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摘要[目的]明确大黑鳃金龟幼虫消化酶和解毒相关基因在不同组织中的表达情况，筛选中肠特异表达基因。[方法]利用RTPCR方法对大黑鳃金龟幼虫中肠消化酶（胰蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶）基因和解毒相关基因（细胞色素P450、谷胱甘肽S转移酶、酯酶）在不同组织中的表达进行分析。[结果]所调查的大黑鳃金龟的6个谷胱甘肽S转移酶在中肠中都有表达，有3个基因在中肠中特异性表达。细胞色素P450家族中CYP 6A20和CYP 4C1 2个基因在中肠中特异表达，3个氨肽酶基因（APN1、APN2和AP2）只在中肠中表达。[结论] 大部分大黑鳃金龟的消化酶和解毒酶基因在中肠中表达量最高。
关键词大黑鳃金龟；中肠；基因；表达量
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-057-03
Tissue Expression of the Genes Related to Detoxification Enzymes and Digestive Proteinases of Holotrichia oblita
YAN Yajing1， HU Fei1， CHEN Haoliang2， WEI Zhaojun1* et al
（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009； 2. Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）
Abstract[Objective] To clarify of the tissue expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases and identify the specific expressed genes in the midgut from the larvae of Holotrichia oblita. [Method] The expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases in epidermis， head， midgut and fat body genes were analyzd by RTPCR. [Result] All the six GSTs genes were expressed in the midgut， and three of them were expressed in midgut specifically. As to the genes from the P450 family， CYP 6A20 and CYP 4C1 genes specifically expressed in midgut. Three aminopeptidase were specifically expressed in the midgut， including APN1， APN2 and AP2. [Conclusion] The expression of most of the genes related to the digestive proteinases and detoxification enzymes in midgut are higher than in other tissues.
Key wordsHolotrichia oblita； Midgut； Genes； Expression
大黑鳃金龟（Holotrichia oblita），幼虫俗称蛴螬，对花生等农作物以及林木幼苗和草坪危害严重，造成大面积减产[1]。到目前为止，关于大黑鳃金龟幼虫蛴螬的研究主要集中在发生规律和常规防治方面，对中肠和生物防治靶标分子生物学方面的研究很少[2]。由于大黑鳃金龟幼虫生活在土壤中，土壤病原微生物在其取食植物根部的同时也一同侵入到消化道中，因此幼虫的消化道环境很特殊[3]。中肠是消化道很重要的一部分，作为昆虫的第二大器官[4]，具有分泌消化酶、消化食物和吸收营养的功能；同时也是外源杀虫剂或天然毒素新陈代谢的地方[5]，从而成为病原微生物、农药、各种毒素的作用靶标。中肠消化涉及到很多酶，如丝氨酸蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等。丝氨酸蛋白酶广泛分布在所有动物和微生物中[6]。昆虫中肠也是外源物新陈代谢的场所，解毒酶可以增强害虫对农药的转化和降解作用，从而使毒性降低，或者通过阻隔作用来保护自己的靶标位点[7]。中肠中编码解毒酶的高表达基因与杀虫剂抗性有关，特别是谷胱甘肽S转移酶（Glutathione Stransferases，GSTs）、非专一性酯酶（ESTs）和细胞色素P450三大超基因家族[5]。
筆者在前期开展转录组分析的基础上，筛选了一些与中肠消化和解毒相关的基因，利用RTPCR方法对这些基因在不同组织中的表达模式进行研究，以期为寻找生物防治新靶标以及研究抗药性机理，进一步开展大黑鳃金龟的生物防治奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
