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摘 要 番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害，在转基因植物备受争议的背景下，利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择。本文选取PLDMV CP基因全长（879 bp），运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构，将其嵌入原核表达载体pSP73中，并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY，构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879，以终浓度为0.4 mmol/L IPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA。研究共设2个处理：保护性处理与治疗性处理。分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理，通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明，保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染，主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率；治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3～12天内出现暂时性的降低。结果表明，保护效果优于治疗效果，若每月喷施2～3次dsRNA粗提液，有望能够有效地预防PLDMV的侵染。
关键词 番木瓜畸形花叶病毒；原核表达；dsRNA；RNA沉默
中文分类号 S667.97 文献标识码 A
Abstract Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）is a potential threat to papaya cultivation. Nowadays， transgenic plants is highly controversial， and using the prokaryotic expressed dsRNA to control the virus could be a new choice. The full length of PLDMV CP gene（879 bp）was chosen to construct a hairpin RNA structure which contains pdk intron by OZ-LIC method. After the coding structure of hairpin RNA inserted into the prokaryotic expression plasmid of pSP73， the recombinant vector was transformed into the RNaseⅢ-deficient Escherichia coli strain of M-Jm109LacY. Then a prokaryotic expression strain with high expression level of CP879-dsRNA was successfully constructed， named M-Jm109LacY-CP879. The recombinant E. coli strain could express CP879-dsRNA stably when induced with IPTG at 0.4 mmol/L. There are two assays in this study：a protective resistance assay and a therapeutic resistance assay. In the protective assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plant leaves before inoculation of PLDMV. The disease incidence， symptom change and ELISA analysis results revealed that the CP879-dsRNA could inhibit the virus' accumulation. In the therapeutic assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plants that had been inoculated with PLDMV after 25 days. ELISA analysis results showed that the virus accumulation declined temporarily during the 3th to 12th day after spraying with CP879-dsRNA.The results showed that the effect of protective treatment was better than that of therapeutic treatment. If sprayed with CP879-dsRNA two or three times a month， the plants may be able to prevent PLDMV infection.
Key words Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； Prokaryotic expression system； dsRNA； RNA silencing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.028
