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摘要：以水稻9311为背景、日本晴为供体构建的一套染色体片段代换系为试验材料，利用HL型籼稻不育系粤泰A与代换系测交，根据测交F1群体的花粉育性和小穗育性，结合Bin-map，采用多元回归的方法，对HL型粤泰A的育性恢复QTL进行分析。以花粉育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第2、6和10染色体上，定位区段大小为 379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，定位区段大小为455 070、525 340、247 226 bp。
关键词：水稻；染色体片段代换系；恢复基因；基因定位
中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0064-04
收稿日期：2014-09-06
基金项目：国家“973”计划（编号：2011CB100101）；国家自然科学基金（编号：31071384）；江苏省高校自然科学研究项目（编号：13KJ13210008）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。
作者简介：张宏根（1981—），男，江苏南通人，博士，讲师，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[email protected]。
通信作者：汤述翥，教授，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[email protected]。〖FL（2K2]目前，我国主要有9种胞质不育系类型用于生产，以野败（WA）型、红莲（HL）型和包台（BT）型为3种代表类型[1]。WA型不育系败育彻底、不育性稳定，在杂交籼稻生产利用中占据主导地位。近年来，HL型不育系在杂交籼稻中应用越来越广泛。杂交粳稻以利用BT型不育系为主，推广面积较小。要发展三系杂交稻，HL型杂交籼稻在生产上进一步的利用是一条重要途径。HL型不育系的恢复谱较广，但强恢复系很少，恢复系选育是限制HL型杂交籼稻进一步发展的重要因素。
质核互作雄性不育系的育性恢复是一复杂的遗传性状，并且环境对目标性状表型的影响较大。已有的研究表明，HL型不育系花粉表现为圆败，其育性恢复由主效基因与微效基因共同控制，且基因间可能存在互作[2-4]。目前，在籼稻核背景下，HL型不育系的主效育性恢复基因已被定位[5-9]，而微效基因的定位及基因效应研究相对较少[10]。因此，有效地开展HL型不育系微效基因的定位是选育HL型强恢复系的关键。
如何对微效恢复基因进行定位是育性恢复遗传研究的难点。染色体片段代换系与受体亲本的遗传背景基本一致，其与受体亲本之间以及系与系之间只有单个或少数的染色体片段的差异，因此其表现出的任何差异都可以直接与导入的片段或被替换的片段联系起来，是进行QTL分析及精细定位目标QTL的理想材料。目前，在水稻中已经有很多的学者利用染色体片段代换系来定位重要性状的QTL[11-16]。为定位HL型籼稻不育系的微效恢复基因，本试验在已有研究基础上以水稻9311为背景、日本晴为供体构建的一套染色体片段代换系为试验材料（利用高通量测序对每一个系基因组进行了重新测序，每个系中的代换片段长度及位置均准确获知），其中9311为HL型强恢复系，日本晴为HL型不育系的保持系，利用HL型籼稻不育系粤泰A与代换系测交，根据测交F1群体的花粉育性和小穗育性，结合Bin-map，采用多元回归的方法，对HL型不育系育性恢复的QTL进行分析，相关研究结果有助于HL型恢复系的选育。
1材料与方法
1.1供试材料
以粳稻测序品种日本晴为供体，籼稻测序品种9311为受体构建的128个染色体片段代换系（C1-C128），9311及HL型籼稻不育系粤泰A。
1.2群体配置
2010年正季在扬州种植亲本9311、HL型粤泰A及128个CSSLs，并配制F1：HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时实际收到119个测交F1组合的种子。
2011年春季在海南种植亲本9311、HL型粤泰A、128个CSSLs以及2010年正季获得的各F1，并继续配制HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时收获各F1种子。
2011年正季在扬州种植各亲本以及海南收获的各测交F1，每份材料各种植10苗。由于2011年海南春季温度偏低，配制的一些杂交组合未能收到杂交种，以及播种后一些杂交种没有成苗或后期因病枯死而缺苗，最终在配制测交群体中实际得到的测交系数目为116个。
1.3抽穗期调查
抽穗后及时记载抽穗期（50%的稻穗抽穗），并折算成播种至抽穗的天数表示。
1.4花粉育性鉴定与小穗育性鉴定
每天07：00—09：00，在田间每个测交系中选取4株单株，从每个始花植株上选取1个已抽出约1/3的主穗或较大分蘖穗。镜检时，在每个穗子的中上部枝梗中，选取3朵当天要开放的颖花，用1%I2-KI液染色、压片，在低倍显微镜下观察花粉育性。根据花粉粒的形状和对I2-KI液的染色反应，将花粉划分为典败、圆败、染败和正常4种类型。观察时，选择分布均匀、花粉数目超过100粒的视野，分别记录4类花粉的数目，计算4类花粉的百分率。
在抽穗期间，每天07：00—09：00，选取尚未开花的小穗套袋，自交袋大小为50 cm×20 cm，每系2个袋子，每个袋子2个小穗。20 d后，剔除折断或自交袋破损的穗子，调查群体单株的自交小穗育性。
待种子成熟后，每测交系选取4个主茎穗考察自然小穗育性。
1.5水稻DNA提取与分子标记分析
水稻基因组DNA的提取采用CTAB法[17]。普通PCR采用20 μL的反应体系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，03 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。富含GC含量模板的20 μL反应体系包括：DNA，2×GCI缓冲液10 μL，2.5 μmol/L的dNTP 3.2 μL，0.3 μmol/L的引物20 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s（温度因引物不同而异），72 ℃延伸50 s（不同长度的预期产物按 1 kb/min 调整延伸时间），扩增32个循环；72 ℃延伸10 min，18 ℃保温。PCR反应产物首先在3%琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在UVP Bioimaging Systems凝胶成像仪上成像。 SSR引物的信息来自于Gramene网站上（http：//www.gramene.org/）提供的SSR序列信息。DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、普通PCR试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司和上海英俊公司合成。
