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摘要：目的 观察生脉硒对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血损伤的影响，探讨其心肌保护作用机制。方法 Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、生脉组及生脉硒高、中、低剂量组，通过腹腔注射异丙肾上腺素制备大鼠急性心肌缺血损伤模型。生脉组以10 mg/（kg·d）量灌胃生脉注射液，对照组与模型组予以等量生理盐水，生脉硒高、中、低剂量组分别按20、10、5 mg/（kg·d）灌胃生脉硒水溶液。观察各组大鼠心肌组织结构的改变，测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，免疫组化法观察凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果 生脉组和生脉硒组可明显降低心肌梗死面积，同时提高血清SOD活性、降低MDA含量（P<0.05）。免疫组化显示，生脉硒组Bcl-2蛋白阳性表达显著增加（P<0.01），生脉硒中、高剂量组与生脉组明显抑制Bax蛋白表达（P<0.01）。结论 生脉硒组对急性心肌缺血损伤模型心肌具有保护作用，其机制可能与抗氧化作用、对抗心肌细胞的凋亡有关。
关键词：生脉硒；异丙肾上腺素；心肌缺血；超氧化物歧化酶；丙二醛；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）02-0052-03
急性心肌缺血、缺氧导致心脏功能损害与引起心肌细胞氧化损伤、心肌细胞发生凋亡等有关[1-2]。生脉注射液具有强心扩血管、抗氧自由基，从而保护缺血心肌的作用[3]；硒是人体不可缺少的一种微量元素，具有比维生素E更强的抗氧化性，
能及时清除有害物质“自由基”，减少心脏组织中脂过氧化物沉积，从而对心肌细胞损伤有修复作用[4-5]。本实验采用腹腔注射异丙肾上腺素（ISO）的方法制备大鼠急性心肌缺血损伤模型，把生脉注射液与富硒麦芽配制成复方制剂（生脉硒），观察其对大鼠急性心肌缺血损伤的影响，探讨心肌保护作用及机制。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar大鼠60只，SPF级，雌雄不限，体质量（140±10）g，甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（甘）2011- 0001。
1.2 药物
1.3 试剂
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号20110106）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号20110108）由南京建成生物工程研究所生产。鼠抗人Bcl-2单抗（即用型）、兔抗人Bax单抗（即用型）、免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物公司。
2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
将60只Wistar大鼠依照随机数字表分为对照组、模型组、生脉组及生脉硒高、中、低剂量组，除对照组外（等量生理盐水替代），余各组腹腔注射ISO[2 mg/（kg·d）]制备大鼠急性心肌缺血损伤模型，连续10 d，1次/d。生脉组按10 mg/（kg·d）灌胃生脉注射液，对照组与模型组予以等量生理盐水，生脉硒高、中、低剂量组分别按20、10、5 mg/（kg·d）灌胃生脉硒水溶液，连续10 d，1次/d。
2.2 标本采集与处理
第10日末次给药后禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠生理盐水溶液40 mg/kg麻醉，行股动脉取血，加入装有40 000 U/mL抑肽酶20 ?L的冰冷试管中混匀，以3 500 r/min离心10 min，分离血清，分装，于-25 ℃冰箱内保存待测。手术充分暴露心脏，取出心脏并用冰PBS洗净，剪除心脏表面附着组织，置于4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，待做HE染色观察心肌组织结构及免疫组化测定。
3 统计学方法
4 结果
4.1 HE染色下各组大鼠心肌组织结构的改变
4.3 免疫组化法观察Bcl-2和Bax蛋白表达
5 讨论