番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）为马铃薯Y病毒属（Portyvirus）病毒，于1954年在日本冲绳岛北部地区首次发现，起初因其所引发的病症与番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）相似，冲绳岛上的木瓜病一度被认为是由PRSV引起的，不过进一步的电子显微镜和血清学研究揭示出其是马铃薯Y病毒属中的一种新病毒，随后被命名为番木瓜畸形花叶病毒[1]。之后在美国塞班岛[2]、中国台湾[2]和海南[3]等地也相继被发现。该病毒是继PRSV之后发现的又一种极具毁灭性的番木瓜病害之一，另外因其能够侵染抗PRSV的转基因番木瓜，故其对木瓜种植业发展已构成了潜在的威胁[4]。利用转基因技术培育同时能抗PRSV和PLDMV的番木瓜植株为最有效的方法[5]，但由于公众对转基因农作物的安全性一直心存疑虑，其市场推广依然存在着极大阻碍。因此，研发一种安全有效的PLDMV防控新策略具有重大意义。 RNA沉默（RNA scilencing）是生物体外源或内源的dsRNA进入到细胞中，特异性的降解与其同源的mRNA，从而抑制相关基因表达的现象[6]。这为植物能有效的对抗病毒带来了新的曙光[7]。双链RNA（dsRNA）在RNA沉默中扮演着极为关键的角色，只有较大剂量的dsRNA才能诱导RNA沉默的发生[8]。国内外大量研究表明，利用原核表达的dsRNA能够有效保护植物不被病毒侵染，且相对于能表达dsRNA的转基因抗病毒植物更加安全、便捷。最初的研究是由Tenllado等[9]发起的，该研究团队用辣椒轻斑驳病毒（Peppermild mottle virus，PMMoV）复制酶基因的部分序列（IR54），构建了能表达ihpRNA结构的原核表达载体pGEM/IR54，并将其转化HT115（DE3）菌株来构建其原核表达体系，然后用经IPTG诱导过的重组菌株制备成高压细胞破碎液，直接喷施到烟草上，可使烟草在一定时期内对PMMoV产生抗性。张德咏等[10]用黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）AN株系的CP基因作为中间间隔序列，构建了含有CMV P3613株系MP基因的ihpRNA原核表达载体，并转化HT115（DE3）菌株，用其超声波破碎液喷洒烟草，分别进行保护性处理和治疗性处理，能起到较好的保护效果，抗病效率分别为为55%和25%。Yin等[11]利用烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）CP基因构建了原核表达载体pGEM-CP480并转化M-JM109lacY菌株，将表达得到的dsRNA与TMV混合接种到烟草叶片上，结果仅有40%的植株发病。Gan等[12]利用pUCCRNAi载体构建了含有甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，ScMV）CP基因部分序列的发卡RNA结构，并转化HT115（DE3）菌株，将相应的dsRNA粗提液喷施到玉米植株上，能有效诱导玉米抵御ScMV的侵染。郑海刚等[13]将原核表达的dsRNA通过摩擦接种法，诱导了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的抗性，抗病效率为40%。杨国峰等[14]构建了番木瓜环斑病毒PRSV HC-Pro基因的dsRNA原核表达体系，并用其高压细胞破碎液直接喷施番木瓜植株，能高效诱导番木瓜植株对PRSV产生抗性，抗病效率达到50%。本研究利用OZ-LIC[15]（One-step，zero-background ligation-independent cloning）法构建了PLDMV外壳蛋白（coat protein，CP）基因全长dsRNA的原核表达体系，并用dsRNA高压细胞破碎液对番木瓜植株分别进行保护性处理和治疗性处理，以探究在体外利用原核表达的dsRNA生物制剂防治番木瓜畸形花叶病毒的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 株高25 cm左右的‘穗中红48’（Suizhonghong-48）非转基因番木瓜健康组培苗，由本实验室培养保存。
1.1.2 质粒与菌株 RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY为朱常香教授（山东农业大学）惠赠。pRNAi-LIC载体由刘玉乐教授（清华大学）惠赠。番木瓜畸形花叶病毒海南株（PLDMV-HN-DF）由本实验室分离保存。含有PLDMV全长的cDNA克隆（GenBank登录号：JX974555.1）由本实验室保存。pSP73原核表达载体购自Promega公司。
1.1.3 主要试剂和酶 Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，T4 DNA聚合酶以及各种限制性内切酶购自Fermentas公司，2×Eco Taq Super PCR Mix，Trance10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，Trizol试剂购自Ambion公司，ELISA检测所用的PLDMV CP兔抗血清由本实验室制备，酶标抗体碱性磷酸酯酶羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 引物设计参照OZ-LIC法进行，引物序列中用虚线标记部分为与pRNAi载体上相对应的接头序列（LIC1～4），引物序列中用实线标记部分为引入的酶切位点，这是为了便于将发卡结构从pRNAi-LIC载体上切下，并转接到pSP73原核表达载体上而设计的，笔者分别在2个将要扩增的目的片段的5′端设计了2个限制性酶切位点：XhoⅠ和KpnⅠ。扩增dsRNA正向序列的引物LIC1-879上的酶切位点为XhoⅠ，扩增dsRNA反向序列的引物LIC4-879上的酶切位点为KpnⅠ，最后交由Invitrogen公司合成（表1）。
1.2.2 原核表达载体的构建 PLDMV CP基因全长的克隆：使用Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，以含有PLDMV全长cDNA克隆的质粒为模板扩增目的片段，引物LIC1-879，LIC2-879扩增所得的PCR产物1作为构建dsRNA发卡结构的正向序列；引物LIC3-879，LIC4-879的扩增所得的PCR产物2作为构建dsRNA发卡结构的反向序列。扩增所得的2个产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测正确后，将目的条带回收并纯化。