大黑鳃金龟饲养条件：温度25～30 ℃，土壤含水量18%～20%。解剖大黑鳃金龟幼虫的中肠、表皮、头、脂肪体，整个操作在冰上进行，将解剖的组织分别装入1.5 ml离心管中，立即投入液氮冷冻，于-80 ℃保存备用。 1.2大黑鳃金龟幼虫组织总RNA的提取
提取总RNA用到的器具（匀浆器、移液器枪头、EP管等）要用DEPC水浸泡过夜，高温高压使DEPC水失活，置于烘箱中烘干备用，抽提RNA使用RNAiso Plus试剂盒，具体操作参照试剂盒说明进行。总RNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测。
1.3cDNA的合成
分别以表皮、头、中肠、脂肪体中的总RNA为模板，经反转录成cDNA，具体操作参照试剂盒说明进行。cDNA合成反应50 μl体系包括：PrimeScriptTM Buffer 10 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 2.5 μl，Oligo dT Primer（50 μmol/L）2.5 μl，Random 6 mers（100 μmol/L）10 μl，RNA 4 μg，加RNase Free ddH2O到50 μl。于37 ℃反应15 min，85 ℃ 5 s使酶失活。
1.4引物设计与合成
根据前期测定的转录组数据，设计大黑鳃金龟幼虫解毒酶和消化酶相关引物，引物序列见表1。引物设计后交上海生物工程公司合成。
1.5RTPCR
PCR反应体系25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μl，Primer 1（10 μmol/L） 1 μl，Primer 2（10 μmol/L）1 μl，模板 0.5 μl，Taq酶 0.2 μl，加ddH2O到 25 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
表1RTPCR引物序列
扩增基因引物引物序列（5′-3′）片段长度bp
2结果与分析
2.1GSTs基因在不同组织的表达
6种GSTs基因在大黑鳃金龟幼虫的中肠中都有表达，GST 12、GST2和GST sigma 3种基因只在中肠特异表达。GST Omega和GST Delta 2个基因在表皮、头、中肠、脂肪体中都表达。同时GST11基因在表皮、中肠和脂肪体中表达，在头中不表达（图1）。昆虫谷胱甘肽S转移酶在解毒代谢和杀虫剂抗性中起重要作用，中肠是昆虫解毒的重要器官，除中肠外，昆虫脂肪体也是解毒和储存营养物质的器官[8]。昆虫中GSTs在除中肠外的其他组织中表达，预示着这种酶可能参与昆虫其他的生理过程，是为了适应环境长期进化的结果。
图1大黑鳃金龟幼虫GSTs基因在不同组织中的表达
2.2细胞色素P450基因在不同组织的表达
所检测的11个P450家族基因中，仅CYP 4C和CYP 6A20 2个基因在中肠特异表达；CYP 6K1在中肠中不表达。CYP 9E2、CYP 6A8、CYP 6A23、CYP 6A17和CYP 6A1在4个组织中都有表达，CYP 9E2在中肠表达量较高，在其他组织表达量低，CYP 6A23和CYP 6A14基因片段在4个组织中表达量无明显差异（图2）。P450基因主要在中肠中高表达，其次在脂肪体中表达量也很高，只有少量 P450 基因在表皮和头中有较高水平的表达，这预示着P450可能参与了大黑鳃金龟幼虫解毒器官的解毒代谢。P450基因在表皮和头中的表达，预示着这几类P450可能还具有其他功能。
2.3酯酶在不同组织的表达
共检测了7个酯酶相关基因包括3个羧酸酯酶基因（carboxylesterase6，CarE61，CarE62，CarE63），2个酯酶esterase FE4（Est FE41，Est FE42）基因，1个酯酶esterase E4（Est E4）基因和1个酯酶esterase B1（Est B1）基因。Est FE41和Est FE42 2个基因只在中肠组织中特异表达，在表皮、头和脂肪体中不表达。Est E4、CarE62、CarE63在4个组织中都有表达，Est E4和CarE62基因片段在中肠中表达量最高（图3）。酯酶是除P450和GSTs外的第3个重要的昆虫解毒酶系，能够降解多种杀虫剂。羧酸酯酶是酯酶中重要的一类，也参与昆虫的解毒过程[9]。该试验中Est FE41和Est FE42在中肠中特异性表达，中肠是昆虫最重要的解毒器官之一，推测这2个基因与昆虫解毒相关。
图2大黑鳃金龟幼虫细胞色素P450相关基因在不同组织中的表达
图3大黑鳃金龟幼虫酯酶相关基因在不同组织中的表达
2.4消化酶相关基因在不同组织的表达
共检测了7个消化酶相关基因在大黑鳃金龟幼虫组织中的表达情况，分别为3个氨肽酶基因（APN1，APN2，AP2），2个胰蛋白酶基因（TPS1，TPS 3A1）和2个羧肽酶基因（CPs B，Zinc CPs A1）。APN1、APN2、AP2、TPS1、CPs B这5个基因片段在中肠中特异性表达，在表皮、头和脂肪体中都不表达（图4）。其中羧肽酶Zinc CPs A1基因在4个组织中都有表达，但在中肠中表达量最高。
图4大黑鳃金龟幼虫消化酶基因在不同组织中的表达
3结论与讨论
