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目的与意义: 西瓜枯萎病是由尖镰孢菌西瓜专化型侵染引起的维管束系统病害,是国内外西瓜生产上最严重的病害之一,已成为制约西瓜生产的主要障碍。而有关枯萎病菌侵染途径及植株抗病反应机制尚不明确。本项研究以期明确西瓜枯萎病菌在西瓜幼苗中的侵染过程,及其侵染后西瓜植株的组织结构变化与相关防卫基因的表达,进而探讨组织结构变化和防卫基因的表达与抗病性的关系。
材料与方法: (1)采用农杆菌介导的遗传转化方法将pGFP载体导入枯萎病菌基因组。(2)采用Leica CP SP2(Germany)激光共聚焦显微镜实时观察菌丝侵染过程。记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。(3)采用XL30 ESEM扫描电镜观察植株的组织结构。(4)采用ABI PRISM7300实时定量PCR仪进行Real-time PCR分析。采用2?ΔΔCT 法分析數据,确定基因的相对表达量。采用SAS 9.2(SAS Institute, Cary, NC)软件进行统计学分析。
结果与分析: (1)枯萎病菌接种后7 d,植株开始显症。叶片萎蔫,子叶枯萎下垂。接种后15 d,植株发病率达81.2%,大部分受侵染的植株基部变褐缢缩,有时有胶状物流出,发病植株猝倒,干枯死亡。接种后21 d,96%的植株完全枯萎死亡。(2)菌丝侵染途径观察结果表明,接种后4 h,孢子松散的附着在根表皮,12 h,个别孢子萌发产生菌丝,接种后2 d,可见菌丝大量紧密附着于根毛。接种后3 d,小分生孢子和成熟菌丝向皮层渗透。接种后6 d,分生孢子已经到达木质部导管。而受侵染植株从表型上看长势健壮、无病害症状。接种后7 d,菌丝进入到木质部导管。植株开始出现萎蔫症状。接种后10 d,植株出现明显病害症状,如基部变褐缢缩、发病植株猝倒等。此时,可见根和下胚轴木质部导管中遍布菌丝。接种后15 d,大部分侵染植株(81.2%)死亡。(3)组织结构观察结果表明,接种后2 d,进入腔内的菌丝周围出现胶状物质,这种物质在病原菌刚进入导管后不久便出现,是寄主对病原菌入侵的快速反应。随着菌丝的进一步侵染,接种后5 d,受侵染组织周围、甚至整个维管腔周围的薄壁细胞细胞壁出现加厚现象,对菌丝的横向扩散起到了阻碍作用。接种后7 d,在木质部导管内部出现了侵填体。侵填体形成初期,在管壁上首先看到多个小的突起,这些小突起逐渐长大,至接种后11 d,可见导管被一个或多个侵填体所堵塞。同时,接种后7 d,薄壁细胞细胞壁慢慢溶解,并导致空洞形成。当维管组织被胶状物大面积覆盖,且被侵填体严重堵塞时,被侵染的维管组织会启动脱落程序。接种后11 d,被破坏的组织首先从管壁上分离,随后脱落,接种后15 d,根部维管系统中空。(4)防御基因表达分析结果表明,枯萎病菌侵染显著诱导了ClPDF2.1基因的表达。侵染后2 d和7 d的表达量分别较对照升高了1.5倍和1.7倍。与ClPDF2.1基因不同的是,侵染后2 d,ClPDF2.4基因的表达较对照升高2.1倍,随后表达量急剧下降,侵染后7 d,表达量仅比对照提高1.1倍。PAL基因的表达随枯萎病菌侵染而逐渐增高。侵染后2 d,PAL基因的表达量为对照的1.4倍,至实验结束,其表达量为对照的1.5倍。CHI基因的诱导表达模式与PAL基因相同,但基因表达量要高于PAL基因。APX基因的表达模式与ClPDF2.4基因相同,侵染后2 d表达量升高,随后下降。枯萎病菌侵染没有诱导PPO基因的表达,在整个实验期没有检测到表达量的差异。
结
材料与方法: (1)采用农杆菌介导的遗传转化方法将pGFP载体导入枯萎病菌基因组。(2)采用Leica CP SP2(Germany)激光共聚焦显微镜实时观察菌丝侵染过程。记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。(3)采用XL30 ESEM扫描电镜观察植株的组织结构。(4)采用ABI PRISM7300实时定量PCR仪进行Real-time PCR分析。采用2?ΔΔCT 法分析數据,确定基因的相对表达量。采用SAS 9.2(SAS Institute, Cary, NC)软件进行统计学分析。
结果与分析: (1)枯萎病菌接种后7 d,植株开始显症。叶片萎蔫,子叶枯萎下垂。接种后15 d,植株发病率达81.2%,大部分受侵染的植株基部变褐缢缩,有时有胶状物流出,发病植株猝倒,干枯死亡。接种后21 d,96%的植株完全枯萎死亡。(2)菌丝侵染途径观察结果表明,接种后4 h,孢子松散的附着在根表皮,12 h,个别孢子萌发产生菌丝,接种后2 d,可见菌丝大量紧密附着于根毛。接种后3 d,小分生孢子和成熟菌丝向皮层渗透。接种后6 d,分生孢子已经到达木质部导管。而受侵染植株从表型上看长势健壮、无病害症状。接种后7 d,菌丝进入到木质部导管。植株开始出现萎蔫症状。接种后10 d,植株出现明显病害症状,如基部变褐缢缩、发病植株猝倒等。此时,可见根和下胚轴木质部导管中遍布菌丝。接种后15 d,大部分侵染植株(81.2%)死亡。(3)组织结构观察结果表明,接种后2 d,进入腔内的菌丝周围出现胶状物质,这种物质在病原菌刚进入导管后不久便出现,是寄主对病原菌入侵的快速反应。随着菌丝的进一步侵染,接种后5 d,受侵染组织周围、甚至整个维管腔周围的薄壁细胞细胞壁出现加厚现象,对菌丝的横向扩散起到了阻碍作用。接种后7 d,在木质部导管内部出现了侵填体。侵填体形成初期,在管壁上首先看到多个小的突起,这些小突起逐渐长大,至接种后11 d,可见导管被一个或多个侵填体所堵塞。同时,接种后7 d,薄壁细胞细胞壁慢慢溶解,并导致空洞形成。当维管组织被胶状物大面积覆盖,且被侵填体严重堵塞时,被侵染的维管组织会启动脱落程序。接种后11 d,被破坏的组织首先从管壁上分离,随后脱落,接种后15 d,根部维管系统中空。(4)防御基因表达分析结果表明,枯萎病菌侵染显著诱导了ClPDF2.1基因的表达。侵染后2 d和7 d的表达量分别较对照升高了1.5倍和1.7倍。与ClPDF2.1基因不同的是,侵染后2 d,ClPDF2.4基因的表达较对照升高2.1倍,随后表达量急剧下降,侵染后7 d,表达量仅比对照提高1.1倍。PAL基因的表达随枯萎病菌侵染而逐渐增高。侵染后2 d,PAL基因的表达量为对照的1.4倍,至实验结束,其表达量为对照的1.5倍。CHI基因的诱导表达模式与PAL基因相同,但基因表达量要高于PAL基因。APX基因的表达模式与ClPDF2.4基因相同,侵染后2 d表达量升高,随后下降。枯萎病菌侵染没有诱导PPO基因的表达,在整个实验期没有检测到表达量的差异。
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