1.6基于Bin-map的QTL定位及数据分析
基于Bin-map的QTL定位，主要是采用多元回归的方法，利用SAS软件处理分析。每一个bin作为一个变量，利用方差分析精确估计误差，从而提高遗传分析效率，实现QTL的精确定位。回归模型如下：
yi=b0 ∑mk=1bkxik εi。
式中：yi为第i系的性状平均值，在进行QTL定位时，yi为表示第i染色体片段代换系的性状平均值；b0为模型均值；m是bin的总数；bk为第k 个bin的偏回归系数；xik为第i个系第k个bin基因型的指示变量，依bin的基因型来源不同而取值，来自供体的bin取-1，来自受体亲本的bin取1；εi为随机误差。其他数据在Excel 2003中处理。
2结果与分析
2.1代换系群体的评价
本研究利用的128个染色体片段代换系均为纯系，这些系包含来源于供体亲本日本晴的代换片段259个，平均每个系含有代换片段2.02个，每个系的代换片段数目在1～6个之间。徐建军等根据128个染色体片段代换系的测序物理图谱及代换片段的切割信息，绘制染色体单片段代换片系的Bin-map，总共包括401个Bins，定义为x1～x401[18-19]。Bin的物理长度介于13 213～10 654 035 bp，平均长度为 889 652 bp。该代换系各条染色体的覆盖率分别为91.5%、95.7%、94.8%、100.0%、99.4%、92.0%、95.3%、96.8%、96.4%、59.4%、95.4%和95.0%，平均覆盖率为93.3%。
2.2代换系及测交F1群体的抽穗期
2011年正季，记录各代换系及相应测交F1的抽穗期。9311的抽穗期为102 d，代换系中除C12和C54抽穗期比9311早18～20 d，C40、C114抽穗期比9311晚10～12 d外，其余代换系的抽穗期与9311基本一致；粤泰A与C40测交F1抽穗期较粤泰A与9311测交F1迟12 d，粤泰A与C114测交F1较9311的测交后代抽穗迟5 d，其余测交F1的抽穗期也与9311的测交后代基本一致（表1）。
表1CSSLs及9311对应测交F1抽穗期d
材料CSSLs抽穗期HL粤泰A/CSSLs抽穗期C1284—C5482—C40114117C114112110其余CSSLs99～103103～1079311102105
2.3亲本花粉育性及小穗育性鉴定
2011年正季，调查HL型粤泰A的花粉育性，HL型粤泰A的花粉以圆败为主，存在少量的浅染花粉，各代换系与对照9311花粉均正常。HL型粤泰A自然小穗育性为0，除抽穗较迟的C40、C114（这2个系在扬州不能正常成熟）外，其他代换系自然小穗育性均在85%以上（数据未列出），代换系与对照9311之间无显著差异。
2.4HL型粤泰A/CSSLs测交F1群体的育性表现
2010年正季配组得到的119份HL型粤泰A/CSSLs的种子带海南种植，并考察各测交F1的套袋小穗育性及自然小穗育性。结果表明，119个HL型粤泰A/CSSLs测交F1群体中套袋小穗育性平均为36.33%，自然小穗育性平均为6008%，HL型粤泰A/9311 F1自然小穗育性为60.37%，育性偏低。分析原因，2011年春季海南气温偏低，致使测交F1小穗育性整体偏低，因此本研究中，海南考种的数据未作分析。
2011年正季，调查HL型粤泰A与9311及128个CSSLs测交得到的116个测交F1的小穗育性及花粉育性，结果见表2。表2HL型粤泰A与9311及115个CSSLs测交F1的育性调查%
育性指标HL粤泰A/9311平均值±标准差变化区间HL粤泰A/CSSLs平均值±标准差变化区间花粉育性82.50±2.8980.00～85.0084.54±6.4957.50～95.00套袋小穗育性44.59±8.7636.92～56.4342.42±10.9618.51～73.43自然小穗育性87.12±3.3482.82～90.5785.82±7.3657.46～97.37
由表2可知，从不同育性指标考察的育性标准差来看，在花粉育性、套袋小穗育性、自然小穗育性这3个指标中，不论是9311还是代换系测交群体，均以套袋小穗育性的标准偏差最大，并且套袋小穗育性较自然小穗育性明显降低，说明袋内小气候对小穗育性影响很大（尽管本研究中采用较大的自交袋来增加袋内空间，改善自交袋内小气候以降低环境对小穗育性的影响），不能代表该测交群体育性的真实情况。
HL型粤泰A/9311 F1的自然小穗育性为87.12%，HL型粤泰A/CSSLs F1群体中测交系的自然小穗育性分布于5746%～97.37%，其中有73.21%的测交系自然小穗育性分布于80%～95%范围内，与对照相近（图1-a）。HL型粤泰A/9311 F1的花粉育性为82.50%，HL型粤泰A/CSSLs F1群体中测交系的花粉育性分布于57.50%～95.00%，其中有76.23%的测交系的花粉育性分布在80%～90%范围内，与对照接近（图1-b）。
2.5恢复基因Rf5、Rf6的分子标记检测及效应初步分析
已有研究表明，恢复系9311存在2对独立的HL型粤泰A的主效恢复基因Rf5与Rf6，分别位于第10、8染色体上[8-9]。本研究利用与Rf5紧密连锁的标记RM171、与Rf6紧密连锁的标记RM1019（标记在9311与日本晴之间具有多态，在9311与HL型粤泰A之间无多态）检测128个CSSLs及对应的各测交F1。结果表明，在128个代换系中，C31、C47、C49、C115、C116、C119等在标记RM171处表现为日本晴带型，其测交后代表现为双亲杂合带型，说明这6个代换系中带有Rf5的9311片段被日本晴替换，其他各代换系均表现为9311带型，说明其他各代换系均带有Rf5；在标记RM1019处，各代换系及测交后代均表现为9311带型，说明所用各代换系均带有Rf6，相关检测结果与CSSLs重测序一致。C31等6个代换系及9311测交F1的花粉育性及小穗育性见表3。 表36个Rf5被替换代换系及对照9311测交F1的育性
