论文部分内容阅读
摘要：为了评估武汉野田村病毒衣壳蛋白是否能形成一种新的异源多肽和蛋白的展示系统，本论文实验根据生物信息学手段，应用穿线法（Threading）分析WhNV衣壳蛋白的结构，选取氨基酸位置1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L为在同一位点两边加Linker（甘氨酸短肽），插入报告蛋白EGFP的基因序列，以T-IE2质粒为载体构建可以瞬转sf9的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的克隆。运用荧光显微镜观察及western-blot检测转染细胞，筛选出能高效表达融合蛋白的位点克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-5L。
关键词：武汉野田村病毒；衣壳蛋白；EGFP蛋白；展示系统；位点筛选
1、前言
20世纪40年代以来，昆虫病毒作为生物杀虫剂的应用前景，被渐渐发掘，特别是杆状病毒已成为生物杀虫剂的主要来源。昆虫病毒的复制，装配和宿主的相互影响终将会对生命科学研究产生重要影响，该领域已成为微生物研究领域中的热门之一[1]。
菜青虫是菜粉蝶Artogeia（Pieris） rapae （Linnaeus） 又名菜白蝶、白粉蝶的幼虫，菜粉蝶属粉蝶科中的鳞翅目。菜青虫主以幼虫啃食作物叶片的方式危害甘蓝、萝卜、花椰菜等十字花科蔬菜，导致收成量减少。武汉野田村病毒是在我国境内发现的第一个能以昆虫为感染宿主的野田村病毒，也是第一次从菜青虫体内分离得到的野田村病毒科成员。目前，对于菜青虫病毒的研究可以对虫害的防治提供理论依据[2]。
武汉野田村病毒是单链正义RNA病毒，其基因组全长约为4.6 kb，包括RNA1（3.1 kb）和RNA2（1.5 kb）。RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶 protein A，protein A不但复制基因组RNA，同时在病毒增殖过程中复制亚基因RNA3；RNA2编码衣壳蛋白前体Pro α，在装配过程中180个拷贝的Pro α组装成T=3的正二十面体对称结构，经过自我切割后成为成熟的具有感染性的病毒粒子。野田村病毒衣壳蛋白中有一个β桶状结构，这个结构在已经研究的野田村病毒科的成员中都呈保守趋势。桶状结构的反向平行链通过几个形状大小都不同的裸露在病毒粒子表面的茎环相连。表面的茎环结构构象差别很大，由此推测野田村病毒的衣壳在表面茎环的构象改变的情况下仍能折叠和组装正确形成病毒粒子，因而，较大的异源多肽或完整的蛋白可以插入到这些茎环结构中，却对衣壳蛋白影响不大。这些特性使得野田村病毒的衣壳蛋白可以作为一种新的异源多肽和蛋白的展示系统[4]。野田村病毒科中的Flock House virus（FHV）[5]衣壳蛋白结构的研究显示该蛋白表面有5个茎环，在这些茎环中插入异源多肽时不会引起较大的结构变化。目前，已经成功融合到VLPs的异源多肽包括人类免疫缺陷性病毒（HIV）的包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，人炭疽热毒性受体2（ANTXR2[6]。同作为野田村病毒科成员的武汉野田村病毒衣壳蛋白的相关研究却处于空白阶段。
2、武汉野田村病毒衣壳蛋白插入异源蛋白位点的预测及克隆的构建
2.1实验材料与方法
2.1.1实验材料
2.1.1.1生物信息学软件（robetta在线模建服务器，Swiss-PdbViewer VERSION 4.0.1
2.1.1.2质粒、菌種
pIZT/V5-his载体，pMD18-T-simple （TaKaRa公司），T-IE2载体质粒，载体由pIZT/V5-his改造，即PCR扩增启动子OpIE2启动子序列后，连接pMD18-T-simple载体构成，全长3567bp，Amp抗性，pWh2（G，0）质粒即RNA2的cDNA克隆，载体为pMD18-T（TaKaRa公司），大肠杆菌TOP10
2.1.2方法
2.1.2.1WhNV衣壳蛋白的三维结构的预测
运用穿线法测定武汉野田村病毒衣壳蛋白的三维结构；
a）在数据库中取一条已知模板与武汉野田村病毒衣壳蛋白序列作序列比对。
b）将模板蛋白质序列匹配上的残基的空间坐标赋给武汉野田村病毒衣壳蛋白上的相应残基。
c）将这个操作应用于所有的取用模板中，取能量值最低的模板产生的武汉野田村病毒衣壳蛋白序列的空间坐标，即为武汉野田村病毒衣壳蛋白的三维结构。
