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摘 要 利用正交实验设计，对芒果SRAP-PCR反应的5因素（Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物和Taq DNA聚合酶）4水平的扩增效果进行研究，确立适合芒果SRAP-PCR反应的最佳体系。总体积25 μL的SRAP-PCR优化的最佳反应体系中含有：并运用该体系从153对引物组合中初步筛选出50对SRAP引物组合。建立的SRAP标记可为芒果遗传多样性、分子标记及辅助育种等提供研究基础。
关键词 芒果；SRAP；正交设计；体系优化
中图分类号 S667.7 文献标识码 A
Optimized Conditions of Sequence-related Amplified
Polymorphism（SRAP） System and Primer
Screening for Mango
YING Dongshan， LUO Haiyan， WANG Ming， LI Liping，
WANG Qinfei， ZHU Min， CHEN Yeyuan*
Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory
of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract An orthogonal design was used to optimize the SRAP amplification system including five factors（the concentration of Mg2+， dNTPs， template DNA， primer and Taq DNA polymerase）at four levels for mango. The optimum SRAP-PCR system was established，namely 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×buffer、20 ng template DNA， 2.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmo1/L Primer， 1.5 U Taq DNA polymerase. Under the optimum reaction conditions， 50 out of 153 SRAP primer combinations were selected. The results also indicated that the optimized conditions of SRAP could provide an effective means for the research of genetic diversity， molecular marker and auxiliary breeding in mango.
Key words Mango；SRAP；Orthogonal design；Optimization system
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.015
近年来，分子标记分析技术在果树种质资源遗传差异分析和种质资源研究中得到广泛应用。利用分子标记进行遗传学研究是理解遗传传递的强有力的途径，分子标记所揭示的遗传多态性能直接反映基因组DNA间的差异[1]。芒果（Mangifera indica L.）在中国已有1 300多年的栽培历史[2]，经过几十年的种质资源的收集和引种，中国的芒果种质资源相对丰富，主要分布在海南、广西、广东、云南等地，并且芒果具有较高的营养价值。亚洲东南部是芒果重要的起源地之一，据Kostermans等[3]报道，芒果属有58个种和11个未确定种（中国的冬芒、桃叶芒和云南的野芒属于不确定种），说明中国也是芒果的起源地之一。这些未确定种的野生芒果与普通芒果有着明显的差异，其食用价值也逊于普通芒果，但一些特殊的性状，可以作为种质加以保存，待品种改良作为育种材料。相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是一种基于PCR的新型标记系统，显性标记， 由美国加州大学蔬菜作物系Li等于2001年提出[4]，也称基于序列扩增多态性（Sequence Based Amplified Polymor-phism， SBAP）[5]。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前，在南瓜[6]、余甘子[7]、丽杂花苜蓿[8]等作物上有关SRAP标记体系优化及其在木瓜[9]、甜瓜[10]、山核桃[11]、杨树[12]等作物的遗传多样性分析、菜薹杂交种指纹图谱构建[13]和甘薯[14]、茄子[15]遗传图谱构建等方面得到了应用。
本研究运用正交设计优化PCR反应体系，该种设计具有均衡分散和整齐可比的特点，能达到事半功倍的效果，快速找到最佳组合。目前，有关SRAP在芒果上的研究还未见报道。本研究采用L16（45）正交设计对影响芒果SRAP反应体系的模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、MgCl2等5个因素4个水平进行筛选，以快速建立较为完整可靠的芒果最佳SRAP-PCR反应体系，为利用SRAP标记分析芒果遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芒果叶片取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部儋州芒果种质圃；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、标准分子量DNA（DL 2 000 Marker）购自Takara公司；引物来自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.2 方法
芒果总DNA提取参考Kit等研究的改良CTAB法[16]。
1.2.1 SRAP扩增反应体系优化 采用L16（45）正交表设计试验，对模板DNA、引物、dNTPs、Taq聚合酶和MgCl2等5个影响因素设置4个水平16个组合。随机选取引物组合ME2EM9引物对进行正交试验（引物序列见表1），试验设计见表2和表3。
1.2.2 PCR扩增 PCR扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，5个循环；94 ℃变性45 s，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸8 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物于BIO-RAD凝胶成像系统拍照保存。
2 结果与分析
2.1 芒果基因组DNA的提取质量
从芒果基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果可见其主带清晰，没有降解现象。使用分光光度计检测OD260/OD280在1.8～2.0的范围内，DNA浓度在50～200 ng/μL之间，说明提取的芒果基因组DNA纯度高，无蛋白质及其他杂质污染，满足SRAP标记对基因组DNA的纯度要求。
2.2 SRAP-PCR正交直观分析
参考文献
[1] Beckmann J S， Soller M. Restriction fragment length polymorphisms in plant genetic improvement[J]. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology， 1986， 3： 196-250.