组合套袋小穗
小穗育性（%）自然小穗
小穗育性（%）花粉育性
（%）HL型粤泰A/C3123.99** 68.41* 87.50HL型粤泰A/C4735.2184.2680.00HL型粤泰A/C4934.8893.0770.00HL型粤泰A/C11518.73** 77.5665.00** HL型粤泰A/C11627.24** 84.0760.00** HL型粤泰A/C11937.4585.4357.50** 以上组合的平均值29.58*82.1369.00* HL型粤泰A/931144.5987.1282.50注：*表示与对照相比有显著变化（P<0.05）；**表示与对照相比有极显著变化（P<0.01）。
由表3可知，在HL型粤泰A与6个Rf5被替换代换系测交F1中，C31测交F1的自然小穗育性较对照显著降低，其他5个系的自然小穗育性与对照之间无显著差异，6个测交系平均值与对照之间无显著差异，表明在Rf6基因存在的前提下，Rf5基因的缺少对自然小穗育性影响较小；C31、C47及C49测交F1的花粉育性与对照之间无显著差异，C115、C116及C119测交F1的花粉育性较对照极显著降低。6个系平均花粉育性较对照显著降低，表明Rf5基因的缺少使花粉育性显著降低。但C31等6个代换系测交F1花粉育性不同，推测C31、C47及C49等代换系测交F1中部分正常花粉可能为染败花粉，由于染色较深，无法与正常花粉区分所致。6个测交系与对照的套袋小穗育性均偏低，与测交系群体育性的实际情况偏差较大。
2.6不同育性指标调查结果之间的相关性分析
对HL型粤泰A与CSSLs及对照9311测交得到的116个测交F1群体3个指标的育性进行相关性分析（表4）。由表4可知，花粉育性与自然小穗育性及套袋小穗育性之间相关性不显著，套袋小穗育性与自然小穗育性之间存在显著正相关，但相关系数也不高，仅为0.230。考虑到套袋结实率受套袋环境影响较大，因此本研究中以花粉育性与自然小穗育性来进行恢复基因的QTL分析。
表4不同指标育性相关分析
育性指标相关系数花粉育性套袋小穗育性自然小穗育性花粉育性1.000套袋小穗育性0.0831.000自然小穗育性0.0470.230*1.000
2.7育性恢复QTL定位
以花粉育性与自然小穗育性为指标，基于多元回归的方法，结合Bin-map，利用SAS软件对HL型粤泰A与CSSLs测交F1群体的育性恢复相关QTLs进行定位，各定位到3个育性恢复相关的QTLs（表5）。
由表5可知，以花粉育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第2、第6和第10染色体上，定位区段大小为379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，定位区段大小为455 070、525 340、247 226 bp。其中 qRF6-1 对应测交系父表5育性恢复QTL的定位
育性指标QTLs染色体
3讨论
水稻细胞质雄性不育系恢复基因的研究过程中，育性划分需采取一个适当的育性指标来进行。研究者一般采用花粉育性和小穗育性为育性指标进行育性划分，其中小穗育性包括自然小穗育性和套袋小穗育性，不同学者对采用何种指标所持观点不尽相同。HL型不育系粤泰A的花粉败育以圆败为主，但梁国华等以粤泰A与不同品种杂交，调查了F1的花粉育性和小穗育性，发现部分组合出现典败或染败花粉，与此类似的是本课题组转育的多个HL型粳稻不育系花粉以染败（染色较深）为主，说明不同核背景的HL型不育系花粉败育特征之间存在差异，因此在HL型粤泰A与CSSLs测交系群体中可能出现染败花粉[20]。镜检花粉育性时，测交系中圆败花粉比较容易鉴定，染败花粉与正常花粉则较难区分，这是花粉育性与小穗育性之间相关性不显著的重要原因之一，因此在本研究中不宜采用花粉育性这单一指标来分析。水稻是自花授粉作物，异花串粉对不育株和部分可育株的影响大于对可育株的影响，而套袋对可育株的影响较大[21]。本研究中测交系均为可育，套袋对植株的结实率影响较大，因此套袋小穗育性不宜作为育性鉴定指标。为求尽可能准确地反映群体中育性分离情况，本研究中采用花粉育性和自然小穗育性2类指标来定位育性恢复相关的QTLs。
关于HL型育性恢复基因遗传研究，朱英国等以HL型杂交水稻青优早为材料研究认为HL型不育系育性恢复除了受1对主效基因控制外，还受微效基因的影响[3]。梁国华等[22]、黄青阳等[23]研究认为HL型不育系丛广41A属于配子体不育类型，其育性恢复受显性单基因控制。关于恢复基因的定位，黄青阳等、Liu等和Huang等将HL型雄性不育的恢复基因Rf5定位在第10染色体上，定位区段比较一致[5-7]。Liu等在9311中定位到第10染色体上另一个恢复基因位点，命名为Rf6（t）[6]。李绍清在第10染色体分子标记RM184与RM6704-1之间定位到1个恢复基因，暂命名为Rf7[24]。Huang等定位到分别位于第10染色体上的主基因Rf5及第8染色体短臂上标记RM3710与RM22242之间的主基因Rf6[8]。Hu等将Rf5定位于第10染色体上标记RM6469与RM25661之间[9]。关于微效基因的定位，刘航等定位到第10染色体上1个主效QTL qRF-10-1，并在第1、第2、第10染色体上定位到3个微效QTL[10]。
本研究中，在HL粤泰A/CSSLs的测交群体中，对照HL粤泰A/9311可育花粉达80%～85%，与Huang等的鉴定结果[8]一致。本研究中共定位到与HL粤泰A育性恢复相关的6个QTLs，其中以花粉育性为指标定位到的3个QTLs，分别位于第2、第6和第10染色体上；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，不同的育性指标定位结果并不一致，这与花粉育性与自然小穗育性相关性分析结果是吻合的。其中以花粉育性为指标定位到的qRF10-1，结合标记检测结果可知，它就是Rf5，基因的效应与作用模式与Huang等的研究结果[8]一致；qRF2-1与刘航等报道的位于第2染色体上1个微效基因[9]的区间重叠，但基因作用方式有所不同。Huang等在第8染色体短臂上定位到1个主效基因Rf6，但是本研究中未能定位该基因，通过分析代换系测序信息及标记检测结果可知，在本研究所使用的CSSLs中Rf6所在的定位区段不存在相应代换系。相关研究结果为HL型不育细胞质新育性恢复基因的精细定位奠定了基础，有助于分子标记辅助选育HL型强恢复系。 参考文献：
[1]曾千春，周开达，朱祯，等. 中国水稻杂种优势利用现状[J]. 中国水稻科学，2000，14（4）：52-55.