2.1.2.2引物设计及插入EGFP的完整序列的克隆
用Primer5.0根据衣壳蛋白的ORF及EGFP设计引物。包括两端分别包含EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点引物；EGFP插入预测位点1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L为在同一位点两边加Linker（甘氨酸短肽），示意图如下（2.1）
图2.1.：131aa-132aa，14aa-149aa，180aa-181aa，191aa-192aa，209aa-210aa间插入EGFP ；131 aa -132 aa，209 aa -210 aa间插入加linker的EGFP
以衣壳蛋白序列和EGFP序列为模板，使用以上引物，进行PCR扩增， 将回收产物与T-IE2载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切5小时。回收酶切产物以T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，涂amp抗性平板，挑取平板上的单菌落，接种于4ml氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm，摇床培养过夜，提取质粒，电泳测序鉴定。 2.2实验结果
2.2.1武汉野田村病毒衣壳蛋白结构分析
利用数据库提供的模板，运用穿线法模建衣壳蛋白的三维结构图，运用Swiss-PdbViewer展示单体如图2.2。单体是由α螺旋，β折叠片及连接不同折叠间的茎环组成。β折叠片编织成致密的β桶，结构较稳定，不能选择成为插入位点，而松散在表面的茎环插入异源多肽时不会引起较大的结构变化[7]。
2.2.2插入EGFP的完整序列的克隆鉴定
武汉野田村病毒衣壳蛋白ORF长1293bp，EGFP的ORF长717bp，添加linker18氨基酸长54bp，即完整序列1，3，4， 5为2010bp，1L，5L为2064bp。T-IE2载体长3567bp。节选图2.3-2.5中泳道3中出现，3条带是双酶切不完全造成，最上面一条为单酶切产物，中间一条为切下的线型T-IE2空载，最下面一条为完整序列。陆续送样测序，最终所有选定的预测位点1/1L（131aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa）的克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L构建正确。
3、武汉野田村病毒衣壳蛋白插入异源蛋白可行性位点的初步筛选
3.1实验材料与方法
3.1.1实验材料
3.1.1.1化学试剂
抗生素氨苄和链霉素（invitrogen），标准胎牛血清（杭州四季青公司）显色底物NBT/BCIP（碧云天公司），六孔细胞板，FuGENE HD 转染试剂盒（Roche），荧光倒置显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U Fluorescencemicroscope（Nikon， Tokyo， Japan），Bio-Rad公司蛋白质电泳及转膜系统，抗EGFP标签鼠单克隆抗体（康为世纪），羊抗鼠AP标记的抗体（北京康为公司），衣壳蛋白兔源抗体（免疫新西兰白兔制得）
3.1.1.2质粒，细胞
草地贪夜蛾Sf9细胞：中国典型培养物保藏中心提供；第二章所构建好的质粒标签为1，1L，2，3，4，5，5L。
3.1.2方法
细胞培养基的配制；质粒的转染及荧光显微镜观察；Western blot方法检测衣壳蛋白插入EGFP的重组蛋白（具体做法参照文献8进行.）
3.2实验结果
3.2.1转染细胞的荧光观察
将第二章中构建成功的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L及对照组T-IE2-EGFP质粒提纯转染进状态稳定，长势良好的sf9细胞，48小时后，荧光显微镜下观察（如图3.1）
3.2.2融合EGFP的衣壳蛋白的western-blot检测
M，蛋白marker（130kDa，fermentas）；1，未转染质粒的空细胞；2，转染T-IE2-1；3，转染T-IE2-1L；4，转染T-IE2-2；5，转染T-IE2-3；6，转染T-IE2-4；7，转染T-IE2-5；8，转染T-IE2-5L