[2] 许树培， 陈业渊， 高爱平. 海南芒果品种资源图谱[M]. 北京：中国农业出版社， 2010.
[3] Kostermans A J G H， Bompard J M. The mangoes botany，nomenclature， horticulture， Cultiviation and utilization[M]. London： Academic Press， 1993.
[4] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， A new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Gene， 2001， 103： 455-461.
[5] Ferrioi M， PicoICO B， NuU EZ F. Genetic diversity of some accessions of Cucurbita maxima from Spain using RAPD and SBAP markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2003， 50（3）： 227-238.
[6] 刘泽发， 孙小武， 罗伏青， 等. 南瓜SRAP扩增体系与扩增程序的优化[J]. 西北农业学报， 2008， 17（6）： 148-52， 183.
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[8]周良彬， 卢欣石，赖黎丽. 杂花苜蓿SRAP-PCR反应体系的正交优化[J]. 草地学报， 2010， 18（3）： 345-350.
[9] 夏永秀， 曾秀丽， 廖明安， 等. SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用[J]. 果树学报， 2010， 27（6）： 1 014-1 018.
[10] 陈 芸， 李 冠， 王贤磊. 甜瓜种质资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 遗传， 2010， 32（7）： 744-751.
[11] 刘广勤， 王鹏良， 周蓓蓓， 等. 薄壳山核桃SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析[J]. 江苏农业学报， 2010， 26（5）： 1 037-1 042.
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[13] 冒维维， 孙敬东， 陈学好. 菜薹杂交种ISSR和SRAP的指纹图谱构建[J]. 长江蔬菜， 2010（20）： 18-20.
[14] 李爱贤， 刘庆昌， 王庆美， 等. 利用SRAP标记构建甘薯分子连锁图谱[J]. 作物学报， 2010， 36（8）： 1 286-1 295.
[15] 房 超， 杨志荣， 刘独臣， 等. 应用SRAP分子标记构建茄子遗传图谱初探[J]. 西南农业学报， 2010， 23（5）： 1 591-1 594.
[16] Kit Y S， Chandran S. A simple，rapid and efficient method of isolating DNA from Chokanan mango（Mangifera indica L.）[J]. African Journal of Biotechno1ogy， 2010， 9（36）： 5 805-5 808.
[17] 尹德洁， 苏淑钗， 刘 肖，等. 蓝莓SRAP-PCR反应体系的建立优化及引物筛选[J]. 东北林业大学学报， 2013， 41（2）： 35-39.
[18] 刘 颖，王显国，张巨明，等. 正交设计优化山野豌豆SRAP-PCR反应体系与引物筛选[J]. 草业科学， 2012， 21（5）： 325-330.
[19] 郑轶琦， 王志勇，郭海林，等. 正交设计优化假俭草SRAP--PCR反应体系及引物筛选[J]. 草业科学， 2008， 17（4）： 110-117.
[20] 郭彩杰，侯丽霞，崔 娜，等. 利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系[J]. 中国蔬菜， 2011（2）： 48-52.
[21] 昝逢刚，刘家勇，赵 俊，等. 利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系[J]. 中国糖料， 2011（3）： 6-8.
[22] 赵春娥， 鲍荟宇，李 贺. 沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选[J]. 湖北农业科学， 2012， 51（8）： 1 691-1 695.
关键词 芒果；SRAP；正交设计；体系优化
中图分类号 S667.7 文献标识码 A
Optimized Conditions of Sequence-related Amplified
Polymorphism（SRAP） System and Primer
Screening for Mango
YING Dongshan， LUO Haiyan， WANG Ming， LI Liping，
WANG Qinfei， ZHU Min， CHEN Yeyuan*
Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory
of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract An orthogonal design was used to optimize the SRAP amplification system including five factors（the concentration of Mg2+， dNTPs， template DNA， primer and Taq DNA polymerase）at four levels for mango. The optimum SRAP-PCR system was established，namely 25 μL reaction system containing 2.5 μL 10×buffer、20 ng template DNA， 2.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmo1/L Primer， 1.5 U Taq DNA polymerase. Under the optimum reaction conditions， 50 out of 153 SRAP primer combinations were selected. The results also indicated that the optimized conditions of SRAP could provide an effective means for the research of genetic diversity， molecular marker and auxiliary breeding in mango.
