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摘要：目的 制定中药救必应中总苷类物质的提取工艺。方法 以高效液相色谱法测定的长梗冬青苷、紫丁香苷提取得率为指标，以L9（3）4正交设计进行提取工艺中多项参数的优化，采用优化的参数进行实验室提取，通过对提取物成分分析判断该工艺的可行性。结果 救必应中总苷类物质最佳提取工艺为：每次用12倍量的50%乙醇为溶剂，加热回流90 min，提取3次。总苷类提取物的得率为19.5%，其中含长梗冬青苷（292 mg/g）、紫丁香苷（59.5 mg/g）、芥子醛葡萄糖苷、丁香树脂醇4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丁香树脂醇4’，4’’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等苷类化合物。结论 采用优化的实验室工艺进行提取，提取物中含有多个苷类物质。对提取物的分析表明该提取工艺切实可行。
关键词：救必应；苷类物质；提取工艺；长梗冬青苷；紫丁香苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.023
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0061-03
中药救必应为冬青科常绿乔木植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮，具清热解毒、利湿止痛之功效，可用于暑湿发热、咽喉肿痛、湿热泻痢、脘腹胀痛、风湿痹痛、湿疹、疮
疖、跌打损伤[1]。药理研究认为，救必应的乙醇提取部位具有较强的抑菌和抗炎作用[2]，对应激性高血压大鼠有降压和减慢心率的作用[3]；正丁醇提取物具有抗心律失常、抗心肌缺血[4]、降压和减慢心率的作用[5]。救必应富含苷类化学成分，曾从中分离得到长梗冬青苷、紫丁香苷、芥子醛葡萄糖苷、丁香树脂醇4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丁香树脂醇4’，4’’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3β-[（α-L-吡喃阿拉伯糖基）氧]-19α-羟基齐墩果-12-烯-28-羧酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯、咖啡酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等多个苷类化合物，以及芥子醛、丁香醛、3-乙酰齐墩果酸、硬脂酸、木栓酮、3-羟基齐墩果烷、十九烷酸等非苷类结构的化合物[6-7]。其中，长梗冬青苷、紫丁香苷是其中2个主要化学成分[8-9]，在2010年版《中华人民共和国药典》救必药材中的含量限定为不得低于4.5%和1.0%[1]。本研究以这2个化合物的转移程度为指标，进行救必应中总苷类物质提取工艺的优化，并通过对提取物的测定而评判提取工艺的科学性。
1 仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括G1329A自动控温的自动进样器、G1311A四元泵、G1315B DAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent Chemstation色谱工作站；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；KQ-100E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；LD5-10离心机（北京金立离心机有限公司）。
救必应药材，购自广州采芝堂药业有限公司，经广州市药品检验所刘柏英主任药师鉴定，为冬青科植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮，样品编号20111016。长梗冬青苷等对照品均为自制，其中长梗冬青苷纯度为99.6%、紫丁香苷纯度为96.0%[9-10]。甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Shiseido UG120–C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相为乙腈（A）-水（B）（V/V）梯度洗脱，梯度程序为：0-10 min， 10%A；10-20 min，10%→40%A；20-30 min，40%A；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
取对照品适量，精密称定，加50%色谱纯甲醇分别制成每1 mL含长梗冬青苷（Ⅴ）1.020 mg、紫丁香苷（Ⅱ）0.415 0 mg的溶液，以及一定浓度的丁香树脂醇4’，4’’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅰ）、芥子醛葡萄糖苷（Ⅲ）、丁香树脂醇4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ）对照品溶液，0.45 m微孔滤膜滤过。
