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【摘要】：微生态制剂以其无毒副作用、无耐药性、无残留，能有效克服抗生素滥用等优点而为广大消费者所青睐。本文以一株地衣芽孢杆菌为研究对象，通过单因素及正交实验确定最佳培养基配比：葡萄糖1.5%，酵母抽提物1.0%，硫酸镁0.3%。最佳培养温度为35℃，最适接种量为5%，最佳初始pH 6.5。
【关键词】：地衣芽孢杆菌 正交实验 酵母抽提物
【分类号】：S968.4
在过去的50年，抗生素曾经为畜牧业做出了很大的贡献，但相继出现的耐药性问题和抗生素残留问题，使科学家们将动物药物添加剂的研究方向投向具有生长促进作用和保健效果的饲用微生态制剂。微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低等诸多优点，作为抗生素替代品是包括酸制剂在内的其他产品无法比拟的[1]，因饲用微生态制剂可做为饲料添加剂直接使用，美国FDA和我国农业部对可做为微生态制剂的微生物种类都有严格的规定[2.3]。
目前国外微生态制剂的研究多是围绕乳酸杆菌属、枯草杆菌属以及一些链球菌类进行的；我国则以芽孢杆菌、乳酸杆菌研制为主。如谷春涛等通过大量的数据论证了地衣芽孢杆菌TS-1的廉价培养基，并使其生物量达到前所未有的水平[4]，丰贵鹏等在其研究的基础上对培养基进行了进一步的优化使培养基更为澄清[5]，为规模化生产提高产品品质提供了重要参考依据；邓菊云、吴振强、张锦亮等优化了地衣芽孢杆菌固体发酵[6.7.8] 。本文以一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象，用单因素变量和正交实验对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化。
一 材料与方法
㈠实验材料
⒈菌种
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）由唐山师范学院微生物教研室提供
⒉培养基
种子培养基 ：蛋白胨1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化钠 1%；自然pH
发酵培养基 ：蔗糖1%；蛋白胨1%；氯化钠 0.5%； pH7.0
⒊主要试剂
蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麦芽糖、玉米浆粉、胰蛋白胨、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黄豆饼粉、尿素
⒋仪器设备
控温摇床、高压灭菌锅、电子天平、pH-3C pH测定仪、无菌操作台、紫外分光光度计
㈡ 方法
⒈培养方法
⑴ 菌种活化
将保藏的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24h备用。
⑵种子液的制备
取一环活化的菌种，接入装量为 100 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，160 r/ min ，培养18 h。
⑶ 摇瓶培养
种子液以1%的接种量接入发酵培养基（装液量100ml/250ml三角瓶）中。37℃，160 r/ min，振荡培养 24 h进行单因素的发酵条件研究。
⒉发酵培养基单因素实验
⑴碳源
分别用1%葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糖等量替代发酵培养基中的蔗糖制成培养基。采用摇瓶发酵培养条件，24 h后测定发酵液中的活菌含量以确定最佳碳源。
⑵ 氮源
分别用1 %酵母抽提物、牛肉膏、尿素、氯化铵替代基础发酵液 1 %的胰蛋白胨。采用摇瓶发酵培养条件，24 h 后测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳氮源。
⑶ 无机盐
分别用 0.5 %硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙及不加无机盐的空白，替代等量的发酵培养基中氯化钠（0.5%）。采用摇瓶发酵培养条件，24h 后测定发酵液中的活菌总数，以确定最佳无机盐。
㈢ 正交实验设计
将筛选出的最优碳源、氮源、和无机盐3个重要因素，选用3因素3水平L9（33）正交表进行实验，确定发酵培养基配比（以下简称优化培养基），正交实验因素及水平见表1和表2