含有pdk内含子的发卡RNA结构的构建：①在PCR管中依次加入1 μL 5×reaction buffer，2 μL纯化过后PCR产物1/PCR产物2（约50 ng），0.25 μL dATPs（100 mmol/L）和0.1 μL T4 DNA聚合酶（约0.5 Units），1.65 μL ddH2O 后于22 ℃反应30 min后，再经75 ℃ 处理20 min使T4 DNA聚合酶失活；②用限制性内切酶SmaⅠ对载体 pRNAi-LIC进行酶切处理，37 ℃酶切30 min后经65 ℃处理20 min使SmaⅠ失活；③在PCR管中加入10 μL 5×reaction buffer，36.5 μL经SmaⅠ消化过的pRNAi-LIC载体，2.5 μL dTTPs（100 mmol/L）和1 μL T4 DNA polymerase，反应条件同步骤1；④取3 μL经过步骤3处理过的pRNAi-LIC载体，同经过步骤1处理过的2种PCR产物混合，先经65 ℃ 处理 5 min，然后于22 ℃ 连接15～30 min；⑤将连接好产物转化大肠杆菌 Trans10感受态细胞，均匀涂布于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素固体LB平板上，37 ℃倒置培养16～20 h后筛选重组子。构建好的发卡RNA结构应如图1所示。 发卡RNA结构的酶切鉴定：从转化的平板上挑取单个菌落接种于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素的液体LB中，震荡培养过夜后提取质粒做酶切鉴定。共做了2种酶切鉴定：若质粒构建成功，则用SacⅠ和BamHⅠ酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳可见到3条带。经XhoⅠ和KpnⅠ酶切可产生4条带，其中一条为编码发卡RNA结构的目的条带。
dsRNA原核表达载体的构建与鉴定：回收并纯化从pRNAi-LIC载体上酶切下的发卡结构DNA片段，与同样经XhoⅠ和KpnⅠ酶切处理过的载体pSP73按3 ∶ 1比例混合，添加T4 DNA连接酶后4 ℃连接过夜；取连接产物转化由M-Jm109LacY菌株制备的感受态细胞，均匀涂布于含有50 μg/L kan和50 μg/L Amp的固体LB平板上，37 ℃倒置培养16～20 h；挑取单菌落摇菌后用引物LIC3-879和LIC4-879做菌液PCR鉴定。同时用pSP73空载体构建的菌株M-Jm109LacY/pSP73作为阴性对照。
1.2.3 dsRNA的诱导表达 将构建成功的重组菌株接种至10 mL含50 μg/L Kan与50 μg/L Amp LB液体培养基中37 ℃，250 r/min振荡培养过夜，然后将菌液全部加入到200 mL LB液体培养基（抗性同前）中于37 ℃，250 r/min振荡培养约2 h，直至A600 nm=0.5左右，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG于37 ℃，250 r/min诱导培养约3 h后，离心收集菌体后用Trizol试剂提取总RNA。对提取得到的RNA样品分别先后用DNaseⅠ与RNaseA进行消化处理。具体步骤为：向PCR管中依次加入2.0 μL RNA样品（约1 μg），1.0 μL 10×DNaseⅠBuffer，1.0 μL DNaseⅠ（1 U/μL），6.0 μL ddH2O，于37 ℃恒温水浴30 min；取5.0 μL 经DNaseⅠ消化过后的RNA样品，加入6 μL NaCl（1 mol/L），0.5 μL RNase A（1 ng/μL），于37 ℃恒温水浴1 h；用1%琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA以及2种消化产物进行分析。
1.2.4 dsRNA粗提液的制备 将诱导后的菌液离心收集菌体，用含有10 mmol/L Tris（pH=7.5），1 mmol/L EDTA缓冲液对菌体进行重悬，然后使用高压细胞破碎仪（Constant Systems公司，英国）对收集到的菌体以0.98 kPa的压强进行破碎处理。
1.2.5 使用dsRNA粗制品处理番木瓜植株 研究共设2个处理，一为保护性处理，另一为治疗性处理，每处理均设3个重复。将保护性处理分为2个组，每组30株苗，一组喷施CP879-dsRNA粗提液，另一组喷施经IPTG诱导的转入pSP73空载体的细胞破碎液作为对照。叶片的正反两面均须喷施均匀。于喷施后的第2天，摘取取新鲜的PLDMV病叶配以适量石英砂以及PBS缓冲液进行研磨，之后取其汁液人工摩擦接种到2组番木瓜植株的叶片上，每天观察并记录植株的发病情况。每组中随机选取3株苗进行取样，依次于接种后的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天剪取位于被接种过的叶片以上的叶片进行ELISA分析。治疗性处理同样分为2个组，每组选取30株苗，均为接种PLDMV 25 d后已表现出病症的番木瓜组培苗。一组喷施CP879-dsRNA粗提液，另一组喷施经IPTG诱导的转入pSP73空载体的细胞破碎液作为对照。每天观察发病情况。每组中随机选取3株番木瓜苗进行取样，依次于喷施前（0 d）和喷施后的第3、6、9、12、15、18天剪取取样株顶部病叶进行ELISA分析。
1.2.6 喷施CP879-dsRNA后番木瓜植株中的病毒积累量的测定 本研究中ELISA检测采用的是双抗体夹心法（DAS ELISA）。用包被缓冲液将PLDMV CP兔抗血清稀释至1～10 μg/mL，然后吸取100 μL加入到到每个聚苯乙烯板的反应孔中，4 ℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min；取新鲜的病叶研磨后离心取上清，吸取100 μL加入到上述已包被的反应孔中，于湿盒中37 ℃温育1 h后进行洗涤（同步骤2），同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；于各反应孔中，加入100 μL现配的按1 ∶ 3 000的比例稀释的碱性磷酸酯酶羊抗兔IgG。37 ℃温育1 h后洗涤（同步骤2）；于各反应孔中加入100 μL临时配制的PNP（1 mg/mL）底物溶液，于室温（25 ℃）避光温育30 min；于各反应孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸以终止反应；用酶标仪在405 nm波长下，以空白对照孔调零后测各孔OD值，分析各处理的保护效果。试验组的OD值/阴性对照的OD值若大于2.1则可判断为阳性，若小于2.1则可判断为阴性。