2.3 供试品溶液的制备
取救必应药材粉末（过三号筛）约0.10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 测定方法
分别精密吸取长梗冬青苷和紫丁香苷对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
2.5 最佳提取工艺的确定
2.5.1 提取方法的选择 称取救必应药材粉末5.0 g。第1份样品中加入10倍量70%乙醇室温浸渍2次，每次6 h；第2份样品中加入10倍量70%乙醇超声处理2次，每次30 min；第3份样品中加入10倍量70%乙醇加热回流2次，每次60 min。各样品溶液过滤，吸取1.0 mL续滤液，加甲醇定容至5 mL，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，采用外标法计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中转移出来的提取得率，结果见表1。结果表明，与室温浸渍法和超声处理法相比，加热回流的提取方法可以获得较多的长梗冬青苷和紫丁香苷。
2.5.2 正交试验 采用加热回流提取法，固定提取次数为2次，考察可能影响提取效果的3个因素：乙醇浓度（A）、提取时间（B）、溶剂用量（C），按L9（34）表设计正交试验（见表2）。称取救必应药材粉末10.0 g，共9份，按表3进行试验。加热回流，趁热过滤，续滤液冷却至室温后定容，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中的提取得率。试验结果见表3，方差分析见表4。 方差分析结果显示，因素A和因素B对长梗冬青苷的提取得率具有显著影响（P<0.1），因素C无显著影响（P>0.1）；3个因素对紫丁香苷的提取得率均无显著影响（P>0.1）。因此，对于总苷类物质的提取，可以长梗冬青苷的提取因素为主。由表3可以看出，最佳工艺为A2B3C2：加入12倍量50%乙醇提取2次，每次加热回流90 min。
2.5.3 提取次数的考察 以A2B3C2工艺参数为准，称取10.0 g救必应药材，连续回流提取5次，每次加12倍量50%乙醇，加热回流90 min，趁热滤过。续滤液均放至室温后，定容，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中的提取得率和每次提取的相对得率，结果见表5。结果显示，只要提取2次，长梗冬青苷和紫丁香苷的累计提取得率就可以达到87.21%和91.60%，满足基本提取完全的要求，适合进行工业化生产；如果提取3次，则两者的提取率可达到94.42%和97.14%，达到近乎彻底提取程度，适合进行实验室的少量提取。
2.6 总苷类物质的提取
救必应1.0 kg，以50%乙醇12 L浸泡过夜后提取3次，每次加热回流90 min，滤过。减压浓缩滤液至干，得到总苷类提取物195 g，得率为19.5%。经测定，每克该提取物中含有292 mg长梗冬青苷和59.5 mg紫丁香苷。计算长梗冬青苷和紫丁香苷从救必应中的提取率分别为5.69%和1.16%。
2.7 总苷类物质的高效液相色谱分析
取该救必应总苷类物质提取物1 g，以色谱纯甲醇50 mL溶解，6000 r/min离心10 min。上清液过0.45 ?m微孔滤膜，进样测定，并以上述5个苷类化合物的对照品溶液进行色谱峰对照。结果见图1。
3 讨论
本试验结果表明，与室温浸渍法和超声处理法相比，加热回流的提取方法可以获得较多的长梗冬青苷和紫丁香苷。最佳工艺为加入12倍量50%乙醇提取2次，每次加热回流90 min。
采用优化后的提取工艺，对1.0 kg救必应进行了实验室提取，得到195 g总苷类提取物，每1 g提取物中含292 mg长梗冬青苷和59.5 mg紫丁香苷，从救必应中实现了长梗冬青苷和紫丁香苷5.69%和1.16%的提取率。
图1结果显示，总苷类提取物中含有长梗冬青苷等5个苷类化学成分。其中，紫丁香苷和长梗冬青苷分别具有最快和最慢的出峰时间，说明紫丁香苷和长梗冬青苷具有最大和最小的极性。因此，以这2个苷类化合物的得率来评判总苷类物质的提取率是切实可行的。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：293.
[2] 张榕文，黄兆胜，范庆亚，等.救必应抑菌抗炎有效部位筛选[J].中华中医药学刊，2008，26（8）：1820-1822.
[3] 梁燕玲，董艳芬，罗集鹏.救必应乙醇提取物对应激性高血压大鼠降压作用的实验研究[J].中药材，2005，28（7）：582-584.
[4] 陈小夏，何冰，徐苑芬，等.救必应正丁醇提取物抗心律失常和抗心肌缺血作用研究[J].中药药理与临床，1998，14（4）：22-24.
[5] 董艳芬，梁燕玲，罗集鹏.救必应正丁醇提取物对血压及心率影响的实验研究[J].中药材，1997，20（8）：406-408.
[6] 文东旭，陈仲良.救必应化学成分的研究（I）[J].中草药，1991，22（6）：246-248.
[7] 许睿，高幼衡，魏志雄，等.救必应化学成分研究（I）[J].中草药，2011， 42（12）：2389-2393.