㈣发酵条件的优化
采用优化培养基配方，对最佳发酵时间、温度、初始pH、接种量进行逐一优化。
㈤测定方法
活菌总数测定采用稀释平板计数法；菌体生长曲线及发酵液生物量采用比浊法测定[9.10]；pH-3C测定仪测定菌液 pH。
二 结果与讨论
㈠ 发酵培养基优化
⑴ 碳源
分别以 1 %葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、和玉米淀粉作为碳源，其他组分均相同进行发酵，测定发酵液中的活菌总数。
图1不同碳源对活菌总数的影响
由图 1 可知，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时地衣芽孢杆菌的生长明显优于玉米淀粉，利用前3种碳源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数超过2.2×1010CFU/ mL。而利用玉米淀粉时其活菌数在 0.9×1010CFU/ mL 以下，说明该地衣芽孢杆菌利用单糖和二糖的能力优于淀粉。该地衣芽孢杆菌生长的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麦芽糖。
⑵ 氮源
以 1 %葡萄糖为碳源，分别以 1 %尿素、氯化铵、牛肉膏、酵母抽提物、胰蛋白胨为氮源制成发酵培养基。
图2不同氮源对活菌总数的影响
由图2可知有机氮源效果要明显优于无机氮源。利用有机氮源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数都超过2.20×1010CFU/mL，而利用无机氮源时的活菌数在 1.0×1010CFU/mL以下，说明该地衣芽孢杆菌利用有机氮源的能力优于无机氮源。地衣芽孢杆菌生长的最适氮源是酵母抽提物，这与酵母抽提物富含氨基酸、小肽、核苷酸、B族维生素等生长因子有关。
⑶ 無机盐
分别以1%葡萄糖和1%酵母抽提物为碳源和氮源，以不加无机盐为空白，在此基础上分别加入0.5%的硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠及氯化钙。 图3不同无机盐对活菌总数影响
结果如图 3 所示，镁离子对枯草芽孢杆菌的生长有一定的促进作用，其菌的生物量为对照组的 1.12 倍。铁、钙、锰和钠离子对枯草芽孢杆菌的生长有抑制作用，其菌的生长量仅为对照的90.3% 77.5% 71.5% 38.7%。
⑷ 碳源、氮源、无机盐的正交优化
培养基中各组分之间有一定的内在关系，在单因素实验的基础上，采用正交实验以寻求培养基中各组分的最佳配比。
表1正交实验因素水平
水平 A葡萄糖% B酵母抽提物% C硫酸镁%
1 0.5 0.5 0.1
2 1.0 1.0 0.3
3 1.5 1.5 0.5
表2发酵培养基优化正交实验结果
试验号 A B C 活菌总数×1010CFU/mL
1 0.5 0.5 0.1 2.22
2 0.5 1.0 0.3 4.24
3 0.5 1.5 0.5 3.58
4 1.0 0.5 0.3 2.59
5 1.0 1.0 0.5 4.05
6 1.0 1.5 0.1 3.66
7 1.5 0.5 0.5 2.85
8 1.5 1.0 0.1 4.51
9 1.5 1.5 0.3 3.67
k 1 3.347 2.553 3.463
k 2 3.433 4.267 3.500
k 3 3.677 3.637 3.493
R 0.330 1.714 0.037
正交最佳组合 A3B2C2
由表2可知实验条件下最优化组合为A3B2C2，正交实验最优表现组合为A3B2C2极差分析可知RB>RA>RC ，显著性分析见表3，各因子对活菌含量影响大小为酵母抽提物>葡萄糖>硫酸镁。其中酵母抽提物的显著性要比葡萄糖要高，硫酸镁为差异性不显著因素，为验证此组合，进行3次平行试验，测得活菌总数为4.49×1010CFU/mL，因此确定地衣芽孢杆菌最佳培养基为葡萄糖1.5% 酵母抽提物1.0% 硫酸镁0.1% 。
表3 显著性分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F臨界值 显著性
葡萄糖 0.176 2 0.146 3.110
酵母抽提物 4.506 2 3.741 3.110 *
硫酸镁 0.002 2 0.002 3.110
误差 4.82 8
㈠ 发酵条件实验
