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【摘 要】目的：研究健脾渗湿方对高尿酸血症大鼠模型尿酸盐转运蛋白OAT3表达的影响，揭示其治疗高尿酸血症的作用机制。方法：40只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、苯溴马隆组和健脾渗湿方组，每组10只。采用酵母饲料加腺嘌呤诱导高尿酸血症大鼠模型，灌胃给药14 d后，检测高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤，免疫组化法检测尿酸盐转运蛋白OAT3的表达情况。结果：健脾渗湿方组高尿酸血症模型大鼠肾脏的损伤程度显著改善，且对尿酸盐转运蛋白OAT3具有显著的上调作用。结论：上调尿酸盐转运蛋白OAT3，可能是健脾渗湿法治疗高尿酸血症的作用机制之一。
【关键词】 痛风；高尿酸血症；OAT3；健脾渗湿方；大鼠
健脾渗湿方（七君颗粒）临床主要用于痛风及高尿酸血症（脾虚湿阻型）的治疗，在本院使用多年，临床疗效确切。前期实验及临床研究表明，本方具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促进尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，能明显改善痛风及高尿酸血症的临床症状，有效率占90.0%[1-5]。
本研究旨在以尿酸盐转运蛋白OAT3为切入点，探讨健脾渗湿之法治疗高尿酸血症（脾虚湿阻型）的作用机制。
1 实验材料
1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，7～8周龄，体质量（200±20）g，购自昆明医科大学实验中心。动物合格证编号：SCXK（滇）2011-0004。饲养于云南省中医医院中心实验室动物实验室IVC屏障系统，至少饲养1周后使用。温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均由动物自由摄取，所有笼具、饲料和饮水均经过121 ℃蒸汽灭菌处理。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。
1.2 实验药物与试剂 健脾渗湿方浸膏每克含生药量为4.74 g，由云南省中医医院制剂中心提供；酵母干粉，美国Amresco公司产品；腺嘌呤，美国Amresco公司产品；OAT3多克隆抗体购自BEIJING BOISYNTHESIS BIOTECHNOLOGY Co.LTD；二抗（PV-6001）及DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司产品。
1.3 实验仪器 电子秤，上海友声衡器有限公司产品；分析天平，METTLER TOLEDO公司产品；玻璃毛细管，四川成都华西医科大学仪器厂生产；Biofuge Primo R离心机，德国Thermo Scientific Heraeus公司产品。RM2235石蜡切片机、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜和ASP300S全自动组织脱水机均购自德国莱卡仪器有限公司。
2 方 法
2.1 酵母颗粒饲料的制备 酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中，充分混匀，重新压粒成型，控制其在饲料中的质量分数为10%。
2.2 实验分组、高尿酸血症模型的诱导及给药 40只SD大鼠自由饮水进食1周后开始实验。实验前通过眼眶后静脉丛采血，全自动生化仪上检测尿酸水平，选取尿酸水平在20～50 μmol·L-1
范围的大鼠为实验动物，依据尿酸水平分为正常对照组、模型对照组、苯溴马隆阳性药组（简称阳性药组）、健脾渗湿方给药组（简称健脾渗湿方组），每组10只，雌雄各半。高尿酸血症大鼠模型的诱导参照文献[6]制备，模型对照组、阳性药组、健脾渗湿方组均给予质量浓度10%酵母饲料饲喂，并于每天上午10：00灌胃腺嘌呤
100 mg·kg-1，每日1次，连续14 d，以制备高尿酸血症模型。正常对照组饲予普通大鼠颗粒饲料，并给予同体积的蒸馏水。阳性药组和健脾渗湿方组分别给予苯溴马隆20 mg·kg-1和健脾渗湿方浸膏10.05 g·kg-1（相当于生药49.95g·kg-1）。以上均在模型制备的第1天开始给药，每天1次。给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。
2.3 指标检测
2.3.1 HE染色 小鼠处死后，取其右肾，于质量浓度10%中性缓冲福尔马林进行固定，之后脱水和进行石蜡包埋，切片（厚度4 mm），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后显微镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测尿酸盐转运蛋白OAT3的表达情况 石蜡切片脱蜡至水，用PBS冲洗3次，根据不同抗体要求进行相应抗原修复，质量浓度3%的H2O2室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，再用PBS冲洗3次；抗原高压修复；加入羊血清，孵育10 min，尔后倾去血清，滴加一抗工作液，37 ℃
