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摘要：目的 探讨竹节参总皂苷对四氯化碳（CCl4）诱导小鼠肝损伤的保护作用。方法 体外实验采用HepG2细胞株建立CCl4诱导肝细胞损伤模型。体内实验采用1%CCl4油剂处理Balb/c小鼠造成急性肝损伤模型，随机分为正常组、模型组、药物组，药物组灌胃20 mL/kg竹节参总皂苷，正常组和模型组灌胃等量无菌生理盐水，连续8 d。MTT法观察肝细胞存活状况，HE染色观察肝组织形态，RT-PCR检测转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和Toll样受体4（TLR4） mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组存活细胞明显减少（P<0.01）；与模型组比较，药物组存活细胞明显增多（P<0.01）。HE染色镜下观察，药物组小鼠肝组织损伤较模型组明显改善。RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组TGF-β、TNF-α和TLR4 mRNA表达水平明显升高；与模型组比较，药物组TGF-β、TLR4、TNF-α mRNA水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 竹节参总皂苷对CCl4诱导小鼠肝损伤具有保护作用。
关键词：急性肝损伤；竹节参总皂苷；HepG2细胞；小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0047-03
Abstract：Objective To discuss the protection mechanism of total saponins from Panax japonicus on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Methods HepG2 cells were used to establish CCl4-induced liver cell injury model in vitro experiments. Mouse model of acute liver injury was caused by 1% CCl4 oil on Balb/c. Mice were randomly divided into normal group， model group and medicine group. Mice in the medicine group were given a gavage with 20 mL/kg total saponins from Panax japonicus， while mice in the other two groups were given a gavage with the same amount of stroke-physiological saline solution. MTT method was used to detect the activity of hepatic cells. The pathological changes of mouse liver were examined by HE staining. RT-PCR was used to detect changes in the expression of transforming growth TGF-β， TNF-α， and TLR4 mRNA. Results Compared with normal group， less hepatic cells survived in model group （P<0.01）；compared with model group， more hepatic cells survived in medicine group （P<0.01）. HE staining showed that damages in liver tissues of medicine group significantly improved than those in model group. RT-PCR results showed that the levels of TGF-β， TNF-α， and expression of TLR4 mRNA increased more significantly than those in model group；the expression of TGF-β， TNF-α， and TLR4 mRNA in medicine group decreased more significantly than those in model group， with statistical significance （P<0.01）. Conclusion The total saponins from Panax japonicus has a protective effect on liver injury induced by carbon tetrachloride.
Key words：acute hepatic injury；total saponins from Panax japonicus；HepG2 cell；mice
竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicus C. A.Mey.的干燥根茎，味甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰功效，用于病后虚弱、劳咳咯血、咳嗽痰多、跌打损伤等。本研究采用四氯化碳（CCl4）诱导小鼠肝损伤模型，观察竹节参总皂苷提取物对模型小鼠的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
HepG2肝癌细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
1.2 动物
Balb/c小鼠36只，SPF级，体质量22～25 g，雌雄各半，购于湖北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（鄂）2008-0003。 1.3 药物及制备