⑴生长曲线测定
按1%的接种量接入优化培养基（装液量100ml/250ml三角瓶）中，37℃，160 r/ min，振荡培养 24 h，自接种后每2h测定菌液的生物量（OD600） ，用未接种的培养基作为空白对照。
图4地衣芽孢杆菌生长曲线
由图 4 可知，发酵培养 0～2 h 为地衣芽孢杆菌的生长停滞期，菌体数量极少；自 2 h 以后进入对数生长期，菌体数量急剧增多；在 16 h 达到生长高峰期，12～16 h 为地衣芽孢杆菌生长的稳定期，菌体生长缓慢。自 16 h 后菌体数量开始减少，地衣芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用 12～16 h 时的菌液作为种子液较合适，此时地衣芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
⑵ 初始pH
pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的 pH 难以控制，只能控制发酵液的初始 pH。因此，将初始 pH 分别调至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，摇瓶培养 16 h后测其生物量。由图 5 可知，在初始pH 5.5～8范围内地衣芽孢杆菌均可良好生长，pH 为 6.5时生长最好，说明地衣芽孢杆菌对 pH 的适应性较宽，但随 pH的增大，生物量呈下降趋势。
图5不同初始pH对地衣芽孢杆菌生物量影响
⑶ 温度
温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养基温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前，但酶很容易因过热而失去活性，表现为菌体容易衰老，影响终产物。选取 25、30、35 和 40 ℃作为培养温度，分别测定不同温度对发酵液生物量的影响，摇瓶培养16 h后测其生物量。由图 6 可知，地衣芽孢杆菌在 25～40 ℃均可良好生长，其生长的最适温度为 35 ℃。
图6不同温度对地衣芽孢杆菌生物量影响
⑷ 接种量
分别选取 1 %、3 %、5 %、7 %和4个接种量，摇瓶培养 16 h后测其生物量。由图 7可知，地衣芽孢杆菌生长的最适接种量为5%，在1%～7%范围内时，接种量对地衣芽孢杆菌生物量的影响差异很小。
图7不同接种量对地衣芽孢杆菌生物量影响
三 结论
采用单因素及正交实验法对地衣芽孢杆菌的发酵培养基在摇瓶中进行优化，以活菌总数的高低作为评价培养基优劣的指标。优化后的培养基为葡萄糖1.5%，酵母抽提物 1.0%，硫酸镁0.1%；并通过单因素实验法确定了最佳培养条件：温度 35 ℃，初始 pH6.5，接种量 5 % ，发酵时间为 16 h。
本实验表明在地衣芽孢杆菌培养过程中，酵母抽提物为影响发酵液活菌总数的关键因素，这与酵母抽提物中富含氨基酸、小分子肽、B族维生素、核苷酸、微量元素有关，较高的添加量由于影响培养基中碳氮比较大反而不利于地衣芽孢杆菌的生长，因此选择稳定适宜的酵母抽提物对地衣芽孢杆菌的培养具有重要意义。
【参考文献】
[1] 王冬梅，耿晓娜.饲用微生态制剂的应用研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，31（2）：54-56
[2] 那日苏，桂荣，赵青余，等.牛用益生素的研究与应用[J].饲料研究，2002（12）：10-13
[3] 李延云.微生态制剂的应用[J].畜禽生产，2007（4）：37-41.
[4] 谷春涛，彭爱铭，萨仁娜，等.地衣芽孢杆菌TS-1发酵培养基的优化[J].饲料工业，2003（8）：19-20.
[5] 丰贵鹏.地衣芽孢杆菌的优化[J]，安徽农业科学，2009，37（15）：6862-6864.
[6] 吴振强.固体发酵技术与应用[M].北京：化学工业出版社，2006：9，39-42.
[7] 张锦亮.固体发酵技术应用的研究进展[J].重庆科技学院学报：（自然科学版），2005，7（1）：64-66.
[8] 邓菊云.微生物碱性蛋白酶研究进展[J].现代食品科技，2008，24（3）：293-296.
[9] 乔军，孟庆龄，贾桂珍.OD值法进行细菌计数的研究[J].中国家禽，1996（4）：26.
[10] 俞俊棠，唐孝宣，邬行彦.新编生物工艺学（上）[M].北京：化学工业出版社，2003：111.