[2]胡锦国，李泽炳. 四种水稻细胞质雄性不育系不育性遗传的初步研究[J]. 华中农学院学报，1985，4（2）：15-22.
[3]朱英国，徐树华. 水稻细胞质雄性不育系的比较研究[C]//杂交水稻国际学术讨论会论文集. 北京：学术期刊出版社，1988：338-344.
[4]梁世胡，李传国，伍应运，等. 红莲型雄性不育系粤泰A的特性鉴定与评价[J]. 作物品种资源，1998（4）：33-34.
[5]黄青阳，何予卿，景润春，等. 利用微卫星标记定位水稻红莲型细胞质雄性不育恢复基因[J]. 科学通报，1999，44（14）：1517-1520.
[6]Liu X Q，Xu X，Tan Y P，et al. Inheritance and molecular mapping of two fertility-restoring loci for Honglian gametophytic cytoplasmic male sterility in rice （Oryza sativa L.）[J]. Molecular Genetics and Genomics，2004，271（5）：586-594.
[7]Huang J Y，Hu J，Xu X，et al.. Fine mapping of the nuclear fertility restorer gene for HL cytoplasmic male sterility in rice[J]. Bot Bull Acad Sin，2003，44：285-289.
[8]Huang W，Hu J，Yu C，et al. Two non-allelic nuclear genes restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，124（5）：799-807.
[9]Hu J，Wang K，Huang W C，et al. The PPR protein Rf5 functions in HL-CMS fertility restoration via a Restoration of Fertility Complex containing a glycine-rich protein[J]. The Plant Cell，2012，24（1）：109-122.
[10]刘航，李丹，李绍波. 水稻红莲型CMS育性恢复QTL分析[J]. 武汉植物学研究，2005，23（2）：111-115.
[11]江玲，曹雅君，王春明，等. 利用RIL和CSSL群体检测水稻种子休眠性QTL[J]. 遗传学报，2003，30（5）：453-458.
[12]Wan J L，Zhai H Q，Wan J M，et al. Mapping QTL for traits associated with resistance to ferrous iron toxicity in rice （Oryza sativa L.），using japonica chromosome segment substitution lines[J]. Acta Genetica Sinica，2003，30（10）：893-898.
[13]何风华，席章营，曾瑞珍，等. 利用单片段代换系鉴定水稻株高及其构成因素的QTL[J]. 中国水稻科学，2005，19（5）：387-392.
[14]何风华，席章营，曾瑞珍，等. 利用单片段代换系定位水稻抽穗期QTL[J]. 中国农业科学，2005，38（8）：1505-1513.
[15]汪岳林. 利用单片段代换系定位水稻粒形及粒重QTL[D]. 福州：福建农林大学，2008.
[16]朱文银，杨德卫，林静，等. 利用染色体片段置换系定位水稻落粒性主效QTL[J]. 植物学通报，2008，25（4）：443-448.
[17]Rogers S O，Bendich A J. Extraction of DNA from plant tissue[J]. Plant Mol Biol Manual，1988，A6：1-10.
[18]徐建军，赵强，赵元凤，等. 利用重测序的水稻染色体片段代换系群体定位剑叶形态QTL[J]. 中国水稻科学，2011，25（5）：483-487.
[19]徐建军，赵强，汤在祥，等. 利用重测序的染色体片段代换系群体定位水稻粒型QTL[J]. 中国水稻科学，2011，25（4）：365-369.
[20]梁国华，周培南，杨华，等. 红莲型细胞质雄性不育恢复品种的筛选与分类[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2002，23（3）：41-45.
[21]张宏根，朱正斌，李波，等. 粳稻野败型细胞质雄性不育恢复系SWR78的恢复基因定位[J]. 中国水稻科学，2009，23（4）：377-382.
[22]梁国华，法锦宁，杨华，等. 红莲型细胞质雄性不育恢复系特青和珍汕97的恢复性遗传分析[J]. 江苏农业研究，2001，22（1）：7-11.
[23]黄青阳，何予卿，凌杏元，等. 3种水稻细胞质雄性不育系育性遗传的比较[J]. 中国农业科学，2000，33（3）：8-13.