孵育3 h；滴加二抗工作液，室温孵育60 min；DAB染色；苏木精复染细胞核；封片。以PBS代替一抗作阴性对照。
2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。方差齐，均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析；方差不齐，均值间差异比较采用校正t检验。数据统计均以表示。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 健脾渗湿方对高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤的影响 大鼠肾脏切片HE染色结果光镜下可见，正常对照组大鼠肾脏结构正常，无尿酸盐结晶，无明显异常，见图1（1）。模型对照组大鼠肾脏结构改变，大量尿酸盐结晶阻塞肾小球毛细血管腔，致肾小球正常结构消失，肾小管腔扩大，部分轻度萎缩，肾近曲小管腔、间质部分及血管较多棕褐色尿酸盐结晶沉积，并有大量炎性细胞浸润，见图1（2）。阳性药组和健脾渗湿方组大鼠肾小体结构稍清晰，肾小管上皮细胞稍浊肿变性，肾小管腔部分扩张，小管腔及间质部位尿酸盐结晶沉积减少，炎性细胞浸润减少，见图1（3、4）。
3.2 健脾渗湿方对高尿酸血症大鼠OAT3蛋白表达的影响 免疫组化研究结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾脏中OAT3蛋白表达水平有所降低；与模型对照组比较，阳性药组和健脾渗湿方组OAT3蛋白表达水平显著上调。见图2。 4 讨 论
痛风是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，其临床特点为高尿酸血症（Hyperuricemia，HUM）及由此引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。中医学认为痛风属“痹证”范畴，而高尿酸血症属“浊毒”。痛风及高尿酸血症主要病因在于先天禀赋不足，多为脾胃虚损，复加感受外邪，或饮食不节，酗酒或多进肥厚之品，而使脾失健运，运化失常，升降失调；或脏腑功能减退，气化不利，气血失调等，致使水液代谢输布运化排泄失常，津液不归正化为湿、为痰、为瘀，使气血运行不畅而成。间歇期主张重用调补脾肾之品，绝毒内生之源[7-8]。可见，脾虚湿盛，痰瘀痹阻是本病病机的关键所在。据此，我们以“健脾渗湿，化痰通络”为法，由党参、茯苓、白术、三七、白芥子、金钱草等10余味中药组方制成颗粒剂（七君颗粒），临床主要用于痛风及高尿酸血症（脾虚湿阻型）治疗。健脾渗湿方具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促进尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，对高尿酸血症大鼠模型肾脏功能损伤具有显著的保护作用[1-5]。为研究该方对降低痛风及高尿酸血症血尿酸的作用机制，本研究旨在以尿酸盐转运蛋白hOAT3为切入点，探讨健脾渗湿之法治疗高尿酸血症（脾虚湿阻型）的作用机制。
肾尿酸排泄由肾小球滤过、肾小管重吸收（S1段）、分泌（S2段）及分泌后重吸收（S3段）组成，最终经尿排泄的尿酸为滤过尿酸的10%[9-10]。
由于尿酸几乎全部被滤过，干预肾小管分泌和重吸收过程可影响尿酸排泄。尿酸为极性分子，不能自由通过细胞膜。其在肾近曲小管的重吸收和分泌过程有赖于离子通道。近年来运用生理、分子生物和细胞生物等多种技术研究肾脏尿酸盐的转运，目前已明确有4种尿酸盐转运蛋白（位于肾小管的顶膜和基底膜）参与人近曲肾小管对尿酸盐的转运，即生电型的尿酸盐转运体hUAT（human urate transporter）、电中性的尿酸盐/阴离子交换体hURAT1（human urateanion exchanger1）和有机阴离子转运体hOAT1和hOAT3（human organic anion transporter）。hOAT1和hOAT3参与管周细胞对尿酸盐的摄取，有利于尿酸盐的分泌，在管周间隙摄取尿酸盐人肾小管上皮细胞起重要作用，其表达及功能缺陷可能为原发性高尿酸血症重要的发病机制之一[11-13]。
肾脏切片HE染色和免疫组化结果显示，健脾渗湿方药物干预可显著改善高尿酸血症组模型大鼠肾脏的病理损伤，上调尿酸盐转运蛋白OAT3蛋白表达。提示健脾渗湿方可能通过调控尿酸盐转运蛋白OAT3，
促进尿酸盐的分泌，从而降低机体的尿酸水平。
5 参考文献
[1] 胡美兰.健脾化痰通络渗湿法治疗高尿酸血症40例疗效观察[J].云南中医中药杂志，2006，27（3）：15-16.