该研究采用RTPCR法对消化和解毒的功能基因在不同组织中的表达进行分析，结果发现，同一个基因在不同组织部位表达量不同，不同基因在同一组织中的表达量也有差异，大部分基因在中肠中条带最亮，说明这些基因在中肠中表达量最高，其中一些基因在中肠中特异性高表达。该研究主要对中肠解毒和消化相关的基因进行了表达分析，大部分解毒酶基因（如谷胱甘肽硫转移酶基因和P450基因）在中肠中高表达，其中一部分基因在脂肪体中表达量也很高，推测脂肪体和中肠是大黑鳃金龟的主要解毒器官；消化酶相关基因在中肠中表达量最高，这与中肠消化功能一致。
这些中肠中高表达的基因，需要今后采用更多的技术方法进一步探索這些基因在大黑鳃金龟体内的功能，对于昆虫抗药性的研究具有一定意义。
43卷16期
严雅静等大黑鳃金龟消化与解毒相关基因的组织表达研究
参考文献
[1] 周洪旭，李长友，李国勋.草坪害虫华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白HoPeritrophin3基因克隆及序列分析[J].草叶学报，2010，19（6）：147-153.
[2] 刘小民，张霞，李杰，等.花生蛴螬中肠组织cDNA文库的构建[J].花生学报，2010，39（1）：15-19.
[3] ZHOU H X，TAN X M，LI C Y，et al.The Peritrophic matrix of two grubs，Holotrichia oblita and H.parallela （Coleoptera：Melolonthidae）and the effects of Helicoverpa armigera（Lepidoptera：Noctuidae）granulovirus enhancin on its structure[J].Entomological News，2009，120（5）：509-517.
[4] HAKIM R S，BALDWIN K，SMAGGHE G.Regulation of midgut growth，development，and metamorphosis[J].Ann Rev Entomol，2010，55：593-608.
[5] SHEN G M，DOU W，HUANG Y，et al.In silico cloning and annotation of genes involved in the digestion，detoxification and RNA interference mechanism in the midgut of Bactrocera dorsalis [Hendel（Diptera：Tephritidae）[J].Insect Molecular Biology，2013，22（4）：354-365.
关键词大黑鳃金龟；中肠；基因；表达量
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-057-03
Tissue Expression of the Genes Related to Detoxification Enzymes and Digestive Proteinases of Holotrichia oblita
YAN Yajing1， HU Fei1， CHEN Haoliang2， WEI Zhaojun1* et al
（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009； 2. Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）
Abstract[Objective] To clarify of the tissue expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases and identify the specific expressed genes in the midgut from the larvae of Holotrichia oblita. [Method] The expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases in epidermis， head， midgut and fat body genes were analyzd by RTPCR. [Result] All the six GSTs genes were expressed in the midgut， and three of them were expressed in midgut specifically. As to the genes from the P450 family， CYP 6A20 and CYP 4C1 genes specifically expressed in midgut. Three aminopeptidase were specifically expressed in the midgut， including APN1， APN2 and AP2. [Conclusion] The expression of most of the genes related to the digestive proteinases and detoxification enzymes in midgut are higher than in other tissues.