【作者简介】 贾铁岭（1984.07-），男，河北唐山人，唐山拓普生物科技有限公司研发工程师；从事微生物代谢研究。
【关键词】：地衣芽孢杆菌 正交实验 酵母抽提物
【分类号】：S968.4
在过去的50年，抗生素曾经为畜牧业做出了很大的贡献，但相继出现的耐药性问题和抗生素残留问题，使科学家们将动物药物添加剂的研究方向投向具有生长促进作用和保健效果的饲用微生态制剂。微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低等诸多优点，作为抗生素替代品是包括酸制剂在内的其他产品无法比拟的[1]，因饲用微生态制剂可做为饲料添加剂直接使用，美国FDA和我国农业部对可做为微生态制剂的微生物种类都有严格的规定[2.3]。
目前国外微生态制剂的研究多是围绕乳酸杆菌属、枯草杆菌属以及一些链球菌类进行的；我国则以芽孢杆菌、乳酸杆菌研制为主。如谷春涛等通过大量的数据论证了地衣芽孢杆菌TS-1的廉价培养基，并使其生物量达到前所未有的水平[4]，丰贵鹏等在其研究的基础上对培养基进行了进一步的优化使培养基更为澄清[5]，为规模化生产提高产品品质提供了重要参考依据；邓菊云、吴振强、张锦亮等优化了地衣芽孢杆菌固体发酵[6.7.8] 。本文以一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象，用单因素变量和正交实验对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化。
一 材料与方法
㈠实验材料
⒈菌种
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）由唐山师范学院微生物教研室提供
⒉培养基
种子培养基 ：蛋白胨1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化钠 1%；自然pH
发酵培养基 ：蔗糖1%；蛋白胨1%；氯化钠 0.5%； pH7.0
⒊主要试剂
蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麦芽糖、玉米浆粉、胰蛋白胨、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黄豆饼粉、尿素
⒋仪器设备
控温摇床、高压灭菌锅、电子天平、pH-3C pH测定仪、无菌操作台、紫外分光光度计
㈡ 方法
⒈培养方法
⑴ 菌种活化
将保藏的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24h备用。
⑵种子液的制备
取一环活化的菌种，接入装量为 100 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，160 r/ min ，培养18 h。
⑶ 摇瓶培养
种子液以1%的接种量接入发酵培养基（装液量100ml/250ml三角瓶）中。37℃，160 r/ min，振荡培养 24 h进行单因素的发酵条件研究。
⒉发酵培养基单因素实验
⑴碳源
分别用1%葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糖等量替代发酵培养基中的蔗糖制成培养基。采用摇瓶发酵培养条件，24 h后测定发酵液中的活菌含量以确定最佳碳源。
⑵ 氮源
分别用1 %酵母抽提物、牛肉膏、尿素、氯化铵替代基础发酵液 1 %的胰蛋白胨。采用摇瓶发酵培养条件，24 h 后测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳氮源。
⑶ 无机盐
分别用 0.5 %硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙及不加无机盐的空白，替代等量的发酵培养基中氯化钠（0.5%）。采用摇瓶发酵培养条件，24h 后测定发酵液中的活菌总数，以确定最佳无机盐。
㈢ 正交实验设计
将筛选出的最优碳源、氮源、和无机盐3个重要因素，选用3因素3水平L9（33）正交表进行实验，确定发酵培养基配比（以下简称优化培养基），正交实验因素及水平见表1和表2
㈣发酵条件的优化
采用优化培养基配方，对最佳发酵时间、温度、初始pH、接种量进行逐一优化。
㈤测定方法
活菌总数测定采用稀释平板计数法；菌体生长曲线及发酵液生物量采用比浊法测定[9.10]；pH-3C测定仪测定菌液 pH。