[24]李绍清. 水稻红莲型细胞质雄性不育与育性恢复的分子机理[D]. 武汉：武汉大学，2004：64-109.
关键词：水稻；染色体片段代换系；恢复基因；基因定位
中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0064-04
收稿日期：2014-09-06
基金项目：国家“973”计划（编号：2011CB100101）；国家自然科学基金（编号：31071384）；江苏省高校自然科学研究项目（编号：13KJ13210008）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。
作者简介：张宏根（1981—），男，江苏南通人，博士，讲师，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[email protected]。
通信作者：汤述翥，教授，研究方向为作物遗传育种。E-mail：[email protected]。〖FL（2K2]目前，我国主要有9种胞质不育系类型用于生产，以野败（WA）型、红莲（HL）型和包台（BT）型为3种代表类型[1]。WA型不育系败育彻底、不育性稳定，在杂交籼稻生产利用中占据主导地位。近年来，HL型不育系在杂交籼稻中应用越来越广泛。杂交粳稻以利用BT型不育系为主，推广面积较小。要发展三系杂交稻，HL型杂交籼稻在生产上进一步的利用是一条重要途径。HL型不育系的恢复谱较广，但强恢复系很少，恢复系选育是限制HL型杂交籼稻进一步发展的重要因素。
质核互作雄性不育系的育性恢复是一复杂的遗传性状，并且环境对目标性状表型的影响较大。已有的研究表明，HL型不育系花粉表现为圆败，其育性恢复由主效基因与微效基因共同控制，且基因间可能存在互作[2-4]。目前，在籼稻核背景下，HL型不育系的主效育性恢复基因已被定位[5-9]，而微效基因的定位及基因效应研究相对较少[10]。因此，有效地开展HL型不育系微效基因的定位是选育HL型强恢复系的关键。
如何对微效恢复基因进行定位是育性恢复遗传研究的难点。染色体片段代换系与受体亲本的遗传背景基本一致，其与受体亲本之间以及系与系之间只有单个或少数的染色体片段的差异，因此其表现出的任何差异都可以直接与导入的片段或被替换的片段联系起来，是进行QTL分析及精细定位目标QTL的理想材料。目前，在水稻中已经有很多的学者利用染色体片段代换系来定位重要性状的QTL[11-16]。为定位HL型籼稻不育系的微效恢复基因，本试验在已有研究基础上以水稻9311为背景、日本晴为供体构建的一套染色体片段代换系为试验材料（利用高通量测序对每一个系基因组进行了重新测序，每个系中的代换片段长度及位置均准确获知），其中9311为HL型强恢复系，日本晴为HL型不育系的保持系，利用HL型籼稻不育系粤泰A与代换系测交，根据测交F1群体的花粉育性和小穗育性，结合Bin-map，采用多元回归的方法，对HL型不育系育性恢复的QTL进行分析，相关研究结果有助于HL型恢复系的选育。
1材料与方法
1.1供试材料
以粳稻测序品种日本晴为供体，籼稻测序品种9311为受体构建的128个染色体片段代换系（C1-C128），9311及HL型籼稻不育系粤泰A。
1.2群体配置
2010年正季在扬州种植亲本9311、HL型粤泰A及128个CSSLs，并配制F1：HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时实际收到119个测交F1组合的种子。
2011年春季在海南种植亲本9311、HL型粤泰A、128个CSSLs以及2010年正季获得的各F1，并继续配制HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时收获各F1种子。
2011年正季在扬州种植各亲本以及海南收获的各测交F1，每份材料各种植10苗。由于2011年海南春季温度偏低，配制的一些杂交组合未能收到杂交种，以及播种后一些杂交种没有成苗或后期因病枯死而缺苗，最终在配制测交群体中实际得到的测交系数目为116个。
1.3抽穗期调查
抽穗后及时记载抽穗期（50%的稻穗抽穗），并折算成播种至抽穗的天数表示。
1.4花粉育性鉴定与小穗育性鉴定
每天07：00—09：00，在田间每个测交系中选取4株单株，从每个始花植株上选取1个已抽出约1/3的主穗或较大分蘖穗。镜检时，在每个穗子的中上部枝梗中，选取3朵当天要开放的颖花，用1%I2-KI液染色、压片，在低倍显微镜下观察花粉育性。根据花粉粒的形状和对I2-KI液的染色反应，将花粉划分为典败、圆败、染败和正常4种类型。观察时，选择分布均匀、花粉数目超过100粒的视野，分别记录4类花粉的数目，计算4类花粉的百分率。
在抽穗期间，每天07：00—09：00，选取尚未开花的小穗套袋，自交袋大小为50 cm×20 cm，每系2个袋子，每个袋子2个小穗。20 d后，剔除折断或自交袋破损的穗子，调查群体单株的自交小穗育性。
待种子成熟后，每测交系选取4个主茎穗考察自然小穗育性。
1.5水稻DNA提取与分子标记分析
水稻基因组DNA的提取采用CTAB法[17]。普通PCR采用20 μL的反应体系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，03 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。富含GC含量模板的20 μL反应体系包括：DNA，2×GCI缓冲液10 μL，2.5 μmol/L的dNTP 3.2 μL，0.3 μmol/L的引物20 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s（温度因引物不同而异），72 ℃延伸50 s（不同长度的预期产物按 1 kb/min 调整延伸时间），扩增32个循环；72 ℃延伸10 min，18 ℃保温。PCR反应产物首先在3%琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在UVP Bioimaging Systems凝胶成像仪上成像。 SSR引物的信息来自于Gramene网站上（http：//www.gramene.org/）提供的SSR序列信息。DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、普通PCR试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司和上海英俊公司合成。