将3.2.1中的观察过的转染T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的细胞收集，制样，10%SDS-PAGE电泳，转膜，一抗1：2000抗EGFP标签鼠单克隆抗体，二抗1：1000羊抗鼠AP标记的抗体，显色如图3.2。
3.3讨论
荧光图片中，实验组的荧光亮度即使是最亮的1和1L仍然没有阳性对照组的亮度强，说明融合蛋白的包装折疊是一个复杂的过程，只有折叠正确的EGFP才会有荧光产生，两种蛋白相互作用相互影响各自的构象，显然包装效率远远低于野生型EGFP。由图中看出Loop1和Loop2都产生较强的荧光，Loop3和Loop4几乎没有荧光，说明这两个位点不适合引入异源蛋白，插入的序列很可能被衣壳蛋白包装进内部。Loop5产生了微弱荧光，在添加linker后的5L位点，荧光亮度大大增强 ，同种情况也体现在1L上。说明linker可以有效的增强插入外源蛋白或者多肽的空间柔韧性，能够促使重组衣壳蛋白的正确包装。
由于衣壳蛋白的ORF约2kb，EGFP的ORF约717bp，由此测算融合蛋白的大小约75KD。Western-blot结果同荧光观察的结果较一致1/1L，2，5/5L，都能观测到约75KD的条带，其中1和1L的融合蛋白表达量几乎一致，2次之，5L几乎与2一致，Loop5量较少，Loop3和Loop4观测不到荧光但western同样出现了条带，分析可能是表达了融合蛋白，却是折叠包装后构象不正确，不能使EGFP发光，但western检测的是变性的蛋白，所以同样可以看到正确大小的蛋白。本实验中筛选出的表达效率较高的1/1L（131aa-132aa）已经可以为后续的实验电镜观察病毒类似粒子构筑了良好的实验平台。
参考文献：
[1]胡远扬.昆虫病毒研究的回顾与展望[J]。中国病毒学，2004，19（3），302-309
[2]蔡大威.菜青虫野田村病毒基因组结构及B2蛋白功能研究[D].武汉：武汉大学，2009
[3]Scherer， W.F.， Hurlbut， H.S.， 1967. Nodamura virus from Japan： a new and unusual arbovirus resistant to diethyl ether and chloroform. Am. J. Epidemiol.， 86， 271-285.
[4]Grabherr， R.， Ernst， W.， Oker-Blomand， C.， Jones， I.， 2001. Development in the use of baculoviruses for the surface display of complex eukaryotic protein. Trends in biotech. 19， 231-236.
关键词：武汉野田村病毒；衣壳蛋白；EGFP蛋白；展示系统；位点筛选
1、前言
20世纪40年代以来，昆虫病毒作为生物杀虫剂的应用前景，被渐渐发掘，特别是杆状病毒已成为生物杀虫剂的主要来源。昆虫病毒的复制，装配和宿主的相互影响终将会对生命科学研究产生重要影响，该领域已成为微生物研究领域中的热门之一[1]。
菜青虫是菜粉蝶Artogeia（Pieris） rapae （Linnaeus） 又名菜白蝶、白粉蝶的幼虫，菜粉蝶属粉蝶科中的鳞翅目。菜青虫主以幼虫啃食作物叶片的方式危害甘蓝、萝卜、花椰菜等十字花科蔬菜，导致收成量减少。武汉野田村病毒是在我国境内发现的第一个能以昆虫为感染宿主的野田村病毒，也是第一次从菜青虫体内分离得到的野田村病毒科成员。目前，对于菜青虫病毒的研究可以对虫害的防治提供理论依据[2]。
武汉野田村病毒是单链正义RNA病毒，其基因组全长约为4.6 kb，包括RNA1（3.1 kb）和RNA2（1.5 kb）。RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶 protein A，protein A不但复制基因组RNA，同时在病毒增殖过程中复制亚基因RNA3；RNA2编码衣壳蛋白前体Pro α，在装配过程中180个拷贝的Pro α组装成T=3的正二十面体对称结构，经过自我切割后成为成熟的具有感染性的病毒粒子。野田村病毒衣壳蛋白中有一个β桶状结构，这个结构在已经研究的野田村病毒科的成员中都呈保守趋势。桶状结构的反向平行链通过几个形状大小都不同的裸露在病毒粒子表面的茎环相连。表面的茎环结构构象差别很大，由此推测野田村病毒的衣壳在表面茎环的构象改变的情况下仍能折叠和组装正确形成病毒粒子，因而，较大的异源多肽或完整的蛋白可以插入到这些茎环结构中，却对衣壳蛋白影响不大。这些特性使得野田村病毒的衣壳蛋白可以作为一种新的异源多肽和蛋白的展示系统[4]。野田村病毒科中的Flock House virus（FHV）[5]衣壳蛋白结构的研究显示该蛋白表面有5个茎环，在这些茎环中插入异源多肽时不会引起较大的结构变化。目前，已经成功融合到VLPs的异源多肽包括人类免疫缺陷性病毒（HIV）的包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，人炭疽热毒性受体2（ANTXR2[6]。同作为野田村病毒科成员的武汉野田村病毒衣壳蛋白的相关研究却处于空白阶段。
