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【摘 要】 目的：探索血浆游离DNA的含量在乳腺癌诊断中的应用价值。方法：收集62例乳腺癌、46例乳腺良性病变患者和52例健康自愿者的外周血。用微量基因组DNA提取试剂盒提取血浆DNA，用荧光染料试剂盒和Qubit? 2.0荧光仪测定血浆DNA含量。结果：乳腺癌患者血浆游离DNA含量明显高于正常者和良性肿瘤患者（P<0.001），良性肿瘤患者的血浆游离DNA水平与健康自愿者之间比较差异无显著性（P>0.05）。结论：血浆游离DNA含量有助于乳腺癌的辅助诊断和乳腺肿瘤的良恶性鉴别诊断。
【关键词】 乳腺癌 血浆 游离DNA
前言
乳腺癌是危害人类健康的最主要恶性肿瘤之一。为了有效地降低乳腺癌的死亡率和改善预后，迫切需要寻找一种早期诊断的方法。近年来，检测恶性肿瘤患者血浆中循环DNA用于基因诊断已经成为研究热点。在产前诊断方面，应用孕妇母血中游离DNA检测胎儿是否患有唐氏综合症已取得临床的认可，其结果的准确性显著高于传统的血清学筛查。[1]本研究对乳腺癌患者血浆循环DNA水平进行了研究，以探讨其在乳腺癌诊断中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 标本来源
本研究对象分为三组：①健康女性组：黄石爱康医院常规体检者52例，体检结果均未见恶性肿瘤、免疫相关疾病及急性感染，年龄23岁-72岁 。②乳腺良性疾病患者组：黄石爱康医院，乳腺良性疾病46例，年龄26岁-78岁。③乳腺癌患者组：在黄石爱康医院经手术切除病理证实为Ⅰ-Ⅳ期乳腺癌62例，年龄33岁-76岁。
1.2 试剂与仪器
DNA提取试剂盒选取德国QIAGEN公司 Blood mini kit，Qubit ? dsDNA HS分析试剂盒，美国invitrogen Qubit? 2.0荧光定量仪。
1.3 实验方法
1.3.1 标本处理 使用无菌真空EDTA 抗凝试管，收集乳腺癌患者术前三天清晨空腹外周血，静脉采血5ml，采集后将试管轻微颠倒混匀，避免剧烈震荡，，4℃条件下2000g离心10min， 离心后分装至1.5 ml EP 管中，再次离心12000r/min 15min后收集上清。
1.3.2 游离DNA的提取和纯化，定量 DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen）提取血浆DNA，方法按试剂盒中说明进行。
1.4 统计方法
所有计量资料采用（x±s表示，采用配对t检验。数据分析采用SSPS15.0统计分析软件，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DNA定量检测结果准确性分析 同一份血浆标本分成3份同时提取并进行定量分析，结果显示，总体批内变异系数（CV）为2.5%。
2.2 三组血浆游离DNA水平的检测 乳腺癌组血浆游离DNA水平显著高于乳腺癌良性病变组和健康对照组，相比较有统计学差异（P<0.001）；而良性病变组血浆游离DNA水平高于正常对照组，但差异无统计学意义（表1）。
2.3 ROC曲线分析
根据各组标本的真阳性率和假阳性率作图所得曲线，表示灵敏度和特异度之间的相互关系，乳腺癌组和健康对照组的ROC曲线中曲线下面积（AUC）为0.918，95%可信区间为0.877—0.959，表明血浆游离DNA定量分析对乳腺癌具有较好的诊断价值。62例乳腺癌患者血浆循环DNA测定结果，结合98例对照（52例正常对照组和46例良性病变组）数据，通过ROC曲线分析，以血浆循环DNA≤15.66ug/L作为诊断乳腺癌的临界值，其检测灵敏度为80.65%，特异度为84.69%，准确性为83.13%。
3 讨论
早在1947年Mandel等[2]就发现了人的血液循环中存在游离DNA。1977年leon等[3]发现肿瘤患者的血浆DNA含量明显高于正常人后，关于肿瘤患者循环DNA的研究成为人们关注的热点。无论是临床病理学指标还是血浆游离DNA含量均可反映乳腺癌的生物学特征，在预测乳腺癌预后方面均具有各自不同的优点，但仅仅选用一种预后指标却无法揭示出肿瘤的本质特征。虽然联合传统的CEA和CA153血清学指标，可以大大提升乳腺癌诊断的灵敏度和特异度，但血浆循环DNA检测方法与病理学手段相比，血浆是一种易得的标本，且无创伤性，诊断价值高。因此，通过血浆游离DNA检测诊断乳腺癌具有一定的优越性，值得临床应用。
参考文献
[1]冯萱，郝胜菊，等.孕妇血浆中胎儿游离DNA在唐氏综合征无创性产前诊断中的应用研究.检验医学与临床，2014，11：1-4
[2]Mandel P，Metais P. Les acides nucleiques du plasma eanguin chez I，homme[J].C R Acad Sci Paris.1948，142：241—243.