1.6基于Bin-map的QTL定位及数据分析
基于Bin-map的QTL定位，主要是采用多元回归的方法，利用SAS软件处理分析。每一个bin作为一个变量，利用方差分析精确估计误差，从而提高遗传分析效率，实现QTL的精确定位。回归模型如下：
yi=b0 ∑mk=1bkxik εi。
式中：yi为第i系的性状平均值，在进行QTL定位时，yi为表示第i染色体片段代换系的性状平均值；b0为模型均值；m是bin的总数；bk为第k 个bin的偏回归系数；xik为第i个系第k个bin基因型的指示变量，依bin的基因型来源不同而取值，来自供体的bin取-1，来自受体亲本的bin取1；εi为随机误差。其他数据在Excel 2003中处理。
2结果与分析
2.1代换系群体的评价
本研究利用的128个染色体片段代换系均为纯系，这些系包含来源于供体亲本日本晴的代换片段259个，平均每个系含有代换片段2.02个，每个系的代换片段数目在1～6个之间。徐建军等根据128个染色体片段代换系的测序物理图谱及代换片段的切割信息，绘制染色体单片段代换片系的Bin-map，总共包括401个Bins，定义为x1～x401[18-19]。Bin的物理长度介于13 213～10 654 035 bp，平均长度为 889 652 bp。该代换系各条染色体的覆盖率分别为91.5%、95.7%、94.8%、100.0%、99.4%、92.0%、95.3%、96.8%、96.4%、59.4%、95.4%和95.0%，平均覆盖率为93.3%。
2.2代换系及测交F1群体的抽穗期
2011年正季，记录各代换系及相应测交F1的抽穗期。9311的抽穗期为102 d，代换系中除C12和C54抽穗期比9311早18～20 d，C40、C114抽穗期比9311晚10～12 d外，其余代换系的抽穗期与9311基本一致；粤泰A与C40测交F1抽穗期较粤泰A与9311测交F1迟12 d，粤泰A与C114测交F1较9311的测交后代抽穗迟5 d，其余测交F1的抽穗期也与9311的测交后代基本一致（表1）。
表1CSSLs及9311对应测交F1抽穗期d
材料CSSLs抽穗期HL粤泰A/CSSLs抽穗期C1284—C5482—C40114117C114112110其余CSSLs99～103103～1079311102105
2.3亲本花粉育性及小穗育性鉴定
2011年正季，调查HL型粤泰A的花粉育性，HL型粤泰A的花粉以圆败为主，存在少量的浅染花粉，各代换系与对照9311花粉均正常。HL型粤泰A自然小穗育性为0，除抽穗较迟的C40、C114（这2个系在扬州不能正常成熟）外，其他代换系自然小穗育性均在85%以上（数据未列出），代换系与对照9311之间无显著差异。
2.4HL型粤泰A/CSSLs测交F1群体的育性表现
2010年正季配组得到的119份HL型粤泰A/CSSLs的种子带海南种植，并考察各测交F1的套袋小穗育性及自然小穗育性。结果表明，119个HL型粤泰A/CSSLs测交F1群体中套袋小穗育性平均为36.33%，自然小穗育性平均为6008%，HL型粤泰A/9311 F1自然小穗育性为60.37%，育性偏低。分析原因，2011年春季海南气温偏低，致使测交F1小穗育性整体偏低，因此本研究中，海南考种的数据未作分析。
2011年正季，调查HL型粤泰A与9311及128个CSSLs测交得到的116个测交F1的小穗育性及花粉育性，结果见表2。表2HL型粤泰A与9311及115个CSSLs测交F1的育性调查%
育性指标HL粤泰A/9311平均值±标准差变化区间HL粤泰A/CSSLs平均值±标准差变化区间花粉育性82.50±2.8980.00～85.0084.54±6.4957.50～95.00套袋小穗育性44.59±8.7636.92～56.4342.42±10.9618.51～73.43自然小穗育性87.12±3.3482.82～90.5785.82±7.3657.46～97.37
由表2可知，从不同育性指标考察的育性标准差来看，在花粉育性、套袋小穗育性、自然小穗育性这3个指标中，不论是9311还是代换系测交群体，均以套袋小穗育性的标准偏差最大，并且套袋小穗育性较自然小穗育性明显降低，说明袋内小气候对小穗育性影响很大（尽管本研究中采用较大的自交袋来增加袋内空间，改善自交袋内小气候以降低环境对小穗育性的影响），不能代表该测交群体育性的真实情况。
HL型粤泰A/9311 F1的自然小穗育性为87.12%，HL型粤泰A/CSSLs F1群体中测交系的自然小穗育性分布于5746%～97.37%，其中有73.21%的测交系自然小穗育性分布于80%～95%范围内，与对照相近（图1-a）。HL型粤泰A/9311 F1的花粉育性为82.50%，HL型粤泰A/CSSLs F1群体中测交系的花粉育性分布于57.50%～95.00%，其中有76.23%的测交系的花粉育性分布在80%～90%范围内，与对照接近（图1-b）。
2.5恢复基因Rf5、Rf6的分子标记检测及效应初步分析
已有研究表明，恢复系9311存在2对独立的HL型粤泰A的主效恢复基因Rf5与Rf6，分别位于第10、8染色体上[8-9]。本研究利用与Rf5紧密连锁的标记RM171、与Rf6紧密连锁的标记RM1019（标记在9311与日本晴之间具有多态，在9311与HL型粤泰A之间无多态）检测128个CSSLs及对应的各测交F1。结果表明，在128个代换系中，C31、C47、C49、C115、C116、C119等在标记RM171处表现为日本晴带型，其测交后代表现为双亲杂合带型，说明这6个代换系中带有Rf5的9311片段被日本晴替换，其他各代换系均表现为9311带型，说明其他各代换系均带有Rf5；在标记RM1019处，各代换系及测交后代均表现为9311带型，说明所用各代换系均带有Rf6，相关检测结果与CSSLs重测序一致。C31等6个代换系及9311测交F1的花粉育性及小穗育性见表3。 表36个Rf5被替换代换系及对照9311测交F1的育性
组合套袋小穗
小穗育性（%）自然小穗
小穗育性（%）花粉育性