竹节参购于湖北恩施竹节参种植基地，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室鉴定为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎。将竹节参粉碎成粗粉，取竹节参粗粉，按料液比1∶10加入60%乙醇溶液，先浸泡2 h，加热回流提取3次，合并滤液，得提取液，将提取液减压浓缩致无醇味，加适量水放置，离心，取上清液，用正丁醇萃取，减压浓缩得正丁醇浸膏。取浸膏溶于水，过D101大孔树脂，依次用水和30%、60%、90%乙醇冲洗。取60%洗脱部位，经硅胶柱层析分离，采用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，即得竹节参总皂苷。
1.4 主要试剂与仪器
CCl4、二甲基亚砜（DMSO），广东光华化学有限公司；反转录试剂盒，Thermo公司。梯度PCR仪（Germany）， ECLIPSE TE2000-S倒置荧光显微镜（日本尼康），Gel logic 200凝胶成像分析系统（美国柯达），DU730核酸蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。
2 实验方法
2.1 体外培养
培养肝癌细胞HepG2，采用胰酶消化传代，以每孔10 000个细胞铺96孔板，细胞贴壁生长状况较好时加药物预保护6 h，然后加CCl4 10 mmol/L，建立体外细胞损伤模型。因只有活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶才能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，24 h后加MTT 20 μL （5 mg/mL），4～6 h后弃掉废液，加DMSO溶解，在酶标仪490 nm波长处测OD值，确定细胞存活状况。计算细胞存活率（%）
[（药物组―模型组）/（正常组―模型组）×100%]。
2.2 体内实验
2.2.1 造模、分组与给药 取Balb/c小鼠36只，随机分为正常组、模型组、药物组（100 mg/kg），每组12只。于第2、5、8日参照文献[1]方法，按20 mL/kg腹腔注射1%CCl4油剂，造成小鼠急性肝损伤模型。药物组灌胃20 mL/kg竹节参总皂苷，连续8 d，正常组和模型组灌胃等量无菌生理盐水。
2.2.2 一般观察 第9日处死小鼠肉眼观察小鼠肝脏颜色、形态并拍照。
2.2.3 肝组织炎症相关因子基因水平检测 取小鼠肝组织400 mg匀浆，按Trizol试剂操作说明抽提肝组织RNA，测定其浓度，取总RNA 1 μg，在20 μL反转录反应体系合成cDNA，并进行PCR扩增。TNF-α：上游5’-TCAACCTCCTCTCTGCCGTC-3’，下游5’-GAGCAATGA CTCCAAAGTAGACCTG-3’；TGF-β：上游5’-CAACTTCTG TCTGGGACCCTG-3’，下游5’-ACTGCTCCACCTTGGGCTT-3’；TLR4：上游5’–AGACACTTTATTCAGAGCCGTTGG-3’，下游5’-TCCTCCCATTCCAGGTAGGTG-3’；GAPDH：上游5’-GGT TGTCTCCTGCGACTTCAA-3’，下游5’-CCACCCTGTTGCTGT AGCC-3’，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR参数：94 ℃预变性3 min，94 ℃、30 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，25～30个循环，最后72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统测定平均灰度值，以样品各基因的灰度值与其内参照GAPDH的比值代表其mRNA相对水平。
2.2.4 组织病理学观察 取小鼠肝脏小叶，切取组织块5 mm×2 mm，置于塑料储片夹中，10%福尔马林中固定24 h，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋处理后切成4 μm厚薄片，HE染色，于倒置荧光显微镜下观察肝脏切片的形态学变化。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料采用—x±s表示，多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 竹节参总皂苷对体外培养肝细胞HepG2存活率的影响
与正常组比较，模型组存活细胞明显减少（P<0.01）；与模型组比较，药物组存活细胞明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
4.2 肝脏大体观察
正常组小鼠肝脏质地柔软而有弹性，色泽黯红，有较好的光泽；模型组肝脏明显肿胀，质地较硬，弹性差，有多个乳白色脂肪点、瘀血点，呈花斑状；药物组颜色较模型组有明显改善，颜色黯红，无花斑，无瘀血点，质地较柔软，弹性较好。
5 讨论
从天然药物中提取和发现具有防治肝损伤作用的化合物是目前的研究热点。有研究发现，竹节参总皂苷对二甲苯所致的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用[2]；代氏等[3]研究发现，竹节参皂苷粗提物可干预脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞释放一氧化氮，提示其抗炎效果好。
急性CCl4肝损伤动物模型是一种经典的化学性肝损伤模型，在形态学上主要表现为以肝小叶中央静脉为中心的大量细胞坏死和出血，脂肪变性十分明显，系最为常用的急性肝炎模型，成功率高，实验方法简便，重复性好。本实验结果表明，药物组肝细胞受损程度明显减轻，肝组织坏死和炎症浸润减少，肝细胞存活率较模型组明显升高。
TNF-α是引起急慢性肝损伤的重要因素之一， TNF-α可直接损伤肝细胞或激活免疫细胞的间接损伤；CCl4致肝损伤后，肝脏对内毒素及炎性因子的损伤更敏感，从而使内毒素及炎性因子更易介导肝细胞功能受损而加重肝损伤[4-6]。本实验结果表明，模型组肝组织TLR4、TGF-β、TNF-α mRNA水平明显升高，药物组炎性因子表达显著降低，与正常组比较差异不明显。
综上，竹节参总皂苷可明显改善CCl4所致的肝损伤，进而起到保护肝脏作用。
参考文献：
[1] 汤超，汤文凡，刘朝奇.木瓜发酵液对小鼠四氯化碳诱发肝损伤的防护作用[J].食品科学，2013，34（13）：271-274.
[2] 袁丁，顿耀艳，张长城.竹节参总皂苷对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞增殖抑制作用的研究[J].时珍国医国药，2008，19（8）：1882-1883.
[3] 代艳文，袁丁，张海滨.不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21（1）：50-53.
[4] 孙设宗，赵杰，官守涛.山药多糖对CCl4肝损伤小鼠自由基、TNF-α含量的影响[J].山西医科大学学报，2011，42（6）：452-454.