[3]Leon SA，Shapiro B ，Sklaroff DM， et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the efffect of therapy [J]. Cancer Res，1977，37： 646-650.
【关键词】 乳腺癌 血浆 游离DNA
前言
乳腺癌是危害人类健康的最主要恶性肿瘤之一。为了有效地降低乳腺癌的死亡率和改善预后，迫切需要寻找一种早期诊断的方法。近年来，检测恶性肿瘤患者血浆中循环DNA用于基因诊断已经成为研究热点。在产前诊断方面，应用孕妇母血中游离DNA检测胎儿是否患有唐氏综合症已取得临床的认可，其结果的准确性显著高于传统的血清学筛查。[1]本研究对乳腺癌患者血浆循环DNA水平进行了研究，以探讨其在乳腺癌诊断中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 标本来源
本研究对象分为三组：①健康女性组：黄石爱康医院常规体检者52例，体检结果均未见恶性肿瘤、免疫相关疾病及急性感染，年龄23岁-72岁 。②乳腺良性疾病患者组：黄石爱康医院，乳腺良性疾病46例，年龄26岁-78岁。③乳腺癌患者组：在黄石爱康医院经手术切除病理证实为Ⅰ-Ⅳ期乳腺癌62例，年龄33岁-76岁。
1.2 试剂与仪器
DNA提取试剂盒选取德国QIAGEN公司 Blood mini kit，Qubit ? dsDNA HS分析试剂盒，美国invitrogen Qubit? 2.0荧光定量仪。
1.3 实验方法
1.3.1 标本处理 使用无菌真空EDTA 抗凝试管，收集乳腺癌患者术前三天清晨空腹外周血，静脉采血5ml，采集后将试管轻微颠倒混匀，避免剧烈震荡，，4℃条件下2000g离心10min， 离心后分装至1.5 ml EP 管中，再次离心12000r/min 15min后收集上清。
1.3.2 游离DNA的提取和纯化，定量 DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen）提取血浆DNA，方法按试剂盒中说明进行。
1.4 统计方法
所有计量资料采用（x±s表示，采用配对t检验。数据分析采用SSPS15.0统计分析软件，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DNA定量检测结果准确性分析 同一份血浆标本分成3份同时提取并进行定量分析，结果显示，总体批内变异系数（CV）为2.5%。
2.2 三组血浆游离DNA水平的检测 乳腺癌组血浆游离DNA水平显著高于乳腺癌良性病变组和健康对照组，相比较有统计学差异（P<0.001）；而良性病变组血浆游离DNA水平高于正常对照组，但差异无统计学意义（表1）。
2.3 ROC曲线分析
根据各组标本的真阳性率和假阳性率作图所得曲线，表示灵敏度和特异度之间的相互关系，乳腺癌组和健康对照组的ROC曲线中曲线下面积（AUC）为0.918，95%可信区间为0.877—0.959，表明血浆游离DNA定量分析对乳腺癌具有较好的诊断价值。62例乳腺癌患者血浆循环DNA测定结果，结合98例对照（52例正常对照组和46例良性病变组）数据，通过ROC曲线分析，以血浆循环DNA≤15.66ug/L作为诊断乳腺癌的临界值，其检测灵敏度为80.65%，特异度为84.69%，准确性为83.13%。
3 讨论
早在1947年Mandel等[2]就发现了人的血液循环中存在游离DNA。1977年leon等[3]发现肿瘤患者的血浆DNA含量明显高于正常人后，关于肿瘤患者循环DNA的研究成为人们关注的热点。无论是临床病理学指标还是血浆游离DNA含量均可反映乳腺癌的生物学特征，在预测乳腺癌预后方面均具有各自不同的优点，但仅仅选用一种预后指标却无法揭示出肿瘤的本质特征。虽然联合传统的CEA和CA153血清学指标，可以大大提升乳腺癌诊断的灵敏度和特异度，但血浆循环DNA检测方法与病理学手段相比，血浆是一种易得的标本，且无创伤性，诊断价值高。因此，通过血浆游离DNA检测诊断乳腺癌具有一定的优越性，值得临床应用。
参考文献
[1]冯萱，郝胜菊，等.孕妇血浆中胎儿游离DNA在唐氏综合征无创性产前诊断中的应用研究.检验医学与临床，2014，11：1-4
[2]Mandel P，Metais P. Les acides nucleiques du plasma eanguin chez I，homme[J].C R Acad Sci Paris.1948，142：241—243.
[3]Leon SA，Shapiro B ，Sklaroff DM， et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the efffect of therapy [J]. Cancer Res，1977，37： 646-650.