二 结果与讨论
㈠ 发酵培养基优化
⑴ 碳源
分别以 1 %葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、和玉米淀粉作为碳源，其他组分均相同进行发酵，测定发酵液中的活菌总数。
图1不同碳源对活菌总数的影响
由图 1 可知，葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时地衣芽孢杆菌的生长明显优于玉米淀粉，利用前3种碳源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数超过2.2×1010CFU/ mL。而利用玉米淀粉时其活菌数在 0.9×1010CFU/ mL 以下，说明该地衣芽孢杆菌利用单糖和二糖的能力优于淀粉。该地衣芽孢杆菌生长的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麦芽糖。
⑵ 氮源
以 1 %葡萄糖为碳源，分别以 1 %尿素、氯化铵、牛肉膏、酵母抽提物、胰蛋白胨为氮源制成发酵培养基。
图2不同氮源对活菌总数的影响
由图2可知有机氮源效果要明显优于无机氮源。利用有机氮源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数都超过2.20×1010CFU/mL，而利用无机氮源时的活菌数在 1.0×1010CFU/mL以下，说明该地衣芽孢杆菌利用有机氮源的能力优于无机氮源。地衣芽孢杆菌生长的最适氮源是酵母抽提物，这与酵母抽提物富含氨基酸、小肽、核苷酸、B族维生素等生长因子有关。
⑶ 無机盐
分别以1%葡萄糖和1%酵母抽提物为碳源和氮源，以不加无机盐为空白，在此基础上分别加入0.5%的硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠及氯化钙。 图3不同无机盐对活菌总数影响
结果如图 3 所示，镁离子对枯草芽孢杆菌的生长有一定的促进作用，其菌的生物量为对照组的 1.12 倍。铁、钙、锰和钠离子对枯草芽孢杆菌的生长有抑制作用，其菌的生长量仅为对照的90.3% 77.5% 71.5% 38.7%。
⑷ 碳源、氮源、无机盐的正交优化
培养基中各组分之间有一定的内在关系，在单因素实验的基础上，采用正交实验以寻求培养基中各组分的最佳配比。
表1正交实验因素水平
水平 A葡萄糖% B酵母抽提物% C硫酸镁%
1 0.5 0.5 0.1
2 1.0 1.0 0.3
3 1.5 1.5 0.5
表2发酵培养基优化正交实验结果
试验号 A B C 活菌总数×1010CFU/mL
1 0.5 0.5 0.1 2.22
2 0.5 1.0 0.3 4.24
3 0.5 1.5 0.5 3.58
4 1.0 0.5 0.3 2.59
5 1.0 1.0 0.5 4.05
6 1.0 1.5 0.1 3.66
7 1.5 0.5 0.5 2.85
8 1.5 1.0 0.1 4.51
9 1.5 1.5 0.3 3.67
k 1 3.347 2.553 3.463
k 2 3.433 4.267 3.500
k 3 3.677 3.637 3.493
R 0.330 1.714 0.037
正交最佳组合 A3B2C2
由表2可知实验条件下最优化组合为A3B2C2，正交实验最优表现组合为A3B2C2极差分析可知RB>RA>RC ，显著性分析见表3，各因子对活菌含量影响大小为酵母抽提物>葡萄糖>硫酸镁。其中酵母抽提物的显著性要比葡萄糖要高，硫酸镁为差异性不显著因素，为验证此组合，进行3次平行试验，测得活菌总数为4.49×1010CFU/mL，因此确定地衣芽孢杆菌最佳培养基为葡萄糖1.5% 酵母抽提物1.0% 硫酸镁0.1% 。
表3 显著性分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F臨界值 显著性
葡萄糖 0.176 2 0.146 3.110
酵母抽提物 4.506 2 3.741 3.110 *
硫酸镁 0.002 2 0.002 3.110
误差 4.82 8
㈠ 发酵条件实验
⑴生长曲线测定
按1%的接种量接入优化培养基（装液量100ml/250ml三角瓶）中，37℃，160 r/ min，振荡培养 24 h，自接种后每2h测定菌液的生物量（OD600） ，用未接种的培养基作为空白对照。