2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆
以含PLDMV全长的cDNA的质粒为模板，引物LIC1-879，LIC2-879扩增得到了构建dsRNA发卡结构的正向序列，引物LIC4-879，LIC3-879扩增得到了构建dsRNA发卡结构的反向序列，片段大小均约为879 bp。扩增结果如图2所示。
2.2 dsRNA发卡结构的酶切鉴定
2种酶切鉴定结果如图3所示：经SacⅠ和BamHⅠ酶切后产生了3条片段，第1条片段的大小为9.7 kb，第2条片段的大小为1 932 bp，最后1条片段的大小为1 501 bp。经XhoⅠ和KpnⅠ酶切共产生了4条片段，其中第2条片段即为需要回收的发卡结构，片段大小约为3 369 bp，所有片段大小均与预期结果一致。说明dsRNA发卡结构已经构建成功，将构建成功的质粒命名为pRNAi-CP879。
2.3 dsRNA的表达分析 用Trizol试剂提取的细菌总RNA及其酶解结果如图4所示，将转入重组质粒的菌株所提取的RNA样品经DNaseⅠ和RNaseA先后处理后，目的条带（图4中约879 bp处）不会被消化掉（因RNaseA在高盐下消化，故条带迁移速率比其它样品慢），而由M-Jm109LacY/pSP73对照菌株所提取的RNA样品会被消化掉，证明经IPTG诱导表达出的RNA样品主要是dsRNA，将该dsRNA命名为CP879-dsRNA。
2.4 CP879-dsRNA处理后番木瓜植株的发病情况
对于保护性处理，在接种PLDMV后第18天时，部分对照组植株的顶部嫩叶开始显现出病症，而喷施dsRNA粗提液的实验组植株均没有植株发病；第24天时，对照组植株已全部发病，而实验组植株总共只有5株发病；截至第30天时，实验组植株仍有有14株苗未发病（表2）。与对照组100%发病率相比，实验组植株的发病率仅为47%。保护性处理中不同植株的病症见图5A。
对于治疗性处理，在喷施CP879-dsRNA后的18 d内，对照组植株叶片病症状逐渐加重，由最初的泡状突起、叶脉发白、花叶发展到新生嫩叶卷曲、皱缩和严重畸形；而实验组植株在喷施CP879-dsRNA粗提液后第10天左右，部分植株叶片出现症状减轻的现象，甚至有部分植株顶部长出了没有病症的新叶，但在随后的一周时间里，叶片病症又逐渐加重（图5B）。
2.5 CP879-dsRNA 处理后番木瓜植株中PLDMV积累量
在保护性处理中，阴性对照组植株的A405 nm=0.107±0.009。阳性对照组植株在接种PLDMV后第12天以前的ELISA检测结果均呈阴性，第12天及12天之后的ELISA检测结果均呈阳性，且随后病毒积累量不断升高；而喷施过CP879-dsRNA粗提液的处理组植株在第18天时，ELISA检测结果才呈现出阳性，比阳性对照晚了近一周，且各植株中的病毒积累量均显著低于同一时间内的对照组植株（图6）。
在治疗性处理中，阴性对照组植株的A405 nm=0.104±0.012，喷施M-Jm109LacY/pSP73细胞破碎液的阳性对照组植株中的病毒积累量随着时间的推移不断升高，而喷施CP879-dsRNA粗提液的处理组植株在第3～12天内的病毒积累显著低于阳性对照组植株，但随后病毒积累量又逐日升高，直至第15天时与阳性对照组植株已无显著差别（图7）。
3 讨论与结论
根据病毒基因能够被与其自身基因同源的特异dsRNA沉默的机制，常规的方法为利用基因工程技术构建相关病毒基因的dsRNA植物表达载体转入到植物中，从而获得相应的抗病毒转基因植株。该方法已应用到烟草[16-17]，大麦[18]，大豆[19]，葡萄柚[20]，马铃薯[21]等众多农作物上。但是近年来关于转基因农作物潜在的生态风险和食品安全性问题一直备受争议，转基因植物的推广也因此变得异常艰难，而通过原核大量表达的dsRNA对植物进行体外喷施处理则相对来说更安全和高效。传统的构建dsRNA发卡结构的方法通常需要多步酶切与连接反应，操作复杂。而本研究所用的OZ-LIC法不需要使用T4 DNA连接酶，几乎零背景，只需用T4 DNA聚合酶的外切酶活性分别将载体、正向序列与反向序列切出能够互补的粘性末端后，进行一步连接反应即可完成发卡RNA结构的构建。与传统法相比非常简单、迅速。
RNA沉默具有高度的特异性，若要dsRNA的沉默效率高，则所选用的dsRNA序列与被沉默的基因需要具有高度的同源性[22]。另外Wesley等[23]的研究结果表明，发卡RNA在RNA沉默中起到决定性作用的结构是其茎环结构中“茎”的那一部分。且“茎”越长，沉默效果就越好，但是太长又会不利于发卡结构的稳定性[24]。本研究为了保障dsRNA能同时具备较高的沉默效率与稳定性，特别挑选了PLDMV CP基因全长（879 bp）来构建dsRNA，最终表达得的dsRNA在DNaseⅠ和RNase A同时存在的情况下不易被降解。由此表明CP879-dsRNA能在体外稳定存在，具有较高的稳定性。
RNA沉默具有高效性和扩散性的特点，RISC复合物切割靶标RNA这一过程会被一种依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）所识别，RdRp能够以dsRNA为模板扩增dsRNA，经过多次循环使得dsRNA大量积累，从而进一步放大RNA沉默的信号，与此同时基因沉默抑制子（Suppressor of Gene silencing，SGS）能够稳固dsRNA底物以帮助DCL蛋白生成更多的次级siRNA，从而增强RNA沉默效应[25]。另外Fire等[6]发现，将dsRNA注射到线虫体内，这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，引起其他细胞的基因沉默。对于保护性处理，在向植株接种病毒之前，通过外源dsRNA诱导，植物不同组织细胞内已积累了一定量siRNA，而通过蚜虫或机械摩擦引入的病毒是局部的、微量的，在病毒还没来得及大量增殖的时候，这些siRNA便能够从源头上抑制病毒的复制，从而阻止病毒向植株其他组织细胞扩散。而在治疗性处理中，病毒已对植株造成了系统性侵染，病毒粒子遍布不同组织细胞，此时喷施dsRNA虽也能诱导siRNA生成，但由于病毒积累量较大，且通过这一方式所产生的siRNA并不是永久性的，因此只能在短期内发挥作用，并不能彻底清除植株内病毒，这或许是保护性处理的效果要优于治疗性处理的原因。