ISO作为一种β受体激动剂，可使心率增快，心室舒张期时间缩短，增加心脏做功，使心肌耗氧量显著增加，从而减少心肌供血，诱发心肌缺血，其现象类似于自然发生的急性心肌缺血的病理变化[6]。近年研究表明，氧自由基生成及脂质过氧化反应增强是心肌缺血损伤的主要机制之一[7]。SOD是体内重要的抗氧化酶，可抑制氧自由基对脂质的损伤，清除体内生成的毒性超氧化物，保护细胞不受自由基损伤；MDA是脂质过氧化反应的最终产物，通常被用于反映生物体的脂质过氧化程度，从而反映机体细胞受氧自由基攻击损伤的程度[8]。因此，我们通过检测血清SOD和MDA水平来反映心肌缺血损伤的情况。本实验结果表明，从模型组、对照组组织切片可以看出，大鼠注射ISO后心肌缺血造模成功。生脉组及生脉硒高、中剂量组与模型组比较，均可不同程度增强SOD活性、降低MDA含量，生脉硒组效果优于生脉组，说明生脉硒对ISO诱导的大鼠缺血性心肌损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与提高SOD活性、降低MDA水平，从而减少心肌缺血时的脂质过氧化反应、扩张冠状动脉、增加心肌血氧供应有关。
心肌缺血损伤时心肌细胞凋亡加剧，心肌细胞凋亡又可加剧缺血心肌的损伤。细胞凋亡的发生发展受多种基因调控，其中凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡加速基因Bax与细胞凋亡关系密切[9]。免疫组化显示，生脉硒组Bcl-2蛋白阳性表达显著增加，而生脉组与模型组之间无明显差异，生脉硒中、高剂量组与生脉组均明显抑制Bax蛋白表达，说明Bcl-2、Bax确实参与了急性缺血时心肌细胞的凋亡调控。生脉硒可明显减少ISO引起的心肌缺血病理损伤，显著抑制促凋亡蛋白Bax表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示生脉硒在ISO引起的急性心肌缺血损伤时对抗心肌细胞凋亡的保护方面有一定价值，可降低心肌细胞凋亡率，促进细胞增殖修复，改善急性心肌梗死面积。
心肌缺血根据其病因、病机及临床表现，属于中医学“胸痹”、“心痛”范畴。其病机总属本虚标实，虚实夹杂。本虚是指气、血、阴、阳的亏损或不足，标实是指阴寒、痰浊、血瘀而言[10]。生脉注射液由红参、麦冬、五味子萃取，具有益气养阴、复脉固脱之功，临床用于气阴两亏、心悸气短的患者[11]。硒是维持心脏正常结构能的重要元素，缺硒使谷胱甘肽氧化酶活性降低，不能及时清除有害物质“自由基”，导致心脏组织中脂过氧化产物堆积，损伤心肌细胞[12]。本研究把生脉注射液与富硒麦芽配制成复方制剂，进一步显示生脉注射液与硒对心肌细胞均有保护作用，而且生脉硒的作用较单用生脉注射液更加明显，说明两者具有一定的协同保护作用。 参考文献：
[1] 徐光佑，谢勇，蔺晓渊，等.超微参附汤对急性心肌缺血大鼠的保护作用[J].吉林中医药，2010，30（7）：633-635.
[2] Xie Z， Koyama T， Suzuki J， et al. Coronary reperfusion following ischemia：different expression of Bcl-2 and Bax proteins，and cardiomyocyte apoptosis[J]. Jpn Heart J，2001，42（6）：759-770.
[3] 董伟，毛庆录.生脉注射液治疗缺血性心肌病心功能不全的疗效观察[J].实用临床医学，2010，11（10）：9-11.
[4] 单金媛，王秀梅，中草药中硒的生物功能及测定方法研究进展[J].中草药，2003，30（3）：280-282.
[5] 范小飞，虞建宏.微量元素硒的生物学功能及测定方法的研究[J].江苏预防医学，2011，22（1）：62-64.
[6] 陆文铨，张国强，陈大贵，等.丹参素对大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].药学实践杂志，2010，28（4）：279-282.
[7] 赵晓民，井雷，王云，等.氢分子对异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心肌梗死的保护作用及其抗氧化和抗炎机制[J].中国动脉硬化杂志，2011， 19（3）：273-277.
[8] Wang QD， Pernow J， Sjoquist PO， et al. Pharmacological possibilities for protection against myocardical reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res，2002，55（1）：25-37.
[9] 阮长武，张代富，汪姗姗，等.黄芪对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].同济大学学报：医学版，2003，24（3）：182-184.