Key wordsHolotrichia oblita； Midgut； Genes； Expression
大黑鳃金龟（Holotrichia oblita），幼虫俗称蛴螬，对花生等农作物以及林木幼苗和草坪危害严重，造成大面积减产[1]。到目前为止，关于大黑鳃金龟幼虫蛴螬的研究主要集中在发生规律和常规防治方面，对中肠和生物防治靶标分子生物学方面的研究很少[2]。由于大黑鳃金龟幼虫生活在土壤中，土壤病原微生物在其取食植物根部的同时也一同侵入到消化道中，因此幼虫的消化道环境很特殊[3]。中肠是消化道很重要的一部分，作为昆虫的第二大器官[4]，具有分泌消化酶、消化食物和吸收营养的功能；同时也是外源杀虫剂或天然毒素新陈代谢的地方[5]，从而成为病原微生物、农药、各种毒素的作用靶标。中肠消化涉及到很多酶，如丝氨酸蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等。丝氨酸蛋白酶广泛分布在所有动物和微生物中[6]。昆虫中肠也是外源物新陈代谢的场所，解毒酶可以增强害虫对农药的转化和降解作用，从而使毒性降低，或者通过阻隔作用来保护自己的靶标位点[7]。中肠中编码解毒酶的高表达基因与杀虫剂抗性有关，特别是谷胱甘肽S转移酶（Glutathione Stransferases，GSTs）、非专一性酯酶（ESTs）和细胞色素P450三大超基因家族[5]。
筆者在前期开展转录组分析的基础上，筛选了一些与中肠消化和解毒相关的基因，利用RTPCR方法对这些基因在不同组织中的表达模式进行研究，以期为寻找生物防治新靶标以及研究抗药性机理，进一步开展大黑鳃金龟的生物防治奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
大黑鳃金龟饲养条件：温度25～30 ℃，土壤含水量18%～20%。解剖大黑鳃金龟幼虫的中肠、表皮、头、脂肪体，整个操作在冰上进行，将解剖的组织分别装入1.5 ml离心管中，立即投入液氮冷冻，于-80 ℃保存备用。 1.2大黑鳃金龟幼虫组织总RNA的提取
提取总RNA用到的器具（匀浆器、移液器枪头、EP管等）要用DEPC水浸泡过夜，高温高压使DEPC水失活，置于烘箱中烘干备用，抽提RNA使用RNAiso Plus试剂盒，具体操作参照试剂盒说明进行。总RNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测。
1.3cDNA的合成
分别以表皮、头、中肠、脂肪体中的总RNA为模板，经反转录成cDNA，具体操作参照试剂盒说明进行。cDNA合成反应50 μl体系包括：PrimeScriptTM Buffer 10 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 2.5 μl，Oligo dT Primer（50 μmol/L）2.5 μl，Random 6 mers（100 μmol/L）10 μl，RNA 4 μg，加RNase Free ddH2O到50 μl。于37 ℃反应15 min，85 ℃ 5 s使酶失活。
1.4引物设计与合成
根据前期测定的转录组数据，设计大黑鳃金龟幼虫解毒酶和消化酶相关引物，引物序列见表1。引物设计后交上海生物工程公司合成。
1.5RTPCR
PCR反应体系25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μl，Primer 1（10 μmol/L） 1 μl，Primer 2（10 μmol/L）1 μl，模板 0.5 μl，Taq酶 0.2 μl，加ddH2O到 25 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
表1RTPCR引物序列
扩增基因引物引物序列（5′-3′）片段长度bp
2结果与分析
2.1GSTs基因在不同组织的表达
6种GSTs基因在大黑鳃金龟幼虫的中肠中都有表达，GST 12、GST2和GST sigma 3种基因只在中肠特异表达。GST Omega和GST Delta 2个基因在表皮、头、中肠、脂肪体中都表达。同时GST11基因在表皮、中肠和脂肪体中表达，在头中不表达（图1）。昆虫谷胱甘肽S转移酶在解毒代谢和杀虫剂抗性中起重要作用，中肠是昆虫解毒的重要器官，除中肠外，昆虫脂肪体也是解毒和储存营养物质的器官[8]。昆虫中GSTs在除中肠外的其他组织中表达，预示着这种酶可能参与昆虫其他的生理过程，是为了适应环境长期进化的结果。
图1大黑鳃金龟幼虫GSTs基因在不同组织中的表达
2.2细胞色素P450基因在不同组织的表达