[2] 彭江云，李兆福，刘路明，等.七君颗粒对高尿酸血症大鼠的影响[J].光明中医，2008，23（12）：1900-1902.
[3] 彭江云，李兆福，刘路明，等.七君颗粒治疗高尿酸血症的临床观察[J].中国中医风湿病学杂志，2005，8（3-4）：129-131.
[4] 杨会军，彭江云，万春平，等.健脾渗湿方对高尿酸血症模型大鼠的防治作用及机制初步研究[J].云南中医学院学报，2013，36（1）：1-4.
[5] 杨会军，彭江云，李兆福，等.健脾渗湿方对高尿酸血症模型大鼠的防治作用的研究[J].风湿病与关节炎，2013，2（2）：19-22.
[6] 邢儒伶，孟冬梅，任伟，等.建立痛风性肾病并发慢性肾功能衰竭动物模型方法的探讨[J].中国中西医结合杂志，2011，31（10）：1409-1413.
[7] 张永生.姜良铎教授治疗痛风经验[J].北京中医药大学学报，2002，25（2）：61-62.
[8] 朱萱萱，陈震，纪伟，等.热痹消治疗急性痛风性关节炎的实验研究[J].中国药品标准，2002，3（1）：57-60.
[9] Hediger MA，Johnson RJ，Miyazaki H，et al.Molecular physiology of urate transport [J].Physiology（Bethesda），2005，20：125-133.
[10] Anzai N，Enomoto A，Endou H.Renal uratehandling：clinical relevance of recent advances[J].Curt Rheumatol Rep，2005，7（3）：227-234.
[11] 李成乾，赵家军，王霞，等.VLDL对人尿酸盐转运蛋白hOAT1基因表达的影响[J].山东大学学报：医学版，2008，46（6）：579-582.
[12] 王静，苗志敏，李长贵，等.高尿酸血症大鼠肾小管上皮细胞OAT3表达的变化[J].青岛大学医学院学报，2008，44（4）：298-300.
[13] Erdrnan AR，Mangravte LM，Urban TJ，et a1.The human organic anion transporter 3 （OAT3，SLC 22A8）：genetic variation and functional genomics[J].Am J Physiol Renal Physiol，2006，290（4）：905-912.
【关键词】 痛风；高尿酸血症；OAT3；健脾渗湿方；大鼠
健脾渗湿方（七君颗粒）临床主要用于痛风及高尿酸血症（脾虚湿阻型）的治疗，在本院使用多年，临床疗效确切。前期实验及临床研究表明，本方具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促进尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，能明显改善痛风及高尿酸血症的临床症状，有效率占90.0%[1-5]。
本研究旨在以尿酸盐转运蛋白OAT3为切入点，探讨健脾渗湿之法治疗高尿酸血症（脾虚湿阻型）的作用机制。
1 实验材料
1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，7～8周龄，体质量（200±20）g，购自昆明医科大学实验中心。动物合格证编号：SCXK（滇）2011-0004。饲养于云南省中医医院中心实验室动物实验室IVC屏障系统，至少饲养1周后使用。温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均由动物自由摄取，所有笼具、饲料和饮水均经过121 ℃蒸汽灭菌处理。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。
1.2 实验药物与试剂 健脾渗湿方浸膏每克含生药量为4.74 g，由云南省中医医院制剂中心提供；酵母干粉，美国Amresco公司产品；腺嘌呤，美国Amresco公司产品；OAT3多克隆抗体购自BEIJING BOISYNTHESIS BIOTECHNOLOGY Co.LTD；二抗（PV-6001）及DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司产品。