（%）HL型粤泰A/C3123.99** 68.41* 87.50HL型粤泰A/C4735.2184.2680.00HL型粤泰A/C4934.8893.0770.00HL型粤泰A/C11518.73** 77.5665.00** HL型粤泰A/C11627.24** 84.0760.00** HL型粤泰A/C11937.4585.4357.50** 以上组合的平均值29.58*82.1369.00* HL型粤泰A/931144.5987.1282.50注：*表示与对照相比有显著变化（P<0.05）；**表示与对照相比有极显著变化（P<0.01）。
由表3可知，在HL型粤泰A与6个Rf5被替换代换系测交F1中，C31测交F1的自然小穗育性较对照显著降低，其他5个系的自然小穗育性与对照之间无显著差异，6个测交系平均值与对照之间无显著差异，表明在Rf6基因存在的前提下，Rf5基因的缺少对自然小穗育性影响较小；C31、C47及C49测交F1的花粉育性与对照之间无显著差异，C115、C116及C119测交F1的花粉育性较对照极显著降低。6个系平均花粉育性较对照显著降低，表明Rf5基因的缺少使花粉育性显著降低。但C31等6个代换系测交F1花粉育性不同，推测C31、C47及C49等代换系测交F1中部分正常花粉可能为染败花粉，由于染色较深，无法与正常花粉区分所致。6个测交系与对照的套袋小穗育性均偏低，与测交系群体育性的实际情况偏差较大。
2.6不同育性指标调查结果之间的相关性分析
对HL型粤泰A与CSSLs及对照9311测交得到的116个测交F1群体3个指标的育性进行相关性分析（表4）。由表4可知，花粉育性与自然小穗育性及套袋小穗育性之间相关性不显著，套袋小穗育性与自然小穗育性之间存在显著正相关，但相关系数也不高，仅为0.230。考虑到套袋结实率受套袋环境影响较大，因此本研究中以花粉育性与自然小穗育性来进行恢复基因的QTL分析。
表4不同指标育性相关分析
育性指标相关系数花粉育性套袋小穗育性自然小穗育性花粉育性1.000套袋小穗育性0.0831.000自然小穗育性0.0470.230*1.000
2.7育性恢复QTL定位
以花粉育性与自然小穗育性为指标，基于多元回归的方法，结合Bin-map，利用SAS软件对HL型粤泰A与CSSLs测交F1群体的育性恢复相关QTLs进行定位，各定位到3个育性恢复相关的QTLs（表5）。
由表5可知，以花粉育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第2、第6和第10染色体上，定位区段大小为379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，定位区段大小为455 070、525 340、247 226 bp。其中 qRF6-1 对应测交系父表5育性恢复QTL的定位
育性指标QTLs染色体
3讨论
水稻细胞质雄性不育系恢复基因的研究过程中，育性划分需采取一个适当的育性指标来进行。研究者一般采用花粉育性和小穗育性为育性指标进行育性划分，其中小穗育性包括自然小穗育性和套袋小穗育性，不同学者对采用何种指标所持观点不尽相同。HL型不育系粤泰A的花粉败育以圆败为主，但梁国华等以粤泰A与不同品种杂交，调查了F1的花粉育性和小穗育性，发现部分组合出现典败或染败花粉，与此类似的是本课题组转育的多个HL型粳稻不育系花粉以染败（染色较深）为主，说明不同核背景的HL型不育系花粉败育特征之间存在差异，因此在HL型粤泰A与CSSLs测交系群体中可能出现染败花粉[20]。镜检花粉育性时，测交系中圆败花粉比较容易鉴定，染败花粉与正常花粉则较难区分，这是花粉育性与小穗育性之间相关性不显著的重要原因之一，因此在本研究中不宜采用花粉育性这单一指标来分析。水稻是自花授粉作物，异花串粉对不育株和部分可育株的影响大于对可育株的影响，而套袋对可育株的影响较大[21]。本研究中测交系均为可育，套袋对植株的结实率影响较大，因此套袋小穗育性不宜作为育性鉴定指标。为求尽可能准确地反映群体中育性分离情况，本研究中采用花粉育性和自然小穗育性2类指标来定位育性恢复相关的QTLs。
关于HL型育性恢复基因遗传研究，朱英国等以HL型杂交水稻青优早为材料研究认为HL型不育系育性恢复除了受1对主效基因控制外，还受微效基因的影响[3]。梁国华等[22]、黄青阳等[23]研究认为HL型不育系丛广41A属于配子体不育类型，其育性恢复受显性单基因控制。关于恢复基因的定位，黄青阳等、Liu等和Huang等将HL型雄性不育的恢复基因Rf5定位在第10染色体上，定位区段比较一致[5-7]。Liu等在9311中定位到第10染色体上另一个恢复基因位点，命名为Rf6（t）[6]。李绍清在第10染色体分子标记RM184与RM6704-1之间定位到1个恢复基因，暂命名为Rf7[24]。Huang等定位到分别位于第10染色体上的主基因Rf5及第8染色体短臂上标记RM3710与RM22242之间的主基因Rf6[8]。Hu等将Rf5定位于第10染色体上标记RM6469与RM25661之间[9]。关于微效基因的定位，刘航等定位到第10染色体上1个主效QTL qRF-10-1，并在第1、第2、第10染色体上定位到3个微效QTL[10]。
本研究中，在HL粤泰A/CSSLs的测交群体中，对照HL粤泰A/9311可育花粉达80%～85%，与Huang等的鉴定结果[8]一致。本研究中共定位到与HL粤泰A育性恢复相关的6个QTLs，其中以花粉育性为指标定位到的3个QTLs，分别位于第2、第6和第10染色体上；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，不同的育性指标定位结果并不一致，这与花粉育性与自然小穗育性相关性分析结果是吻合的。其中以花粉育性为指标定位到的qRF10-1，结合标记检测结果可知，它就是Rf5，基因的效应与作用模式与Huang等的研究结果[8]一致；qRF2-1与刘航等报道的位于第2染色体上1个微效基因[9]的区间重叠，但基因作用方式有所不同。Huang等在第8染色体短臂上定位到1个主效基因Rf6，但是本研究中未能定位该基因，通过分析代换系测序信息及标记检测结果可知，在本研究所使用的CSSLs中Rf6所在的定位区段不存在相应代换系。相关研究结果为HL型不育细胞质新育性恢复基因的精细定位奠定了基础，有助于分子标记辅助选育HL型强恢复系。 参考文献：
[1]曾千春，周开达，朱祯，等. 中国水稻杂种优势利用现状[J]. 中国水稻科学，2000，14（4）：52-55.