本研究构建的番木瓜畸形花叶病毒CP基因全长dsRNA原核表达体系，在保护性处理中，喷施CP879-dsRNA粗提液能够有效诱导木瓜苗对PLDMV的抗性。对于治疗性处理，它能够在短期内抑制PLDMV积累，部分植株出现症状减轻的现象，但随后PLDMV积累量又逐步升高，病症愈发严重。由此可以看出，保护处理的效果要优于治疗性处理，这一结果与张德咏[10]和杨国峰[14]所得结果相似。可以预见，在大田生产上，于PLDMV的高发期，若每个月对未感病的番木瓜植株喷施2～3次CP879-dsRNA粗提液，或许能够有效预防PLDMV对番木瓜植株的侵染。但具体的施用浓度与施用量仍有待于进一步验证与研究。 参考文献
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关键词 番木瓜畸形花叶病毒；原核表达；dsRNA；RNA沉默
中文分类号 S667.97 文献标识码 A
Abstract Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）is a potential threat to papaya cultivation. Nowadays， transgenic plants is highly controversial， and using the prokaryotic expressed dsRNA to control the virus could be a new choice. The full length of PLDMV CP gene（879 bp）was chosen to construct a hairpin RNA structure which contains pdk intron by OZ-LIC method. After the coding structure of hairpin RNA inserted into the prokaryotic expression plasmid of pSP73， the recombinant vector was transformed into the RNaseⅢ-deficient Escherichia coli strain of M-Jm109LacY. Then a prokaryotic expression strain with high expression level of CP879-dsRNA was successfully constructed， named M-Jm109LacY-CP879. The recombinant E. coli strain could express CP879-dsRNA stably when induced with IPTG at 0.4 mmol/L. There are two assays in this study：a protective resistance assay and a therapeutic resistance assay. In the protective assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plant leaves before inoculation of PLDMV. The disease incidence， symptom change and ELISA analysis results revealed that the CP879-dsRNA could inhibit the virus' accumulation. In the therapeutic assay， CP879-dsRNA was used to spray onto the plants that had been inoculated with PLDMV after 25 days. ELISA analysis results showed that the virus accumulation declined temporarily during the 3th to 12th day after spraying with CP879-dsRNA.The results showed that the effect of protective treatment was better than that of therapeutic treatment. If sprayed with CP879-dsRNA two or three times a month， the plants may be able to prevent PLDMV infection.
Key words Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； Prokaryotic expression system； dsRNA； RNA silencing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.028
番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）为马铃薯Y病毒属（Portyvirus）病毒，于1954年在日本冲绳岛北部地区首次发现，起初因其所引发的病症与番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）相似，冲绳岛上的木瓜病一度被认为是由PRSV引起的，不过进一步的电子显微镜和血清学研究揭示出其是马铃薯Y病毒属中的一种新病毒，随后被命名为番木瓜畸形花叶病毒[1]。之后在美国塞班岛[2]、中国台湾[2]和海南[3]等地也相继被发现。该病毒是继PRSV之后发现的又一种极具毁灭性的番木瓜病害之一，另外因其能够侵染抗PRSV的转基因番木瓜，故其对木瓜种植业发展已构成了潜在的威胁[4]。利用转基因技术培育同时能抗PRSV和PLDMV的番木瓜植株为最有效的方法[5]，但由于公众对转基因农作物的安全性一直心存疑虑，其市场推广依然存在着极大阻碍。因此，研发一种安全有效的PLDMV防控新策略具有重大意义。 