1.3 实验仪器 电子秤，上海友声衡器有限公司产品；分析天平，METTLER TOLEDO公司产品；玻璃毛细管，四川成都华西医科大学仪器厂生产；Biofuge Primo R离心机，德国Thermo Scientific Heraeus公司产品。RM2235石蜡切片机、EG1150H+EG1130C组织包埋机、HI1210烘片机、DM2500正置显微镜和ASP300S全自动组织脱水机均购自德国莱卡仪器有限公司。
2 方 法
2.1 酵母颗粒饲料的制备 酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中，充分混匀，重新压粒成型，控制其在饲料中的质量分数为10%。
2.2 实验分组、高尿酸血症模型的诱导及给药 40只SD大鼠自由饮水进食1周后开始实验。实验前通过眼眶后静脉丛采血，全自动生化仪上检测尿酸水平，选取尿酸水平在20～50 μmol·L-1
范围的大鼠为实验动物，依据尿酸水平分为正常对照组、模型对照组、苯溴马隆阳性药组（简称阳性药组）、健脾渗湿方给药组（简称健脾渗湿方组），每组10只，雌雄各半。高尿酸血症大鼠模型的诱导参照文献[6]制备，模型对照组、阳性药组、健脾渗湿方组均给予质量浓度10%酵母饲料饲喂，并于每天上午10：00灌胃腺嘌呤
100 mg·kg-1，每日1次，连续14 d，以制备高尿酸血症模型。正常对照组饲予普通大鼠颗粒饲料，并给予同体积的蒸馏水。阳性药组和健脾渗湿方组分别给予苯溴马隆20 mg·kg-1和健脾渗湿方浸膏10.05 g·kg-1（相当于生药49.95g·kg-1）。以上均在模型制备的第1天开始给药，每天1次。给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。
2.3 指标检测
2.3.1 HE染色 小鼠处死后，取其右肾，于质量浓度10%中性缓冲福尔马林进行固定，之后脱水和进行石蜡包埋，切片（厚度4 mm），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后显微镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测尿酸盐转运蛋白OAT3的表达情况 石蜡切片脱蜡至水，用PBS冲洗3次，根据不同抗体要求进行相应抗原修复，质量浓度3%的H2O2室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，再用PBS冲洗3次；抗原高压修复；加入羊血清，孵育10 min，尔后倾去血清，滴加一抗工作液，37 ℃
孵育3 h；滴加二抗工作液，室温孵育60 min；DAB染色；苏木精复染细胞核；封片。以PBS代替一抗作阴性对照。
2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。方差齐，均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析；方差不齐，均值间差异比较采用校正t检验。数据统计均以表示。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 健脾渗湿方对高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤的影响 大鼠肾脏切片HE染色结果光镜下可见，正常对照组大鼠肾脏结构正常，无尿酸盐结晶，无明显异常，见图1（1）。模型对照组大鼠肾脏结构改变，大量尿酸盐结晶阻塞肾小球毛细血管腔，致肾小球正常结构消失，肾小管腔扩大，部分轻度萎缩，肾近曲小管腔、间质部分及血管较多棕褐色尿酸盐结晶沉积，并有大量炎性细胞浸润，见图1（2）。阳性药组和健脾渗湿方组大鼠肾小体结构稍清晰，肾小管上皮细胞稍浊肿变性，肾小管腔部分扩张，小管腔及间质部位尿酸盐结晶沉积减少，炎性细胞浸润减少，见图1（3、4）。
3.2 健脾渗湿方对高尿酸血症大鼠OAT3蛋白表达的影响 免疫组化研究结果显示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾脏中OAT3蛋白表达水平有所降低；与模型对照组比较，阳性药组和健脾渗湿方组OAT3蛋白表达水平显著上调。见图2。 4 讨 论