[5] Oya S， Yokoyama Y， Kokuryo T， et al. Inhibition of Toll-like receptor 4 suppresses liver injury induced by biliary obstruction and subsequent intraportal lipopolysaccharide injection[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，306（3）：244-252.
[6] Xiao-Yan Jia， Qing-An Zhang， Zhi-Qi Zhang， et al. Hepato- protective effects of almond oil against carbon tetrachloride induced liver injury in rats[J]. Food Chemistry，2011，12（5）：673–678.
（收稿日期：2014-03-08；编辑：华强）
关键词：急性肝损伤；竹节参总皂苷；HepG2细胞；小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0047-03
Abstract：Objective To discuss the protection mechanism of total saponins from Panax japonicus on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Methods HepG2 cells were used to establish CCl4-induced liver cell injury model in vitro experiments. Mouse model of acute liver injury was caused by 1% CCl4 oil on Balb/c. Mice were randomly divided into normal group， model group and medicine group. Mice in the medicine group were given a gavage with 20 mL/kg total saponins from Panax japonicus， while mice in the other two groups were given a gavage with the same amount of stroke-physiological saline solution. MTT method was used to detect the activity of hepatic cells. The pathological changes of mouse liver were examined by HE staining. RT-PCR was used to detect changes in the expression of transforming growth TGF-β， TNF-α， and TLR4 mRNA. Results Compared with normal group， less hepatic cells survived in model group （P<0.01）；compared with model group， more hepatic cells survived in medicine group （P<0.01）. HE staining showed that damages in liver tissues of medicine group significantly improved than those in model group. RT-PCR results showed that the levels of TGF-β， TNF-α， and expression of TLR4 mRNA increased more significantly than those in model group；the expression of TGF-β， TNF-α， and TLR4 mRNA in medicine group decreased more significantly than those in model group， with statistical significance （P<0.01）. Conclusion The total saponins from Panax japonicus has a protective effect on liver injury induced by carbon tetrachloride.
Key words：acute hepatic injury；total saponins from Panax japonicus；HepG2 cell；mice
竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicus C. A.Mey.的干燥根茎，味甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰功效，用于病后虚弱、劳咳咯血、咳嗽痰多、跌打损伤等。本研究采用四氯化碳（CCl4）诱导小鼠肝损伤模型，观察竹节参总皂苷提取物对模型小鼠的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
HepG2肝癌细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
1.2 动物
Balb/c小鼠36只，SPF级，体质量22～25 g，雌雄各半，购于湖北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK（鄂）2008-0003。 1.3 药物及制备
竹节参购于湖北恩施竹节参种植基地，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室鉴定为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎。将竹节参粉碎成粗粉，取竹节参粗粉，按料液比1∶10加入60%乙醇溶液，先浸泡2 h，加热回流提取3次，合并滤液，得提取液，将提取液减压浓缩致无醇味，加适量水放置，离心，取上清液，用正丁醇萃取，减压浓缩得正丁醇浸膏。取浸膏溶于水，过D101大孔树脂，依次用水和30%、60%、90%乙醇冲洗。取60%洗脱部位，经硅胶柱层析分离，采用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，即得竹节参总皂苷。
1.4 主要试剂与仪器
CCl4、二甲基亚砜（DMSO），广东光华化学有限公司；反转录试剂盒，Thermo公司。梯度PCR仪（Germany）， ECLIPSE TE2000-S倒置荧光显微镜（日本尼康），Gel logic 200凝胶成像分析系统（美国柯达），DU730核酸蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。