RNA沉默（RNA scilencing）是生物体外源或内源的dsRNA进入到细胞中，特异性的降解与其同源的mRNA，从而抑制相关基因表达的现象[6]。这为植物能有效的对抗病毒带来了新的曙光[7]。双链RNA（dsRNA）在RNA沉默中扮演着极为关键的角色，只有较大剂量的dsRNA才能诱导RNA沉默的发生[8]。国内外大量研究表明，利用原核表达的dsRNA能够有效保护植物不被病毒侵染，且相对于能表达dsRNA的转基因抗病毒植物更加安全、便捷。最初的研究是由Tenllado等[9]发起的，该研究团队用辣椒轻斑驳病毒（Peppermild mottle virus，PMMoV）复制酶基因的部分序列（IR54），构建了能表达ihpRNA结构的原核表达载体pGEM/IR54，并将其转化HT115（DE3）菌株来构建其原核表达体系，然后用经IPTG诱导过的重组菌株制备成高压细胞破碎液，直接喷施到烟草上，可使烟草在一定时期内对PMMoV产生抗性。张德咏等[10]用黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）AN株系的CP基因作为中间间隔序列，构建了含有CMV P3613株系MP基因的ihpRNA原核表达载体，并转化HT115（DE3）菌株，用其超声波破碎液喷洒烟草，分别进行保护性处理和治疗性处理，能起到较好的保护效果，抗病效率分别为为55%和25%。Yin等[11]利用烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）CP基因构建了原核表达载体pGEM-CP480并转化M-JM109lacY菌株，将表达得到的dsRNA与TMV混合接种到烟草叶片上，结果仅有40%的植株发病。Gan等[12]利用pUCCRNAi载体构建了含有甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，ScMV）CP基因部分序列的发卡RNA结构，并转化HT115（DE3）菌株，将相应的dsRNA粗提液喷施到玉米植株上，能有效诱导玉米抵御ScMV的侵染。郑海刚等[13]将原核表达的dsRNA通过摩擦接种法，诱导了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的抗性，抗病效率为40%。杨国峰等[14]构建了番木瓜环斑病毒PRSV HC-Pro基因的dsRNA原核表达体系，并用其高压细胞破碎液直接喷施番木瓜植株，能高效诱导番木瓜植株对PRSV产生抗性，抗病效率达到50%。本研究利用OZ-LIC[15]（One-step，zero-background ligation-independent cloning）法构建了PLDMV外壳蛋白（coat protein，CP）基因全长dsRNA的原核表达体系，并用dsRNA高压细胞破碎液对番木瓜植株分别进行保护性处理和治疗性处理，以探究在体外利用原核表达的dsRNA生物制剂防治番木瓜畸形花叶病毒的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 株高25 cm左右的‘穗中红48’（Suizhonghong-48）非转基因番木瓜健康组培苗，由本实验室培养保存。
1.1.2 质粒与菌株 RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY为朱常香教授（山东农业大学）惠赠。pRNAi-LIC载体由刘玉乐教授（清华大学）惠赠。番木瓜畸形花叶病毒海南株（PLDMV-HN-DF）由本实验室分离保存。含有PLDMV全长的cDNA克隆（GenBank登录号：JX974555.1）由本实验室保存。pSP73原核表达载体购自Promega公司。
1.1.3 主要试剂和酶 Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，T4 DNA聚合酶以及各种限制性内切酶购自Fermentas公司，2×Eco Taq Super PCR Mix，Trance10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，Trizol试剂购自Ambion公司，ELISA检测所用的PLDMV CP兔抗血清由本实验室制备，酶标抗体碱性磷酸酯酶羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 引物设计参照OZ-LIC法进行，引物序列中用虚线标记部分为与pRNAi载体上相对应的接头序列（LIC1～4），引物序列中用实线标记部分为引入的酶切位点，这是为了便于将发卡结构从pRNAi-LIC载体上切下，并转接到pSP73原核表达载体上而设计的，笔者分别在2个将要扩增的目的片段的5′端设计了2个限制性酶切位点：XhoⅠ和KpnⅠ。扩增dsRNA正向序列的引物LIC1-879上的酶切位点为XhoⅠ，扩增dsRNA反向序列的引物LIC4-879上的酶切位点为KpnⅠ，最后交由Invitrogen公司合成（表1）。
1.2.2 原核表达载体的构建 PLDMV CP基因全长的克隆：使用Pyrobest DNA Polymerase高保真酶，以含有PLDMV全长cDNA克隆的质粒为模板扩增目的片段，引物LIC1-879，LIC2-879扩增所得的PCR产物1作为构建dsRNA发卡结构的正向序列；引物LIC3-879，LIC4-879的扩增所得的PCR产物2作为构建dsRNA发卡结构的反向序列。扩增所得的2个产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测正确后，将目的条带回收并纯化。