[10] 冯浩楼，常冰，崔玉英.瓜蒌通脉丸对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用及机制[J].医学研究与教育，2011，28（1）：1-4.
[11] 王国涛，贺玉泉，杨萍.生脉注射液对充血性心力衰竭患者心功能及血浆脑钠尿肽的影响[J].中国中西医结合杂志，2010，30（5）：551-553.
[12] 范小飞，虞建宏.微量元素硒的生物学功能及测定方法的研究[J].江苏预防医学，2011，22（1）：62-64.
（收稿日期：2012-07-31，编辑：华强）
关键词：生脉硒；异丙肾上腺素；心肌缺血；超氧化物歧化酶；丙二醛；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）02-0052-03
急性心肌缺血、缺氧导致心脏功能损害与引起心肌细胞氧化损伤、心肌细胞发生凋亡等有关[1-2]。生脉注射液具有强心扩血管、抗氧自由基，从而保护缺血心肌的作用[3]；硒是人体不可缺少的一种微量元素，具有比维生素E更强的抗氧化性，
能及时清除有害物质“自由基”，减少心脏组织中脂过氧化物沉积，从而对心肌细胞损伤有修复作用[4-5]。本实验采用腹腔注射异丙肾上腺素（ISO）的方法制备大鼠急性心肌缺血损伤模型，把生脉注射液与富硒麦芽配制成复方制剂（生脉硒），观察其对大鼠急性心肌缺血损伤的影响，探讨心肌保护作用及机制。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar大鼠60只，SPF级，雌雄不限，体质量（140±10）g，甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（甘）2011- 0001。
1.2 药物
1.3 试剂
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号20110106）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号20110108）由南京建成生物工程研究所生产。鼠抗人Bcl-2单抗（即用型）、兔抗人Bax单抗（即用型）、免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物公司。
2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
将60只Wistar大鼠依照随机数字表分为对照组、模型组、生脉组及生脉硒高、中、低剂量组，除对照组外（等量生理盐水替代），余各组腹腔注射ISO[2 mg/（kg·d）]制备大鼠急性心肌缺血损伤模型，连续10 d，1次/d。生脉组按10 mg/（kg·d）灌胃生脉注射液，对照组与模型组予以等量生理盐水，生脉硒高、中、低剂量组分别按20、10、5 mg/（kg·d）灌胃生脉硒水溶液，连续10 d，1次/d。
2.2 标本采集与处理
第10日末次给药后禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠生理盐水溶液40 mg/kg麻醉，行股动脉取血，加入装有40 000 U/mL抑肽酶20 ?L的冰冷试管中混匀，以3 500 r/min离心10 min，分离血清，分装，于-25 ℃冰箱内保存待测。手术充分暴露心脏，取出心脏并用冰PBS洗净，剪除心脏表面附着组织，置于4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋，待做HE染色观察心肌组织结构及免疫组化测定。
3 统计学方法
4 结果
4.1 HE染色下各组大鼠心肌组织结构的改变
4.3 免疫组化法观察Bcl-2和Bax蛋白表达
5 讨论
ISO作为一种β受体激动剂，可使心率增快，心室舒张期时间缩短，增加心脏做功，使心肌耗氧量显著增加，从而减少心肌供血，诱发心肌缺血，其现象类似于自然发生的急性心肌缺血的病理变化[6]。近年研究表明，氧自由基生成及脂质过氧化反应增强是心肌缺血损伤的主要机制之一[7]。SOD是体内重要的抗氧化酶，可抑制氧自由基对脂质的损伤，清除体内生成的毒性超氧化物，保护细胞不受自由基损伤；MDA是脂质过氧化反应的最终产物，通常被用于反映生物体的脂质过氧化程度，从而反映机体细胞受氧自由基攻击损伤的程度[8]。因此，我们通过检测血清SOD和MDA水平来反映心肌缺血损伤的情况。本实验结果表明，从模型组、对照组组织切片可以看出，大鼠注射ISO后心肌缺血造模成功。生脉组及生脉硒高、中剂量组与模型组比较，均可不同程度增强SOD活性、降低MDA含量，生脉硒组效果优于生脉组，说明生脉硒对ISO诱导的大鼠缺血性心肌损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与提高SOD活性、降低MDA水平，从而减少心肌缺血时的脂质过氧化反应、扩张冠状动脉、增加心肌血氧供应有关。