图4地衣芽孢杆菌生长曲线
由图 4 可知，发酵培养 0～2 h 为地衣芽孢杆菌的生长停滞期，菌体数量极少；自 2 h 以后进入对数生长期，菌体数量急剧增多；在 16 h 达到生长高峰期，12～16 h 为地衣芽孢杆菌生长的稳定期，菌体生长缓慢。自 16 h 后菌体数量开始减少，地衣芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用 12～16 h 时的菌液作为种子液较合适，此时地衣芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
⑵ 初始pH
pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的 pH 难以控制，只能控制发酵液的初始 pH。因此，将初始 pH 分别调至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，摇瓶培养 16 h后测其生物量。由图 5 可知，在初始pH 5.5～8范围内地衣芽孢杆菌均可良好生长，pH 为 6.5时生长最好，说明地衣芽孢杆菌对 pH 的适应性较宽，但随 pH的增大，生物量呈下降趋势。
图5不同初始pH对地衣芽孢杆菌生物量影响
⑶ 温度
温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养基温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前，但酶很容易因过热而失去活性，表现为菌体容易衰老，影响终产物。选取 25、30、35 和 40 ℃作为培养温度，分别测定不同温度对发酵液生物量的影响，摇瓶培养16 h后测其生物量。由图 6 可知，地衣芽孢杆菌在 25～40 ℃均可良好生长，其生长的最适温度为 35 ℃。
图6不同温度对地衣芽孢杆菌生物量影响
⑷ 接种量
分别选取 1 %、3 %、5 %、7 %和4个接种量，摇瓶培养 16 h后测其生物量。由图 7可知，地衣芽孢杆菌生长的最适接种量为5%，在1%～7%范围内时，接种量对地衣芽孢杆菌生物量的影响差异很小。
图7不同接种量对地衣芽孢杆菌生物量影响
三 结论
采用单因素及正交实验法对地衣芽孢杆菌的发酵培养基在摇瓶中进行优化，以活菌总数的高低作为评价培养基优劣的指标。优化后的培养基为葡萄糖1.5%，酵母抽提物 1.0%，硫酸镁0.1%；并通过单因素实验法确定了最佳培养条件：温度 35 ℃，初始 pH6.5，接种量 5 % ，发酵时间为 16 h。
本实验表明在地衣芽孢杆菌培养过程中，酵母抽提物为影响发酵液活菌总数的关键因素，这与酵母抽提物中富含氨基酸、小分子肽、B族维生素、核苷酸、微量元素有关，较高的添加量由于影响培养基中碳氮比较大反而不利于地衣芽孢杆菌的生长，因此选择稳定适宜的酵母抽提物对地衣芽孢杆菌的培养具有重要意义。
【参考文献】
[1] 王冬梅，耿晓娜.饲用微生态制剂的应用研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，31（2）：54-56
[2] 那日苏，桂荣，赵青余，等.牛用益生素的研究与应用[J].饲料研究，2002（12）：10-13
[3] 李延云.微生态制剂的应用[J].畜禽生产，2007（4）：37-41.
[4] 谷春涛，彭爱铭，萨仁娜，等.地衣芽孢杆菌TS-1发酵培养基的优化[J].饲料工业，2003（8）：19-20.
[5] 丰贵鹏.地衣芽孢杆菌的优化[J]，安徽农业科学，2009，37（15）：6862-6864.
[6] 吴振强.固体发酵技术与应用[M].北京：化学工业出版社，2006：9，39-42.
[7] 张锦亮.固体发酵技术应用的研究进展[J].重庆科技学院学报：（自然科学版），2005，7（1）：64-66.
[8] 邓菊云.微生物碱性蛋白酶研究进展[J].现代食品科技，2008，24（3）：293-296.
[9] 乔军，孟庆龄，贾桂珍.OD值法进行细菌计数的研究[J].中国家禽，1996（4）：26.
[10] 俞俊棠，唐孝宣，邬行彦.新编生物工艺学（上）[M].北京：化学工业出版社，2003：111.
【作者简介】 贾铁岭（1984.07-），男，河北唐山人，唐山拓普生物科技有限公司研发工程师；从事微生物代谢研究。