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摘要：目的 观察红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度（MVD）的影响，为其开发提供实验依据。方法 SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、强的松组和红芪黄酮高、中、低剂量组，采用博莱霉素气管滴入方法建立肺纤维化模型，自造模后第2日，各治疗组分别给予相应剂量药物，按时间点连续灌胃治疗14 d和28 d，采用免疫组化法观察肺组织MVD。结果 模型组大鼠14 d肺组织内可见新生微血管显著增多，28 d有所减少。与空白组比较，模型组14、28 d MVD显著升高（P<0.01）。与模型组比较，红芪黄酮高剂量组14、28 d MVD明显降低（P<0.05）。红芪黄酮中剂量组表达介于高剂量组与低剂量组之间，红芪黄酮低剂量组表达与模型组相近。结论 红芪黄酮具有抑制肺纤维化大鼠微血管新生的作用，其作用与剂量相关。
关键词：肺纤维化；红芪黄酮；微血管密度；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0043-03
对肺血管的变化与肺纤维化的形成研究较少。本实验在前期研究[1-3]的基础上，筛选红芪有效部位，探讨其在不同时间点对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度（MVD）的影响，为其开发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0000614；动物实验设施使用证编号：SCXK（甘）2011-0001-0000362。
1.2 药物
药材选用甘肃地道药材红芪，甘肃中医学院科研实验中心药物制剂室提取、分离、鉴定（纯度>50%）。注射用盐酸平阳霉素（哈尔滨博莱霉素有限公司，批号120727），醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号110810）。
1.3 主要试剂与仪器
羧甲基纤维素钠（天津市大茂化学试剂厂，批号110311），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号101021），浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，K1266071），一抗CD34检测试剂盒（南京巴傲得生物技术有限公司，BS6481），二抗SP-9001生物素标记山羊抗兔IgG检测试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，12122A11）。CX21型生物显微镜（日本OLYMPUS）， MiE图像处理系统（山东易创电子有限公司）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组
144只大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表分为空白组、模型组、强的松组和红芪黄酮高（22.5 mg/kg）、中（15.0 mg/kg）、低（7.5 mg/kg）剂量组，每组24只，分别于第14、28日取材，每个时点12只，SPF常规饲养。
2.2 造模
适应性饲养动物3 d后，参照文献[1-3]方法复制肺纤维化模型。3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射，待大鼠夹尾无疼痛反应后，将其仰卧位固定于大鼠实验台上，剪去颈毛并常规碘伏消毒，切开颈部皮肤，逐层分离，暴露气管，用眼科弯剪经气管下方轻抬气管，用1 mL注射器经气管软骨环间隙向心端刺入，其他各组同法一次性气管内注入等体积博莱霉素生理盐水溶液5 mL/kg体质量，注入后立即将动物直立并左右旋转约1 min，使药物在肺内均匀分布。缝合切口，待动物自然清醒后，SPF常规饲养。
2.3 给药
造模后第2日起，每日上午灌胃1次，连续治疗14、28 d，持续到处死动物前1 d。红芪黄酮高、中、低剂量组分别给予22.5、15.0、7.5 mg/kg红芪黄酮，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。强的松组给予醋酸泼尼松片，给药剂量为3 mg/kg，临用前以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。模型组和空白组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液1 mL/100 g灌胃。
2.4 标本采集
各组大鼠于给药14 d、28 d采集标本并进行相关指标检测。末次给药后，各组大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射麻醉，剪开大鼠胸腔，小心分离肺组织，剪取右肺中叶组织制备病理切片，免疫组化法检测CD34表达。
2.5 电镜观察
CD34阳性反应物为棕色颗粒，分布在血管内皮细胞。微血管计数按Weidner方法进行：首先在低倍视野下（4物镜和10倍目镜）扫描，寻找组织内染色清晰并且微血管数目最密集的区域。然后在高倍视野下计数所有毛细血管及其小静脉的数目，任何呈棕黄色的阳性内皮细胞/内皮细胞簇只要与邻近血管、结缔组织成分清楚分开，即为一个能够计数的血管/微血管。每例标本分别记录5个400倍视野内的微血管数，最后取5个视野的平均值为MVD值。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