2、武汉野田村病毒衣壳蛋白插入异源蛋白位点的预测及克隆的构建
2.1实验材料与方法
2.1.1实验材料
2.1.1.1生物信息学软件（robetta在线模建服务器，Swiss-PdbViewer VERSION 4.0.1
2.1.1.2质粒、菌種
pIZT/V5-his载体，pMD18-T-simple （TaKaRa公司），T-IE2载体质粒，载体由pIZT/V5-his改造，即PCR扩增启动子OpIE2启动子序列后，连接pMD18-T-simple载体构成，全长3567bp，Amp抗性，pWh2（G，0）质粒即RNA2的cDNA克隆，载体为pMD18-T（TaKaRa公司），大肠杆菌TOP10
2.1.2方法
2.1.2.1WhNV衣壳蛋白的三维结构的预测
运用穿线法测定武汉野田村病毒衣壳蛋白的三维结构；
a）在数据库中取一条已知模板与武汉野田村病毒衣壳蛋白序列作序列比对。
b）将模板蛋白质序列匹配上的残基的空间坐标赋给武汉野田村病毒衣壳蛋白上的相应残基。
c）将这个操作应用于所有的取用模板中，取能量值最低的模板产生的武汉野田村病毒衣壳蛋白序列的空间坐标，即为武汉野田村病毒衣壳蛋白的三维结构。
2.1.2.2引物设计及插入EGFP的完整序列的克隆
用Primer5.0根据衣壳蛋白的ORF及EGFP设计引物。包括两端分别包含EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点引物；EGFP插入预测位点1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L为在同一位点两边加Linker（甘氨酸短肽），示意图如下（2.1）
图2.1.：131aa-132aa，14aa-149aa，180aa-181aa，191aa-192aa，209aa-210aa间插入EGFP ；131 aa -132 aa，209 aa -210 aa间插入加linker的EGFP
以衣壳蛋白序列和EGFP序列为模板，使用以上引物，进行PCR扩增， 将回收产物与T-IE2载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切5小时。回收酶切产物以T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，涂amp抗性平板，挑取平板上的单菌落，接种于4ml氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm，摇床培养过夜，提取质粒，电泳测序鉴定。 2.2实验结果
2.2.1武汉野田村病毒衣壳蛋白结构分析
利用数据库提供的模板，运用穿线法模建衣壳蛋白的三维结构图，运用Swiss-PdbViewer展示单体如图2.2。单体是由α螺旋，β折叠片及连接不同折叠间的茎环组成。β折叠片编织成致密的β桶，结构较稳定，不能选择成为插入位点，而松散在表面的茎环插入异源多肽时不会引起较大的结构变化[7]。
2.2.2插入EGFP的完整序列的克隆鉴定
武汉野田村病毒衣壳蛋白ORF长1293bp，EGFP的ORF长717bp，添加linker18氨基酸长54bp，即完整序列1，3，4， 5为2010bp，1L，5L为2064bp。T-IE2载体长3567bp。节选图2.3-2.5中泳道3中出现，3条带是双酶切不完全造成，最上面一条为单酶切产物，中间一条为切下的线型T-IE2空载，最下面一条为完整序列。陆续送样测序，最终所有选定的预测位点1/1L（131aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa）的克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L构建正确。
3、武汉野田村病毒衣壳蛋白插入异源蛋白可行性位点的初步筛选
3.1实验材料与方法
3.1.1实验材料