[2]胡锦国，李泽炳. 四种水稻细胞质雄性不育系不育性遗传的初步研究[J]. 华中农学院学报，1985，4（2）：15-22.
[3]朱英国，徐树华. 水稻细胞质雄性不育系的比较研究[C]//杂交水稻国际学术讨论会论文集. 北京：学术期刊出版社，1988：338-344.
[4]梁世胡，李传国，伍应运，等. 红莲型雄性不育系粤泰A的特性鉴定与评价[J]. 作物品种资源，1998（4）：33-34.
[5]黄青阳，何予卿，景润春，等. 利用微卫星标记定位水稻红莲型细胞质雄性不育恢复基因[J]. 科学通报，1999，44（14）：1517-1520.
[6]Liu X Q，Xu X，Tan Y P，et al. Inheritance and molecular mapping of two fertility-restoring loci for Honglian gametophytic cytoplasmic male sterility in rice （Oryza sativa L.）[J]. Molecular Genetics and Genomics，2004，271（5）：586-594.
[7]Huang J Y，Hu J，Xu X，et al.. Fine mapping of the nuclear fertility restorer gene for HL cytoplasmic male sterility in rice[J]. Bot Bull Acad Sin，2003，44：285-289.
[8]Huang W，Hu J，Yu C，et al. Two non-allelic nuclear genes restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，124（5）：799-807.
[9]Hu J，Wang K，Huang W C，et al. The PPR protein Rf5 functions in HL-CMS fertility restoration via a Restoration of Fertility Complex containing a glycine-rich protein[J]. The Plant Cell，2012，24（1）：109-122.
[10]刘航，李丹，李绍波. 水稻红莲型CMS育性恢复QTL分析[J]. 武汉植物学研究，2005，23（2）：111-115.
[11]江玲，曹雅君，王春明，等. 利用RIL和CSSL群体检测水稻种子休眠性QTL[J]. 遗传学报，2003，30（5）：453-458.
[12]Wan J L，Zhai H Q，Wan J M，et al. Mapping QTL for traits associated with resistance to ferrous iron toxicity in rice （Oryza sativa L.），using japonica chromosome segment substitution lines[J]. Acta Genetica Sinica，2003，30（10）：893-898.
[13]何风华，席章营，曾瑞珍，等. 利用单片段代换系鉴定水稻株高及其构成因素的QTL[J]. 中国水稻科学，2005，19（5）：387-392.
[14]何风华，席章营，曾瑞珍，等. 利用单片段代换系定位水稻抽穗期QTL[J]. 中国农业科学，2005，38（8）：1505-1513.
[15]汪岳林. 利用单片段代换系定位水稻粒形及粒重QTL[D]. 福州：福建农林大学，2008.
[16]朱文银，杨德卫，林静，等. 利用染色体片段置换系定位水稻落粒性主效QTL[J]. 植物学通报，2008，25（4）：443-448.
[17]Rogers S O，Bendich A J. Extraction of DNA from plant tissue[J]. Plant Mol Biol Manual，1988，A6：1-10.
[18]徐建军，赵强，赵元凤，等. 利用重测序的水稻染色体片段代换系群体定位剑叶形态QTL[J]. 中国水稻科学，2011，25（5）：483-487.
[19]徐建军，赵强，汤在祥，等. 利用重测序的染色体片段代换系群体定位水稻粒型QTL[J]. 中国水稻科学，2011，25（4）：365-369.
[20]梁国华，周培南，杨华，等. 红莲型细胞质雄性不育恢复品种的筛选与分类[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2002，23（3）：41-45.
[21]张宏根，朱正斌，李波，等. 粳稻野败型细胞质雄性不育恢复系SWR78的恢复基因定位[J]. 中国水稻科学，2009，23（4）：377-382.
[22]梁国华，法锦宁，杨华，等. 红莲型细胞质雄性不育恢复系特青和珍汕97的恢复性遗传分析[J]. 江苏农业研究，2001，22（1）：7-11.
[23]黄青阳，何予卿，凌杏元，等. 3种水稻细胞质雄性不育系育性遗传的比较[J]. 中国农业科学，2000，33（3）：8-13.
[24]李绍清. 水稻红莲型细胞质雄性不育与育性恢复的分子机理[D]. 武汉：武汉大学，2004：64-109.