与空白组比较，模型组14、28 d的MVD显著升高（P<0.01）。强的松组大鼠肺组织MVD与同时点模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，红芪黄酮高剂量组14、28 d的MVD明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。红芪黄酮中剂量组表达介于高剂量组与强的松组之间；红芪黄酮低剂量组表达与模型组相近。见表1。空白组大鼠肺组织内可见少量微血管，形态结构规则，排列有序；模型组大鼠14 d肺组织内可见新生微血管显著增多，微血管形态结构不规则，排列紊乱，28 d有所减少；红芪黄酮高剂量组大鼠肺组织微血管形态结构略规则，部分轻度扩张。见图1。
5 讨论 肺纤维化在其形成过程中，必然伴有肺组织的损伤和修复，而在其修复过程中，微血管的新生和修复扮演着重要角色。早在Turner-warwickp对肺纤维化的研究报告中就已提出肺纤维化的形成过程中肺组织内新生微血管增多[4]。随后的研究显示，在肺纤维化过程中肺组织MVD呈动态分布，纤维化早期肺组织有明显微血管新生，随着时间推移，肺部纤维化的加重，MVD又进行性减少[5]。再次提示微血管新生在肺纤维化过程中有重要作用。
本实验采用免疫组化法测定肺纤维化MVD发现，模型组大鼠肺组织MVD与同期空白组大鼠比较显著升高（P<0.01），且模型组14 d肺MVD与28 d比较有减少趋势，说明14 d时微血管新生较28 d活跃。而对肺纤维化大鼠进行药物治疗后发现，各期强的松组大鼠肺组织MVD与同期模型组比较变化不显著。说明强的松对肺纤维化大鼠发生发展过程中的微血管新生无抑制作用。各期红芪黄酮高剂量组大鼠肺组织MVD与同期模型组比较明显减少（P<0.05，P<0.01），说明高剂量红芪黄酮对肺纤维化大鼠发生发展过程中的微血管新生具有抑制作用。各期红芪黄酮中、低剂量组与同期模型组比较变化均不显著。但从其趋势看，红芪黄酮中剂量组略好于强的松组及红芪黄酮低剂量组，这可能与红芪黄酮的使用剂量有关。由此可见，红芪黄酮对肺纤维化大鼠微血管新生具有抑制作用，可能与剂量相关。
参考文献：
[1] 刘永琦，李金田，李娟，等.黄芪对肺纤维化大鼠Th1/Th2型细胞因子平衡及自由基代谢的影响[J].免疫学杂志，2009，25（3）：290-292.
[2] 李金田，魏舒畅，刘永琦，等.黄芪多糖对肺纤维化大鼠肺上皮细胞超微结构及自由基代谢的影响[J].中华中医药杂志，2011，26（10）：2360- 2362.
[3] 李娟，张毅，刘永琦，等.黄芪多糖对肺纤维化大鼠细胞因子及肺组织病理结构的影响[J].时珍国医国药，2011，22（07）：1684-1685.
[4] 徐佳波，李燕芹.肺纤维化和新生血管[J].国外医学：内科学分册， 2006，33（3）：102-104.
[5] 徐佳波，李燕芹，刘斌，等.氧化苦参碱对肺纤维化大鼠肺微血管的影响[J].现代中西医结合杂志，2011，20（29）：3658-3662.
（收稿日期：2013-08-23，编辑：华强）
关键词：肺纤维化；红芪黄酮；微血管密度；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0043-03
对肺血管的变化与肺纤维化的形成研究较少。本实验在前期研究[1-3]的基础上，筛选红芪有效部位，探讨其在不同时间点对肺间质纤维化模型大鼠微血管密度（MVD）的影响，为其开发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，甘肃中医学院科研实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0000614；动物实验设施使用证编号：SCXK（甘）2011-0001-0000362。
1.2 药物
药材选用甘肃地道药材红芪，甘肃中医学院科研实验中心药物制剂室提取、分离、鉴定（纯度>50%）。注射用盐酸平阳霉素（哈尔滨博莱霉素有限公司，批号120727），醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号110810）。
1.3 主要试剂与仪器
羧甲基纤维素钠（天津市大茂化学试剂厂，批号110311），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号101021），浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，K1266071），一抗CD34检测试剂盒（南京巴傲得生物技术有限公司，BS6481），二抗SP-9001生物素标记山羊抗兔IgG检测试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，12122A11）。CX21型生物显微镜（日本OLYMPUS）， MiE图像处理系统（山东易创电子有限公司）；BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组
144只大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表分为空白组、模型组、强的松组和红芪黄酮高（22.5 mg/kg）、中（15.0 mg/kg）、低（7.5 mg/kg）剂量组，每组24只，分别于第14、28日取材，每个时点12只，SPF常规饲养。