[8] Wang Chun， Chao Zhimao， Wu Xiaoyi， et al. Enrichment and purification of pedunculoside and syringin from the barks of Ilex rotunda with macroporous resins[J]. J Liq Chrom Rel Techn，DOI：10.1080/10826076.2012.749499.
[9] 巢志茂，王淳，吴晓毅，等.一种同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法：中国，201210088421.5[P].2012-08-22.
[10] Wang Chun， Chao Zhi-Mao， Wu Xiao-Yi， et al. Extraction and crystal structure of pedunculoside[J]. Chinese J Struct Chem， 2012，31（12）：1729-1735.
（收稿日期：2013-06-24，编辑：陈静）
关键词：救必应；苷类物质；提取工艺；长梗冬青苷；紫丁香苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.023
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0061-03
中药救必应为冬青科常绿乔木植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮，具清热解毒、利湿止痛之功效，可用于暑湿发热、咽喉肿痛、湿热泻痢、脘腹胀痛、风湿痹痛、湿疹、疮
疖、跌打损伤[1]。药理研究认为，救必应的乙醇提取部位具有较强的抑菌和抗炎作用[2]，对应激性高血压大鼠有降压和减慢心率的作用[3]；正丁醇提取物具有抗心律失常、抗心肌缺血[4]、降压和减慢心率的作用[5]。救必应富含苷类化学成分，曾从中分离得到长梗冬青苷、紫丁香苷、芥子醛葡萄糖苷、丁香树脂醇4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丁香树脂醇4’，4’’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3β-[（α-L-吡喃阿拉伯糖基）氧]-19α-羟基齐墩果-12-烯-28-羧酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯、咖啡酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等多个苷类化合物，以及芥子醛、丁香醛、3-乙酰齐墩果酸、硬脂酸、木栓酮、3-羟基齐墩果烷、十九烷酸等非苷类结构的化合物[6-7]。其中，长梗冬青苷、紫丁香苷是其中2个主要化学成分[8-9]，在2010年版《中华人民共和国药典》救必药材中的含量限定为不得低于4.5%和1.0%[1]。本研究以这2个化合物的转移程度为指标，进行救必应中总苷类物质提取工艺的优化，并通过对提取物的测定而评判提取工艺的科学性。
1 仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括G1329A自动控温的自动进样器、G1311A四元泵、G1315B DAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent Chemstation色谱工作站；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；KQ-100E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；LD5-10离心机（北京金立离心机有限公司）。
救必应药材，购自广州采芝堂药业有限公司，经广州市药品检验所刘柏英主任药师鉴定，为冬青科植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥树皮，样品编号20111016。长梗冬青苷等对照品均为自制，其中长梗冬青苷纯度为99.6%、紫丁香苷纯度为96.0%[9-10]。甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Shiseido UG120–C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相为乙腈（A）-水（B）（V/V）梯度洗脱，梯度程序为：0-10 min， 10%A；10-20 min，10%→40%A；20-30 min，40%A；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
取对照品适量，精密称定，加50%色谱纯甲醇分别制成每1 mL含长梗冬青苷（Ⅴ）1.020 mg、紫丁香苷（Ⅱ）0.415 0 mg的溶液，以及一定浓度的丁香树脂醇4’，4’’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅰ）、芥子醛葡萄糖苷（Ⅲ）、丁香树脂醇4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ）对照品溶液，0.45 m微孔滤膜滤过。
2.3 供试品溶液的制备
取救必应药材粉末（过三号筛）约0.10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 测定方法