心肌缺血损伤时心肌细胞凋亡加剧，心肌细胞凋亡又可加剧缺血心肌的损伤。细胞凋亡的发生发展受多种基因调控，其中凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡加速基因Bax与细胞凋亡关系密切[9]。免疫组化显示，生脉硒组Bcl-2蛋白阳性表达显著增加，而生脉组与模型组之间无明显差异，生脉硒中、高剂量组与生脉组均明显抑制Bax蛋白表达，说明Bcl-2、Bax确实参与了急性缺血时心肌细胞的凋亡调控。生脉硒可明显减少ISO引起的心肌缺血病理损伤，显著抑制促凋亡蛋白Bax表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示生脉硒在ISO引起的急性心肌缺血损伤时对抗心肌细胞凋亡的保护方面有一定价值，可降低心肌细胞凋亡率，促进细胞增殖修复，改善急性心肌梗死面积。
心肌缺血根据其病因、病机及临床表现，属于中医学“胸痹”、“心痛”范畴。其病机总属本虚标实，虚实夹杂。本虚是指气、血、阴、阳的亏损或不足，标实是指阴寒、痰浊、血瘀而言[10]。生脉注射液由红参、麦冬、五味子萃取，具有益气养阴、复脉固脱之功，临床用于气阴两亏、心悸气短的患者[11]。硒是维持心脏正常结构能的重要元素，缺硒使谷胱甘肽氧化酶活性降低，不能及时清除有害物质“自由基”，导致心脏组织中脂过氧化产物堆积，损伤心肌细胞[12]。本研究把生脉注射液与富硒麦芽配制成复方制剂，进一步显示生脉注射液与硒对心肌细胞均有保护作用，而且生脉硒的作用较单用生脉注射液更加明显，说明两者具有一定的协同保护作用。 参考文献：
[1] 徐光佑，谢勇，蔺晓渊，等.超微参附汤对急性心肌缺血大鼠的保护作用[J].吉林中医药，2010，30（7）：633-635.
[2] Xie Z， Koyama T， Suzuki J， et al. Coronary reperfusion following ischemia：different expression of Bcl-2 and Bax proteins，and cardiomyocyte apoptosis[J]. Jpn Heart J，2001，42（6）：759-770.
[3] 董伟，毛庆录.生脉注射液治疗缺血性心肌病心功能不全的疗效观察[J].实用临床医学，2010，11（10）：9-11.
[4] 单金媛，王秀梅，中草药中硒的生物功能及测定方法研究进展[J].中草药，2003，30（3）：280-282.
[5] 范小飞，虞建宏.微量元素硒的生物学功能及测定方法的研究[J].江苏预防医学，2011，22（1）：62-64.
[6] 陆文铨，张国强，陈大贵，等.丹参素对大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].药学实践杂志，2010，28（4）：279-282.
[7] 赵晓民，井雷，王云，等.氢分子对异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心肌梗死的保护作用及其抗氧化和抗炎机制[J].中国动脉硬化杂志，2011， 19（3）：273-277.
[8] Wang QD， Pernow J， Sjoquist PO， et al. Pharmacological possibilities for protection against myocardical reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res，2002，55（1）：25-37.
[9] 阮长武，张代富，汪姗姗，等.黄芪对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].同济大学学报：医学版，2003，24（3）：182-184.
[10] 冯浩楼，常冰，崔玉英.瓜蒌通脉丸对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用及机制[J].医学研究与教育，2011，28（1）：1-4.
[11] 王国涛，贺玉泉，杨萍.生脉注射液对充血性心力衰竭患者心功能及血浆脑钠尿肽的影响[J].中国中西医结合杂志，2010，30（5）：551-553.
[12] 范小飞，虞建宏.微量元素硒的生物学功能及测定方法的研究[J].江苏预防医学，2011，22（1）：62-64.
（收稿日期：2012-07-31，编辑：华强）