痛风是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，其临床特点为高尿酸血症（Hyperuricemia，HUM）及由此引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。中医学认为痛风属“痹证”范畴，而高尿酸血症属“浊毒”。痛风及高尿酸血症主要病因在于先天禀赋不足，多为脾胃虚损，复加感受外邪，或饮食不节，酗酒或多进肥厚之品，而使脾失健运，运化失常，升降失调；或脏腑功能减退，气化不利，气血失调等，致使水液代谢输布运化排泄失常，津液不归正化为湿、为痰、为瘀，使气血运行不畅而成。间歇期主张重用调补脾肾之品，绝毒内生之源[7-8]。可见，脾虚湿盛，痰瘀痹阻是本病病机的关键所在。据此，我们以“健脾渗湿，化痰通络”为法，由党参、茯苓、白术、三七、白芥子、金钱草等10余味中药组方制成颗粒剂（七君颗粒），临床主要用于痛风及高尿酸血症（脾虚湿阻型）治疗。健脾渗湿方具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促进尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，对高尿酸血症大鼠模型肾脏功能损伤具有显著的保护作用[1-5]。为研究该方对降低痛风及高尿酸血症血尿酸的作用机制，本研究旨在以尿酸盐转运蛋白hOAT3为切入点，探讨健脾渗湿之法治疗高尿酸血症（脾虚湿阻型）的作用机制。
肾尿酸排泄由肾小球滤过、肾小管重吸收（S1段）、分泌（S2段）及分泌后重吸收（S3段）组成，最终经尿排泄的尿酸为滤过尿酸的10%[9-10]。
由于尿酸几乎全部被滤过，干预肾小管分泌和重吸收过程可影响尿酸排泄。尿酸为极性分子，不能自由通过细胞膜。其在肾近曲小管的重吸收和分泌过程有赖于离子通道。近年来运用生理、分子生物和细胞生物等多种技术研究肾脏尿酸盐的转运，目前已明确有4种尿酸盐转运蛋白（位于肾小管的顶膜和基底膜）参与人近曲肾小管对尿酸盐的转运，即生电型的尿酸盐转运体hUAT（human urate transporter）、电中性的尿酸盐/阴离子交换体hURAT1（human urateanion exchanger1）和有机阴离子转运体hOAT1和hOAT3（human organic anion transporter）。hOAT1和hOAT3参与管周细胞对尿酸盐的摄取，有利于尿酸盐的分泌，在管周间隙摄取尿酸盐人肾小管上皮细胞起重要作用，其表达及功能缺陷可能为原发性高尿酸血症重要的发病机制之一[11-13]。
肾脏切片HE染色和免疫组化结果显示，健脾渗湿方药物干预可显著改善高尿酸血症组模型大鼠肾脏的病理损伤，上调尿酸盐转运蛋白OAT3蛋白表达。提示健脾渗湿方可能通过调控尿酸盐转运蛋白OAT3，
促进尿酸盐的分泌，从而降低机体的尿酸水平。
5 参考文献
[1] 胡美兰.健脾化痰通络渗湿法治疗高尿酸血症40例疗效观察[J].云南中医中药杂志，2006，27（3）：15-16.
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[6] 邢儒伶，孟冬梅，任伟，等.建立痛风性肾病并发慢性肾功能衰竭动物模型方法的探讨[J].中国中西医结合杂志，2011，31（10）：1409-1413.
[7] 张永生.姜良铎教授治疗痛风经验[J].北京中医药大学学报，2002，25（2）：61-62.
[8] 朱萱萱，陈震，纪伟，等.热痹消治疗急性痛风性关节炎的实验研究[J].中国药品标准，2002，3（1）：57-60.
[9] Hediger MA，Johnson RJ，Miyazaki H，et al.Molecular physiology of urate transport [J].Physiology（Bethesda），2005，20：125-133.
[10] Anzai N，Enomoto A，Endou H.Renal uratehandling：clinical relevance of recent advances[J].Curt Rheumatol Rep，2005，7（3）：227-234.
[11] 李成乾，赵家军，王霞，等.VLDL对人尿酸盐转运蛋白hOAT1基因表达的影响[J].山东大学学报：医学版，2008，46（6）：579-582.
[12] 王静，苗志敏，李长贵，等.高尿酸血症大鼠肾小管上皮细胞OAT3表达的变化[J].青岛大学医学院学报，2008，44（4）：298-300.
[13] Erdrnan AR，Mangravte LM，Urban TJ，et a1.The human organic anion transporter 3 （OAT3，SLC 22A8）：genetic variation and functional genomics[J].Am J Physiol Renal Physiol，2006，290（4）：905-912.