含有pdk内含子的发卡RNA结构的构建：①在PCR管中依次加入1 μL 5×reaction buffer，2 μL纯化过后PCR产物1/PCR产物2（约50 ng），0.25 μL dATPs（100 mmol/L）和0.1 μL T4 DNA聚合酶（约0.5 Units），1.65 μL ddH2O 后于22 ℃反应30 min后，再经75 ℃ 处理20 min使T4 DNA聚合酶失活；②用限制性内切酶SmaⅠ对载体 pRNAi-LIC进行酶切处理，37 ℃酶切30 min后经65 ℃处理20 min使SmaⅠ失活；③在PCR管中加入10 μL 5×reaction buffer，36.5 μL经SmaⅠ消化过的pRNAi-LIC载体，2.5 μL dTTPs（100 mmol/L）和1 μL T4 DNA polymerase，反应条件同步骤1；④取3 μL经过步骤3处理过的pRNAi-LIC载体，同经过步骤1处理过的2种PCR产物混合，先经65 ℃ 处理 5 min，然后于22 ℃ 连接15～30 min；⑤将连接好产物转化大肠杆菌 Trans10感受态细胞，均匀涂布于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素固体LB平板上，37 ℃倒置培养16～20 h后筛选重组子。构建好的发卡RNA结构应如图1所示。 发卡RNA结构的酶切鉴定：从转化的平板上挑取单个菌落接种于含有25 mg/L卡那霉素以及5 mg/L氯霉素的液体LB中，震荡培养过夜后提取质粒做酶切鉴定。共做了2种酶切鉴定：若质粒构建成功，则用SacⅠ和BamHⅠ酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳可见到3条带。经XhoⅠ和KpnⅠ酶切可产生4条带，其中一条为编码发卡RNA结构的目的条带。
dsRNA原核表达载体的构建与鉴定：回收并纯化从pRNAi-LIC载体上酶切下的发卡结构DNA片段，与同样经XhoⅠ和KpnⅠ酶切处理过的载体pSP73按3 ∶ 1比例混合，添加T4 DNA连接酶后4 ℃连接过夜；取连接产物转化由M-Jm109LacY菌株制备的感受态细胞，均匀涂布于含有50 μg/L kan和50 μg/L Amp的固体LB平板上，37 ℃倒置培养16～20 h；挑取单菌落摇菌后用引物LIC3-879和LIC4-879做菌液PCR鉴定。同时用pSP73空载体构建的菌株M-Jm109LacY/pSP73作为阴性对照。
1.2.3 dsRNA的诱导表达 将构建成功的重组菌株接种至10 mL含50 μg/L Kan与50 μg/L Amp LB液体培养基中37 ℃，250 r/min振荡培养过夜，然后将菌液全部加入到200 mL LB液体培养基（抗性同前）中于37 ℃，250 r/min振荡培养约2 h，直至A600 nm=0.5左右，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG于37 ℃，250 r/min诱导培养约3 h后，离心收集菌体后用Trizol试剂提取总RNA。对提取得到的RNA样品分别先后用DNaseⅠ与RNaseA进行消化处理。具体步骤为：向PCR管中依次加入2.0 μL RNA样品（约1 μg），1.0 μL 10×DNaseⅠBuffer，1.0 μL DNaseⅠ（1 U/μL），6.0 μL ddH2O，于37 ℃恒温水浴30 min；取5.0 μL 经DNaseⅠ消化过后的RNA样品，加入6 μL NaCl（1 mol/L），0.5 μL RNase A（1 ng/μL），于37 ℃恒温水浴1 h；用1%琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA以及2种消化产物进行分析。
1.2.4 dsRNA粗提液的制备 将诱导后的菌液离心收集菌体，用含有10 mmol/L Tris（pH=7.5），1 mmol/L EDTA缓冲液对菌体进行重悬，然后使用高压细胞破碎仪（Constant Systems公司，英国）对收集到的菌体以0.98 kPa的压强进行破碎处理。
1.2.5 使用dsRNA粗制品处理番木瓜植株 研究共设2个处理，一为保护性处理，另一为治疗性处理，每处理均设3个重复。将保护性处理分为2个组，每组30株苗，一组喷施CP879-dsRNA粗提液，另一组喷施经IPTG诱导的转入pSP73空载体的细胞破碎液作为对照。叶片的正反两面均须喷施均匀。于喷施后的第2天，摘取取新鲜的PLDMV病叶配以适量石英砂以及PBS缓冲液进行研磨，之后取其汁液人工摩擦接种到2组番木瓜植株的叶片上，每天观察并记录植株的发病情况。每组中随机选取3株苗进行取样，依次于接种后的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天剪取位于被接种过的叶片以上的叶片进行ELISA分析。治疗性处理同样分为2个组，每组选取30株苗，均为接种PLDMV 25 d后已表现出病症的番木瓜组培苗。一组喷施CP879-dsRNA粗提液，另一组喷施经IPTG诱导的转入pSP73空载体的细胞破碎液作为对照。每天观察发病情况。每组中随机选取3株番木瓜苗进行取样，依次于喷施前（0 d）和喷施后的第3、6、9、12、15、18天剪取取样株顶部病叶进行ELISA分析。
1.2.6 喷施CP879-dsRNA后番木瓜植株中的病毒积累量的测定 本研究中ELISA检测采用的是双抗体夹心法（DAS ELISA）。用包被缓冲液将PLDMV CP兔抗血清稀释至1～10 μg/mL，然后吸取100 μL加入到到每个聚苯乙烯板的反应孔中，4 ℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min；取新鲜的病叶研磨后离心取上清，吸取100 μL加入到上述已包被的反应孔中，于湿盒中37 ℃温育1 h后进行洗涤（同步骤2），同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；于各反应孔中，加入100 μL现配的按1 ∶ 3 000的比例稀释的碱性磷酸酯酶羊抗兔IgG。37 ℃温育1 h后洗涤（同步骤2）；于各反应孔中加入100 μL临时配制的PNP（1 mg/mL）底物溶液，于室温（25 ℃）避光温育30 min；于各反应孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸以终止反应；用酶标仪在405 nm波长下，以空白对照孔调零后测各孔OD值，分析各处理的保护效果。试验组的OD值/阴性对照的OD值若大于2.1则可判断为阳性，若小于2.1则可判断为阴性。
2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆
以含PLDMV全长的cDNA的质粒为模板，引物LIC1-879，LIC2-879扩增得到了构建dsRNA发卡结构的正向序列，引物LIC4-879，LIC3-879扩增得到了构建dsRNA发卡结构的反向序列，片段大小均约为879 bp。扩增结果如图2所示。
2.2 dsRNA发卡结构的酶切鉴定
