理性状均合格。
从表3看出，此冻干曲线下，选用1.0%、1.2%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均合格。
3 结论
从冻干制品测定结果可以看出，选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线及选用1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线的冻干制品，检测其效价、真空度、剩余水分、物理性状均能达到制品质量指标[5];又从经济效益及生产组织方面考量，24.5 h冻干时间缩短，減轻了设备损耗，降低动力运行费用，生产组织比较便利，而且1.0%的明胶减少了材料消耗成本，因此综合判定1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h冻干曲线为该产品较理想的冻干工艺。
本试验为各企业确定生产环节的冻干工艺，提供了实验数据的参考，建议结合企业自身实际，灵活运用。但有关冻干过程中的升华温度和时间对制品质量的影响，有待进一步探索，以不断提升该产品冻干工艺水平，提高产品质量。
参考文献：
[1] 傅德霞，衣宁，贾华强，等.两种冻干保护剂在禽病疫苗生产中的效果比较[J].中国兽药杂志， 1997，（03），10-12.
[2] 中华人民共和国农业部. 鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程[S].北京：中华人民共和国农业部，2005.
[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015年版）[M]. 北京：中国农业出版社，2016.
[4] 农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年版）[S].北京：化学工业出版社，2001.
[5] 中国兽药典委员会.兽药质量标准：生物制品卷（2017年版）[S].北京：中国农业出版社，2017.
□
关键词：鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗;保护剂配方;冻干曲线
近几年，人民生活水平日益提高，对畜产品的需求不断增大，而保障畜禽安全尤为重要，兽用疫苗在预防疫病方面发挥着举足轻重的作用，因冻干制品不但会延长了制品的保存期，而且作为基础免疫广泛使用。冷冻干燥技术是指把欲冻溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待大量水分升华结束后再进行解析干燥，除去部分结合水的干燥方法。冻干时需添加一些辅助物，在干燥后起支撑与保护制品作用，该种物质称为冻干保护剂。在兽用生物制品保护剂中，常用的有牛奶、蔗糖和明胶。由于明胶蔗糖保护剂成本低、制备容易、保存方便及与抗原配比时用量小，可增加冻干苗的单位（瓶）产量等优点[1]。本试验选择不同浓度的明胶5%蔗糖保护剂与表达鸡传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒（rFPV_ILTVgB）按规定配比混匀后，采用不同冻干曲线进行制品冻干试验，旨在筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺（即设定冻干机板层的不同温度及其经过时间），以保障兽用疫苗的产品质量。
1 材料与方法
1.1 主要设备 GLZZQ-1型冻干机，北京速原真空技术有限公司;真空干燥箱（BZX-6090），上海福玛实验设备有限公司。
1.2 病毒液 按《鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程》中方法[2]生产其合格病毒液，来源于杨凌绿方生物工程有限公司冻干苗车间细胞班，批号20190403。
1.3 明胶 分析纯，国药集团化药试剂有限公司，批号F20180620。
1.4 冻干样品制备
1.4.1 将已灭菌的含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒液按规定的配比混匀后，分装于10 mL西林瓶，2.5 mL/瓶，分别在21、24.5、28h的冻干曲线下冻干，冻干后抽样检验，冻干曲线见图1、2、3。
如图1所示，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持9.5 h完成产品升华干燥;在2.5 h内将板层升温至28 ℃，维持4.5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
如图2所示，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持13 h完成产品升华干燥;在2h内将板层升温至28 ℃，维持5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
如图3所示，28 h冻干曲线，冻干机开机后，把其板层温度降到7 ℃，分装产品的西林瓶装进冻干机板层上，经过1.5 h将板层温度降到-40 ℃，维持1.5 h完成产品冻结;在1.5 h内将板层升温至-5 ℃，维持16.5 h完成产品升华干燥;在1.5 h内将板层升温至28 ℃，维持5.5 h完成产品解析干燥后，结束产品冻干过程。
1.4.2 按1.4.1方法再重复冻干两次。
1.5 冻干制品检测
1.5.1 物理性状、真空度及剩余水分检测 按《中华人民共和国兽药典》中方法[3]及标准[5]进行。合格标准认定：物理性状，淡黄色疏松团状，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解成粉红色液体;真空度，将高频火花真空测定器指向容器内无制品的部位，容器内出现白色或粉色或紫色辉光;剩余水分，应不超过4%[4]。
1.5.2 效价测定 按《鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程》中方法[2]及标准[5]进行。合格标准：鸡传染性喉气管炎要达对照鸡≥7/10发病，免疫鸡≥7/10保护;鸡痘每羽份病毒含量≥1.0×104 PFU。
2 结果
冻干制品的检测结果见表1、2、3。
从表1看出，此冻干曲线下，只有选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品效价、真空度、物理性状均合格，但是剩余水分含量高于国标4.0%[4]，综合判定全为不合格制品。
从表2看出，此冻干曲线下，只有选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品的效价、真空度、剩余水分、物理性状均合格。
从表3看出，此冻干曲线下，选用1.0%、1.2%明胶5%蔗糖保护剂冻干的制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均合格。
3 结论
从冻干制品测定结果可以看出，选用1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线及选用1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线的冻干制品，检测其效价、真空度、剩余水分、物理性状均能达到制品质量指标[5];又从经济效益及生产组织方面考量，24.5 h冻干时间缩短，減轻了设备损耗，降低动力运行费用，生产组织比较便利，而且1.0%的明胶减少了材料消耗成本，因此综合判定1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h冻干曲线为该产品较理想的冻干工艺。
本试验为各企业确定生产环节的冻干工艺，提供了实验数据的参考，建议结合企业自身实际，灵活运用。但有关冻干过程中的升华温度和时间对制品质量的影响，有待进一步探索，以不断提升该产品冻干工艺水平，提高产品质量。
参考文献：
[1] 傅德霞，衣宁，贾华强，等.两种冻干保护剂在禽病疫苗生产中的效果比较[J].中国兽药杂志， 1997，（03），10-12.
[2] 中华人民共和国农业部. 鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗制造及检验试行规程[S].北京：中华人民共和国农业部，2005.
[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015年版）[M]. 北京：中国农业出版社，2016.
[4] 农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程（2000年版）[S].北京：化学工业出版社，2001.
[5] 中国兽药典委员会.兽药质量标准：生物制品卷（2017年版）[S].北京：中国农业出版社，2017.
□