2.2 造模
适应性饲养动物3 d后，参照文献[1-3]方法复制肺纤维化模型。3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射，待大鼠夹尾无疼痛反应后，将其仰卧位固定于大鼠实验台上，剪去颈毛并常规碘伏消毒，切开颈部皮肤，逐层分离，暴露气管，用眼科弯剪经气管下方轻抬气管，用1 mL注射器经气管软骨环间隙向心端刺入，其他各组同法一次性气管内注入等体积博莱霉素生理盐水溶液5 mL/kg体质量，注入后立即将动物直立并左右旋转约1 min，使药物在肺内均匀分布。缝合切口，待动物自然清醒后，SPF常规饲养。
2.3 给药
造模后第2日起，每日上午灌胃1次，连续治疗14、28 d，持续到处死动物前1 d。红芪黄酮高、中、低剂量组分别给予22.5、15.0、7.5 mg/kg红芪黄酮，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。强的松组给予醋酸泼尼松片，给药剂量为3 mg/kg，临用前以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。模型组和空白组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液1 mL/100 g灌胃。
2.4 标本采集
各组大鼠于给药14 d、28 d采集标本并进行相关指标检测。末次给药后，各组大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射麻醉，剪开大鼠胸腔，小心分离肺组织，剪取右肺中叶组织制备病理切片，免疫组化法检测CD34表达。
2.5 电镜观察
CD34阳性反应物为棕色颗粒，分布在血管内皮细胞。微血管计数按Weidner方法进行：首先在低倍视野下（4物镜和10倍目镜）扫描，寻找组织内染色清晰并且微血管数目最密集的区域。然后在高倍视野下计数所有毛细血管及其小静脉的数目，任何呈棕黄色的阳性内皮细胞/内皮细胞簇只要与邻近血管、结缔组织成分清楚分开，即为一个能够计数的血管/微血管。每例标本分别记录5个400倍视野内的微血管数，最后取5个视野的平均值为MVD值。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据用—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
与空白组比较，模型组14、28 d的MVD显著升高（P<0.01）。强的松组大鼠肺组织MVD与同时点模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，红芪黄酮高剂量组14、28 d的MVD明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。红芪黄酮中剂量组表达介于高剂量组与强的松组之间；红芪黄酮低剂量组表达与模型组相近。见表1。空白组大鼠肺组织内可见少量微血管，形态结构规则，排列有序；模型组大鼠14 d肺组织内可见新生微血管显著增多，微血管形态结构不规则，排列紊乱，28 d有所减少；红芪黄酮高剂量组大鼠肺组织微血管形态结构略规则，部分轻度扩张。见图1。
5 讨论 肺纤维化在其形成过程中，必然伴有肺组织的损伤和修复，而在其修复过程中，微血管的新生和修复扮演着重要角色。早在Turner-warwickp对肺纤维化的研究报告中就已提出肺纤维化的形成过程中肺组织内新生微血管增多[4]。随后的研究显示，在肺纤维化过程中肺组织MVD呈动态分布，纤维化早期肺组织有明显微血管新生，随着时间推移，肺部纤维化的加重，MVD又进行性减少[5]。再次提示微血管新生在肺纤维化过程中有重要作用。
本实验采用免疫组化法测定肺纤维化MVD发现，模型组大鼠肺组织MVD与同期空白组大鼠比较显著升高（P<0.01），且模型组14 d肺MVD与28 d比较有减少趋势，说明14 d时微血管新生较28 d活跃。而对肺纤维化大鼠进行药物治疗后发现，各期强的松组大鼠肺组织MVD与同期模型组比较变化不显著。说明强的松对肺纤维化大鼠发生发展过程中的微血管新生无抑制作用。各期红芪黄酮高剂量组大鼠肺组织MVD与同期模型组比较明显减少（P<0.05，P<0.01），说明高剂量红芪黄酮对肺纤维化大鼠发生发展过程中的微血管新生具有抑制作用。各期红芪黄酮中、低剂量组与同期模型组比较变化均不显著。但从其趋势看，红芪黄酮中剂量组略好于强的松组及红芪黄酮低剂量组，这可能与红芪黄酮的使用剂量有关。由此可见，红芪黄酮对肺纤维化大鼠微血管新生具有抑制作用，可能与剂量相关。
参考文献：
[1] 刘永琦，李金田，李娟，等.黄芪对肺纤维化大鼠Th1/Th2型细胞因子平衡及自由基代谢的影响[J].免疫学杂志，2009，25（3）：290-292.
[2] 李金田，魏舒畅，刘永琦，等.黄芪多糖对肺纤维化大鼠肺上皮细胞超微结构及自由基代谢的影响[J].中华中医药杂志，2011，26（10）：2360- 2362.
[3] 李娟，张毅，刘永琦，等.黄芪多糖对肺纤维化大鼠细胞因子及肺组织病理结构的影响[J].时珍国医国药，2011，22（07）：1684-1685.
[4] 徐佳波，李燕芹.肺纤维化和新生血管[J].国外医学：内科学分册， 2006，33（3）：102-104.
[5] 徐佳波，李燕芹，刘斌，等.氧化苦参碱对肺纤维化大鼠肺微血管的影响[J].现代中西医结合杂志，2011，20（29）：3658-3662.
（收稿日期：2013-08-23，编辑：华强）