2种酶切鉴定结果如图3所示：经SacⅠ和BamHⅠ酶切后产生了3条片段，第1条片段的大小为9.7 kb，第2条片段的大小为1 932 bp，最后1条片段的大小为1 501 bp。经XhoⅠ和KpnⅠ酶切共产生了4条片段，其中第2条片段即为需要回收的发卡结构，片段大小约为3 369 bp，所有片段大小均与预期结果一致。说明dsRNA发卡结构已经构建成功，将构建成功的质粒命名为pRNAi-CP879。
2.3 dsRNA的表达分析 用Trizol试剂提取的细菌总RNA及其酶解结果如图4所示，将转入重组质粒的菌株所提取的RNA样品经DNaseⅠ和RNaseA先后处理后，目的条带（图4中约879 bp处）不会被消化掉（因RNaseA在高盐下消化，故条带迁移速率比其它样品慢），而由M-Jm109LacY/pSP73对照菌株所提取的RNA样品会被消化掉，证明经IPTG诱导表达出的RNA样品主要是dsRNA，将该dsRNA命名为CP879-dsRNA。
2.4 CP879-dsRNA处理后番木瓜植株的发病情况
对于保护性处理，在接种PLDMV后第18天时，部分对照组植株的顶部嫩叶开始显现出病症，而喷施dsRNA粗提液的实验组植株均没有植株发病；第24天时，对照组植株已全部发病，而实验组植株总共只有5株发病；截至第30天时，实验组植株仍有有14株苗未发病（表2）。与对照组100%发病率相比，实验组植株的发病率仅为47%。保护性处理中不同植株的病症见图5A。
对于治疗性处理，在喷施CP879-dsRNA后的18 d内，对照组植株叶片病症状逐渐加重，由最初的泡状突起、叶脉发白、花叶发展到新生嫩叶卷曲、皱缩和严重畸形；而实验组植株在喷施CP879-dsRNA粗提液后第10天左右，部分植株叶片出现症状减轻的现象，甚至有部分植株顶部长出了没有病症的新叶，但在随后的一周时间里，叶片病症又逐渐加重（图5B）。
2.5 CP879-dsRNA 处理后番木瓜植株中PLDMV积累量
在保护性处理中，阴性对照组植株的A405 nm=0.107±0.009。阳性对照组植株在接种PLDMV后第12天以前的ELISA检测结果均呈阴性，第12天及12天之后的ELISA检测结果均呈阳性，且随后病毒积累量不断升高；而喷施过CP879-dsRNA粗提液的处理组植株在第18天时，ELISA检测结果才呈现出阳性，比阳性对照晚了近一周，且各植株中的病毒积累量均显著低于同一时间内的对照组植株（图6）。
在治疗性处理中，阴性对照组植株的A405 nm=0.104±0.012，喷施M-Jm109LacY/pSP73细胞破碎液的阳性对照组植株中的病毒积累量随着时间的推移不断升高，而喷施CP879-dsRNA粗提液的处理组植株在第3～12天内的病毒积累显著低于阳性对照组植株，但随后病毒积累量又逐日升高，直至第15天时与阳性对照组植株已无显著差别（图7）。
3 讨论与结论
根据病毒基因能够被与其自身基因同源的特异dsRNA沉默的机制，常规的方法为利用基因工程技术构建相关病毒基因的dsRNA植物表达载体转入到植物中，从而获得相应的抗病毒转基因植株。该方法已应用到烟草[16-17]，大麦[18]，大豆[19]，葡萄柚[20]，马铃薯[21]等众多农作物上。但是近年来关于转基因农作物潜在的生态风险和食品安全性问题一直备受争议，转基因植物的推广也因此变得异常艰难，而通过原核大量表达的dsRNA对植物进行体外喷施处理则相对来说更安全和高效。传统的构建dsRNA发卡结构的方法通常需要多步酶切与连接反应，操作复杂。而本研究所用的OZ-LIC法不需要使用T4 DNA连接酶，几乎零背景，只需用T4 DNA聚合酶的外切酶活性分别将载体、正向序列与反向序列切出能够互补的粘性末端后，进行一步连接反应即可完成发卡RNA结构的构建。与传统法相比非常简单、迅速。
RNA沉默具有高度的特异性，若要dsRNA的沉默效率高，则所选用的dsRNA序列与被沉默的基因需要具有高度的同源性[22]。另外Wesley等[23]的研究结果表明，发卡RNA在RNA沉默中起到决定性作用的结构是其茎环结构中“茎”的那一部分。且“茎”越长，沉默效果就越好，但是太长又会不利于发卡结构的稳定性[24]。本研究为了保障dsRNA能同时具备较高的沉默效率与稳定性，特别挑选了PLDMV CP基因全长（879 bp）来构建dsRNA，最终表达得的dsRNA在DNaseⅠ和RNase A同时存在的情况下不易被降解。由此表明CP879-dsRNA能在体外稳定存在，具有较高的稳定性。
RNA沉默具有高效性和扩散性的特点，RISC复合物切割靶标RNA这一过程会被一种依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）所识别，RdRp能够以dsRNA为模板扩增dsRNA，经过多次循环使得dsRNA大量积累，从而进一步放大RNA沉默的信号，与此同时基因沉默抑制子（Suppressor of Gene silencing，SGS）能够稳固dsRNA底物以帮助DCL蛋白生成更多的次级siRNA，从而增强RNA沉默效应[25]。另外Fire等[6]发现，将dsRNA注射到线虫体内，这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，引起其他细胞的基因沉默。对于保护性处理，在向植株接种病毒之前，通过外源dsRNA诱导，植物不同组织细胞内已积累了一定量siRNA，而通过蚜虫或机械摩擦引入的病毒是局部的、微量的，在病毒还没来得及大量增殖的时候，这些siRNA便能够从源头上抑制病毒的复制，从而阻止病毒向植株其他组织细胞扩散。而在治疗性处理中，病毒已对植株造成了系统性侵染，病毒粒子遍布不同组织细胞，此时喷施dsRNA虽也能诱导siRNA生成，但由于病毒积累量较大，且通过这一方式所产生的siRNA并不是永久性的，因此只能在短期内发挥作用，并不能彻底清除植株内病毒，这或许是保护性处理的效果要优于治疗性处理的原因。
本研究构建的番木瓜畸形花叶病毒CP基因全长dsRNA原核表达体系，在保护性处理中，喷施CP879-dsRNA粗提液能够有效诱导木瓜苗对PLDMV的抗性。对于治疗性处理，它能够在短期内抑制PLDMV积累，部分植株出现症状减轻的现象，但随后PLDMV积累量又逐步升高，病症愈发严重。由此可以看出，保护处理的效果要优于治疗性处理，这一结果与张德咏[10]和杨国峰[14]所得结果相似。可以预见，在大田生产上，于PLDMV的高发期，若每个月对未感病的番木瓜植株喷施2～3次CP879-dsRNA粗提液，或许能够有效预防PLDMV对番木瓜植株的侵染。但具体的施用浓度与施用量仍有待于进一步验证与研究。 参考文献
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