3.1.1.1化学试剂
抗生素氨苄和链霉素（invitrogen），标准胎牛血清（杭州四季青公司）显色底物NBT/BCIP（碧云天公司），六孔细胞板，FuGENE HD 转染试剂盒（Roche），荧光倒置显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U Fluorescencemicroscope（Nikon， Tokyo， Japan），Bio-Rad公司蛋白质电泳及转膜系统，抗EGFP标签鼠单克隆抗体（康为世纪），羊抗鼠AP标记的抗体（北京康为公司），衣壳蛋白兔源抗体（免疫新西兰白兔制得）
3.1.1.2质粒，细胞
草地贪夜蛾Sf9细胞：中国典型培养物保藏中心提供；第二章所构建好的质粒标签为1，1L，2，3，4，5，5L。
3.1.2方法
细胞培养基的配制；质粒的转染及荧光显微镜观察；Western blot方法检测衣壳蛋白插入EGFP的重组蛋白（具体做法参照文献8进行.）
3.2实验结果
3.2.1转染细胞的荧光观察
将第二章中构建成功的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L及对照组T-IE2-EGFP质粒提纯转染进状态稳定，长势良好的sf9细胞，48小时后，荧光显微镜下观察（如图3.1）
3.2.2融合EGFP的衣壳蛋白的western-blot检测
M，蛋白marker（130kDa，fermentas）；1，未转染质粒的空细胞；2，转染T-IE2-1；3，转染T-IE2-1L；4，转染T-IE2-2；5，转染T-IE2-3；6，转染T-IE2-4；7，转染T-IE2-5；8，转染T-IE2-5L
将3.2.1中的观察过的转染T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的细胞收集，制样，10%SDS-PAGE电泳，转膜，一抗1：2000抗EGFP标签鼠单克隆抗体，二抗1：1000羊抗鼠AP标记的抗体，显色如图3.2。
3.3讨论
荧光图片中，实验组的荧光亮度即使是最亮的1和1L仍然没有阳性对照组的亮度强，说明融合蛋白的包装折疊是一个复杂的过程，只有折叠正确的EGFP才会有荧光产生，两种蛋白相互作用相互影响各自的构象，显然包装效率远远低于野生型EGFP。由图中看出Loop1和Loop2都产生较强的荧光，Loop3和Loop4几乎没有荧光，说明这两个位点不适合引入异源蛋白，插入的序列很可能被衣壳蛋白包装进内部。Loop5产生了微弱荧光，在添加linker后的5L位点，荧光亮度大大增强 ，同种情况也体现在1L上。说明linker可以有效的增强插入外源蛋白或者多肽的空间柔韧性，能够促使重组衣壳蛋白的正确包装。
由于衣壳蛋白的ORF约2kb，EGFP的ORF约717bp，由此测算融合蛋白的大小约75KD。Western-blot结果同荧光观察的结果较一致1/1L，2，5/5L，都能观测到约75KD的条带，其中1和1L的融合蛋白表达量几乎一致，2次之，5L几乎与2一致，Loop5量较少，Loop3和Loop4观测不到荧光但western同样出现了条带，分析可能是表达了融合蛋白，却是折叠包装后构象不正确，不能使EGFP发光，但western检测的是变性的蛋白，所以同样可以看到正确大小的蛋白。本实验中筛选出的表达效率较高的1/1L（131aa-132aa）已经可以为后续的实验电镜观察病毒类似粒子构筑了良好的实验平台。
参考文献：
[1]胡远扬.昆虫病毒研究的回顾与展望[J]。中国病毒学，2004，19（3），302-309
[2]蔡大威.菜青虫野田村病毒基因组结构及B2蛋白功能研究[D].武汉：武汉大学，2009
[3]Scherer， W.F.， Hurlbut， H.S.， 1967. Nodamura virus from Japan： a new and unusual arbovirus resistant to diethyl ether and chloroform. Am. J. Epidemiol.， 86， 271-285.
[4]Grabherr， R.， Ernst， W.， Oker-Blomand， C.， Jones， I.， 2001. Development in the use of baculoviruses for the surface display of complex eukaryotic protein. Trends in biotech. 19， 231-236.