分别精密吸取长梗冬青苷和紫丁香苷对照品溶液与供试品溶液各10 ?L，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
2.5 最佳提取工艺的确定
2.5.1 提取方法的选择 称取救必应药材粉末5.0 g。第1份样品中加入10倍量70%乙醇室温浸渍2次，每次6 h；第2份样品中加入10倍量70%乙醇超声处理2次，每次30 min；第3份样品中加入10倍量70%乙醇加热回流2次，每次60 min。各样品溶液过滤，吸取1.0 mL续滤液，加甲醇定容至5 mL，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，采用外标法计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中转移出来的提取得率，结果见表1。结果表明，与室温浸渍法和超声处理法相比，加热回流的提取方法可以获得较多的长梗冬青苷和紫丁香苷。
2.5.2 正交试验 采用加热回流提取法，固定提取次数为2次，考察可能影响提取效果的3个因素：乙醇浓度（A）、提取时间（B）、溶剂用量（C），按L9（34）表设计正交试验（见表2）。称取救必应药材粉末10.0 g，共9份，按表3进行试验。加热回流，趁热过滤，续滤液冷却至室温后定容，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中的提取得率。试验结果见表3，方差分析见表4。 方差分析结果显示，因素A和因素B对长梗冬青苷的提取得率具有显著影响（P<0.1），因素C无显著影响（P>0.1）；3个因素对紫丁香苷的提取得率均无显著影响（P>0.1）。因此，对于总苷类物质的提取，可以长梗冬青苷的提取因素为主。由表3可以看出，最佳工艺为A2B3C2：加入12倍量50%乙醇提取2次，每次加热回流90 min。
2.5.3 提取次数的考察 以A2B3C2工艺参数为准，称取10.0 g救必应药材，连续回流提取5次，每次加12倍量50%乙醇，加热回流90 min，趁热滤过。续滤液均放至室温后，定容，过微孔滤膜（0.45 ?m），进样测定，计算长梗冬青苷和紫丁香苷从药材中的提取得率和每次提取的相对得率，结果见表5。结果显示，只要提取2次，长梗冬青苷和紫丁香苷的累计提取得率就可以达到87.21%和91.60%，满足基本提取完全的要求，适合进行工业化生产；如果提取3次，则两者的提取率可达到94.42%和97.14%，达到近乎彻底提取程度，适合进行实验室的少量提取。
2.6 总苷类物质的提取
救必应1.0 kg，以50%乙醇12 L浸泡过夜后提取3次，每次加热回流90 min，滤过。减压浓缩滤液至干，得到总苷类提取物195 g，得率为19.5%。经测定，每克该提取物中含有292 mg长梗冬青苷和59.5 mg紫丁香苷。计算长梗冬青苷和紫丁香苷从救必应中的提取率分别为5.69%和1.16%。
2.7 总苷类物质的高效液相色谱分析
取该救必应总苷类物质提取物1 g，以色谱纯甲醇50 mL溶解，6000 r/min离心10 min。上清液过0.45 ?m微孔滤膜，进样测定，并以上述5个苷类化合物的对照品溶液进行色谱峰对照。结果见图1。
3 讨论
本试验结果表明，与室温浸渍法和超声处理法相比，加热回流的提取方法可以获得较多的长梗冬青苷和紫丁香苷。最佳工艺为加入12倍量50%乙醇提取2次，每次加热回流90 min。
采用优化后的提取工艺，对1.0 kg救必应进行了实验室提取，得到195 g总苷类提取物，每1 g提取物中含292 mg长梗冬青苷和59.5 mg紫丁香苷，从救必应中实现了长梗冬青苷和紫丁香苷5.69%和1.16%的提取率。
图1结果显示，总苷类提取物中含有长梗冬青苷等5个苷类化学成分。其中，紫丁香苷和长梗冬青苷分别具有最快和最慢的出峰时间，说明紫丁香苷和长梗冬青苷具有最大和最小的极性。因此，以这2个苷类化合物的得率来评判总苷类物质的提取率是切实可行的。
参考文献：
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[5] 董艳芬，梁燕玲，罗集鹏.救必应正丁醇提取物对血压及心率影响的实验研究[J].中药材，1997，20（8）：406-408.
[6] 文东旭，陈仲良.救必应化学成分的研究（I）[J].中草药，1991，22（6）：246-248.
[7] 许睿，高幼衡，魏志雄，等.救必应化学成分研究（I）[J].中草药，2011， 42（12）：2389-2393.
[8] Wang Chun， Chao Zhimao， Wu Xiaoyi， et al. Enrichment and purification of pedunculoside and syringin from the barks of Ilex rotunda with macroporous resins[J]. J Liq Chrom Rel Techn，DOI：10.1080/10826076.2012.749499.
[9] 巢志茂，王淳，吴晓毅，等.一种同时制备长梗冬青苷和紫丁香苷的方法：中国，201210088421.5[P].2012-08-22.
[10] Wang Chun， Chao Zhi-Mao， Wu Xiao-Yi， et al. Extraction and crystal structure of pedunculoside[J]. Chinese J Struct Chem， 2012，31（12）：1729-1735.
（收稿日期：2013-06-24，编辑：陈静）