2 实验方法
2.1 体外培养
培养肝癌细胞HepG2，采用胰酶消化传代，以每孔10 000个细胞铺96孔板，细胞贴壁生长状况较好时加药物预保护6 h，然后加CCl4 10 mmol/L，建立体外细胞损伤模型。因只有活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶才能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，24 h后加MTT 20 μL （5 mg/mL），4～6 h后弃掉废液，加DMSO溶解，在酶标仪490 nm波长处测OD值，确定细胞存活状况。计算细胞存活率（%）
[（药物组―模型组）/（正常组―模型组）×100%]。
2.2 体内实验
2.2.1 造模、分组与给药 取Balb/c小鼠36只，随机分为正常组、模型组、药物组（100 mg/kg），每组12只。于第2、5、8日参照文献[1]方法，按20 mL/kg腹腔注射1%CCl4油剂，造成小鼠急性肝损伤模型。药物组灌胃20 mL/kg竹节参总皂苷，连续8 d，正常组和模型组灌胃等量无菌生理盐水。
2.2.2 一般观察 第9日处死小鼠肉眼观察小鼠肝脏颜色、形态并拍照。
2.2.3 肝组织炎症相关因子基因水平检测 取小鼠肝组织400 mg匀浆，按Trizol试剂操作说明抽提肝组织RNA，测定其浓度，取总RNA 1 μg，在20 μL反转录反应体系合成cDNA，并进行PCR扩增。TNF-α：上游5’-TCAACCTCCTCTCTGCCGTC-3’，下游5’-GAGCAATGA CTCCAAAGTAGACCTG-3’；TGF-β：上游5’-CAACTTCTG TCTGGGACCCTG-3’，下游5’-ACTGCTCCACCTTGGGCTT-3’；TLR4：上游5’–AGACACTTTATTCAGAGCCGTTGG-3’，下游5’-TCCTCCCATTCCAGGTAGGTG-3’；GAPDH：上游5’-GGT TGTCTCCTGCGACTTCAA-3’，下游5’-CCACCCTGTTGCTGT AGCC-3’，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR参数：94 ℃预变性3 min，94 ℃、30 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，25～30个循环，最后72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统测定平均灰度值，以样品各基因的灰度值与其内参照GAPDH的比值代表其mRNA相对水平。
2.2.4 组织病理学观察 取小鼠肝脏小叶，切取组织块5 mm×2 mm，置于塑料储片夹中，10%福尔马林中固定24 h，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋处理后切成4 μm厚薄片，HE染色，于倒置荧光显微镜下观察肝脏切片的形态学变化。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料采用—x±s表示，多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 竹节参总皂苷对体外培养肝细胞HepG2存活率的影响
与正常组比较，模型组存活细胞明显减少（P<0.01）；与模型组比较，药物组存活细胞明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。
4.2 肝脏大体观察
正常组小鼠肝脏质地柔软而有弹性，色泽黯红，有较好的光泽；模型组肝脏明显肿胀，质地较硬，弹性差，有多个乳白色脂肪点、瘀血点，呈花斑状；药物组颜色较模型组有明显改善，颜色黯红，无花斑，无瘀血点，质地较柔软，弹性较好。
5 讨论
从天然药物中提取和发现具有防治肝损伤作用的化合物是目前的研究热点。有研究发现，竹节参总皂苷对二甲苯所致的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用[2]；代氏等[3]研究发现，竹节参皂苷粗提物可干预脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞释放一氧化氮，提示其抗炎效果好。
急性CCl4肝损伤动物模型是一种经典的化学性肝损伤模型，在形态学上主要表现为以肝小叶中央静脉为中心的大量细胞坏死和出血，脂肪变性十分明显，系最为常用的急性肝炎模型，成功率高，实验方法简便，重复性好。本实验结果表明，药物组肝细胞受损程度明显减轻，肝组织坏死和炎症浸润减少，肝细胞存活率较模型组明显升高。
TNF-α是引起急慢性肝损伤的重要因素之一， TNF-α可直接损伤肝细胞或激活免疫细胞的间接损伤；CCl4致肝损伤后，肝脏对内毒素及炎性因子的损伤更敏感，从而使内毒素及炎性因子更易介导肝细胞功能受损而加重肝损伤[4-6]。本实验结果表明，模型组肝组织TLR4、TGF-β、TNF-α mRNA水平明显升高，药物组炎性因子表达显著降低，与正常组比较差异不明显。
综上，竹节参总皂苷可明显改善CCl4所致的肝损伤，进而起到保护肝脏作用。
参考文献：
[1] 汤超，汤文凡，刘朝奇.木瓜发酵液对小鼠四氯化碳诱发肝损伤的防护作用[J].食品科学，2013，34（13）：271-274.
[2] 袁丁，顿耀艳，张长城.竹节参总皂苷对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞增殖抑制作用的研究[J].时珍国医国药，2008，19（8）：1882-1883.
[3] 代艳文，袁丁，张海滨.不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21（1）：50-53.
[4] 孙设宗，赵杰，官守涛.山药多糖对CCl4肝损伤小鼠自由基、TNF-α含量的影响[J].山西医科大学学报，2011，42（6）：452-454.
[5] Oya S， Yokoyama Y， Kokuryo T， et al. Inhibition of Toll-like receptor 4 suppresses liver injury induced by biliary obstruction and subsequent intraportal lipopolysaccharide injection[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，306（3）：244-252.
[6] Xiao-Yan Jia， Qing-An Zhang， Zhi-Qi Zhang， et al. Hepato- protective effects of almond oil against carbon tetrachloride induced liver injury in rats[J]. Food Chemistry，2011，12（5）：673–678.
（收稿日期：2014-03-08；编辑：华强）