Key words Mango；SRAP；Orthogonal design；Optimization system
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.015
近年来，分子标记分析技术在果树种质资源遗传差异分析和种质资源研究中得到广泛应用。利用分子标记进行遗传学研究是理解遗传传递的强有力的途径，分子标记所揭示的遗传多态性能直接反映基因组DNA间的差异[1]。芒果（Mangifera indica L.）在中国已有1 300多年的栽培历史[2]，经过几十年的种质资源的收集和引种，中国的芒果种质资源相对丰富，主要分布在海南、广西、广东、云南等地，并且芒果具有较高的营养价值。亚洲东南部是芒果重要的起源地之一，据Kostermans等[3]报道，芒果属有58个种和11个未确定种（中国的冬芒、桃叶芒和云南的野芒属于不确定种），说明中国也是芒果的起源地之一。这些未确定种的野生芒果与普通芒果有着明显的差异，其食用价值也逊于普通芒果，但一些特殊的性状，可以作为种质加以保存，待品种改良作为育种材料。相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是一种基于PCR的新型标记系统，显性标记， 由美国加州大学蔬菜作物系Li等于2001年提出[4]，也称基于序列扩增多态性（Sequence Based Amplified Polymor-phism， SBAP）[5]。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前，在南瓜[6]、余甘子[7]、丽杂花苜蓿[8]等作物上有关SRAP标记体系优化及其在木瓜[9]、甜瓜[10]、山核桃[11]、杨树[12]等作物的遗传多样性分析、菜薹杂交种指纹图谱构建[13]和甘薯[14]、茄子[15]遗传图谱构建等方面得到了应用。
本研究运用正交设计优化PCR反应体系，该种设计具有均衡分散和整齐可比的特点，能达到事半功倍的效果，快速找到最佳组合。目前，有关SRAP在芒果上的研究还未见报道。本研究采用L16（45）正交设计对影响芒果SRAP反应体系的模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、MgCl2等5个因素4个水平进行筛选，以快速建立较为完整可靠的芒果最佳SRAP-PCR反应体系，为利用SRAP标记分析芒果遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芒果叶片取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部儋州芒果种质圃；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、标准分子量DNA（DL 2 000 Marker）购自Takara公司；引物来自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.2 方法
芒果总DNA提取参考Kit等研究的改良CTAB法[16]。
1.2.1 SRAP扩增反应体系优化 采用L16（45）正交表设计试验，对模板DNA、引物、dNTPs、Taq聚合酶和MgCl2等5个影响因素设置4个水平16个组合。随机选取引物组合ME2EM9引物对进行正交试验（引物序列见表1），试验设计见表2和表3。
1.2.2 PCR扩增 PCR扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，5个循环；94 ℃变性45 s，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸8 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物于BIO-RAD凝胶成像系统拍照保存。
2 结果与分析
2.1 芒果基因组DNA的提取质量
从芒果基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果可见其主带清晰，没有降解现象。使用分光光度计检测OD260/OD280在1.8～2.0的范围内，DNA浓度在50～200 ng/μL之间，说明提取的芒果基因组DNA纯度高，无蛋白质及其他杂质污染，满足SRAP标记对基因组DNA的纯度要求。
2.2 SRAP-PCR正交直观分析
参考文献
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[11] 刘广勤， 王鹏良， 周蓓蓓， 等. 薄壳山核桃SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析[J]. 江苏农业学报， 2010， 26（5）： 1 037-1 042.
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[13] 冒维维， 孙敬东， 陈学好. 菜薹杂交种ISSR和SRAP的指纹图谱构建[J]. 长江蔬菜， 2010（20）： 18-20.
[14] 李爱贤， 刘庆昌， 王庆美， 等. 利用SRAP标记构建甘薯分子连锁图谱[J]. 作物学报， 2010， 36（8）： 1 286-1 295.
[15] 房 超， 杨志荣， 刘独臣， 等. 应用SRAP分子标记构建茄子遗传图谱初探[J]. 西南农业学报， 2010， 23（5）： 1 591-1 594.
[16] Kit Y S， Chandran S. A simple，rapid and efficient method of isolating DNA from Chokanan mango（Mangifera indica L.）[J]. African Journal of Biotechno1ogy， 2010， 9（36）： 5 805-5 808.
[17] 尹德洁， 苏淑钗， 刘 肖，等. 蓝莓SRAP-PCR反应体系的建立优化及引物筛选[J]. 东北林业大学学报， 2013， 41（2）： 35-39.
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