所检测的11个P450家族基因中，仅CYP 4C和CYP 6A20 2个基因在中肠特异表达；CYP 6K1在中肠中不表达。CYP 9E2、CYP 6A8、CYP 6A23、CYP 6A17和CYP 6A1在4个组织中都有表达，CYP 9E2在中肠表达量较高，在其他组织表达量低，CYP 6A23和CYP 6A14基因片段在4个组织中表达量无明显差异（图2）。P450基因主要在中肠中高表达，其次在脂肪体中表达量也很高，只有少量 P450 基因在表皮和头中有较高水平的表达，这预示着P450可能参与了大黑鳃金龟幼虫解毒器官的解毒代谢。P450基因在表皮和头中的表达，预示着这几类P450可能还具有其他功能。
2.3酯酶在不同组织的表达
共检测了7个酯酶相关基因包括3个羧酸酯酶基因（carboxylesterase6，CarE61，CarE62，CarE63），2个酯酶esterase FE4（Est FE41，Est FE42）基因，1个酯酶esterase E4（Est E4）基因和1个酯酶esterase B1（Est B1）基因。Est FE41和Est FE42 2个基因只在中肠组织中特异表达，在表皮、头和脂肪体中不表达。Est E4、CarE62、CarE63在4个组织中都有表达，Est E4和CarE62基因片段在中肠中表达量最高（图3）。酯酶是除P450和GSTs外的第3个重要的昆虫解毒酶系，能够降解多种杀虫剂。羧酸酯酶是酯酶中重要的一类，也参与昆虫的解毒过程[9]。该试验中Est FE41和Est FE42在中肠中特异性表达，中肠是昆虫最重要的解毒器官之一，推测这2个基因与昆虫解毒相关。
图2大黑鳃金龟幼虫细胞色素P450相关基因在不同组织中的表达
图3大黑鳃金龟幼虫酯酶相关基因在不同组织中的表达
2.4消化酶相关基因在不同组织的表达
共检测了7个消化酶相关基因在大黑鳃金龟幼虫组织中的表达情况，分别为3个氨肽酶基因（APN1，APN2，AP2），2个胰蛋白酶基因（TPS1，TPS 3A1）和2个羧肽酶基因（CPs B，Zinc CPs A1）。APN1、APN2、AP2、TPS1、CPs B这5个基因片段在中肠中特异性表达，在表皮、头和脂肪体中都不表达（图4）。其中羧肽酶Zinc CPs A1基因在4个组织中都有表达，但在中肠中表达量最高。
图4大黑鳃金龟幼虫消化酶基因在不同组织中的表达
3结论与讨论
该研究采用RTPCR法对消化和解毒的功能基因在不同组织中的表达进行分析，结果发现，同一个基因在不同组织部位表达量不同，不同基因在同一组织中的表达量也有差异，大部分基因在中肠中条带最亮，说明这些基因在中肠中表达量最高，其中一些基因在中肠中特异性高表达。该研究主要对中肠解毒和消化相关的基因进行了表达分析，大部分解毒酶基因（如谷胱甘肽硫转移酶基因和P450基因）在中肠中高表达，其中一部分基因在脂肪体中表达量也很高，推测脂肪体和中肠是大黑鳃金龟的主要解毒器官；消化酶相关基因在中肠中表达量最高，这与中肠消化功能一致。
这些中肠中高表达的基因，需要今后采用更多的技术方法进一步探索這些基因在大黑鳃金龟体内的功能，对于昆虫抗药性的研究具有一定意义。
43卷16期
严雅静等大黑鳃金龟消化与解毒相关基因的组织表达研究
参考文献
[1] 周洪旭，李长友，李国勋.草坪害虫华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白HoPeritrophin3基因克隆及序列分析[J].草叶学报，2010，19（6）：147-153.
[2] 刘小民，张霞，李杰，等.花生蛴螬中肠组织cDNA文库的构建[J].花生学报，2010，39（1）：15-19.
[3] ZHOU H X，TAN X M，LI C Y，et al.The Peritrophic matrix of two grubs，Holotrichia oblita and H.parallela （Coleoptera：Melolonthidae）and the effects of Helicoverpa armigera（Lepidoptera：Noctuidae）granulovirus enhancin on its structure[J].Entomological News，2009，120（5）：509-517.
[4] HAKIM R S，BALDWIN K，SMAGGHE G.Regulation of midgut growth，development，and metamorphosis[J].Ann Rev Entomol，2010，55：593-608.
[5] SHEN G M，DOU W，HUANG Y，et al.In silico cloning and annotation of genes involved in the digestion，detoxification and RNA interference mechanism in the midgut of Bactrocera dorsalis [Hendel（Diptera：Tephritidae）[J].Insect Molecular Biology，2013，22（4）：354-365.