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摘 要 目的：采用荧光定量PCR技术对慢性乙肝患者用拉米夫定治疗1年后，患者血清中HBV DNA水平变化及YMDD基因变异的检测，并对其临床应用进行评价。方法：选取82例乙肝患者经拉米夫定治疗1年前、后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异，回顾性对YMDD野生型组和YMDD变异型组进行统计学分析。结果：拉米夫定治疗前HBVDNA的载量，两组相比差异没有统计学意义，1年后YMDD的变异率为15．86%，YMDD变异型组HBV DNA无1例阴转，YMDD野生型组HBV DNA阴转率为82．60 %，差异有统计学意义。结论：荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。
关键词 荧光定量PCR 联合检测 拉米夫定 HBVDNAYMDD变异
材料与方法
2006年6月～2008年4月用拉米夫定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者82例，治疗时间≥1年，年龄14～62岁（平均35．1±3．8岁），男58例，女24例。
采清晨空腹静脉血4ml，不添加抗凝剂，分离血清，于-20℃保存，不反复冻融。标本、对照品的处理和加样血清标本、试剂盒内阳性对照、阴性对照、YVDD对照各取50μl，分别加入50μl核酸提取液，振荡10秒，99℃干浴或水浴10分钟，13000rpm离心10分钟，保留上清备用。处理后的样品应在3小时内使用，或在-200～-800℃最长保存1个月，HBV DNA标准品进行10、100、1000倍梯度稀释。
取（N+1）×36μl混合液A与（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混匀（N为反应管数），3000rpm离心数秒；取（N+1）×36μl混合液 B与（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混匀，3000rpm离心数秒；
分别取上述加酶后的混合液A和混合液B各36．4μl置于不同两个薄壁PCR反应管中，然后将样品、阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照处理上清液和梯度稀释的HBV DNA标准品各4μl分别加入PCR反应管中置于Line-Gene FQD-33A荧光定量PCR检测系统上。
循环条件设置：37℃×2分钟；94℃×2分钟；再按93℃×15秒→62℃×60秒，循环40次；荧光检测在62℃荧光通道选择FAM，立即进行扩增反应。
YMDD变异检测：HBVYMDD弱阳性对照混合液A和混合液B的荧光检测Ct值均应≤38，HBVYVDD血清对照、HBVYIDD血清对照混合液A检测所得Ct值应≤38，混合液B检测为阴性，否則试验视为无效。
根据工作曲线计算，仪器自动显示待检样品DNA定量值。待检样品混合液A和混合液B的荧光检测Ct值≤38，判断待检样品为HBVYMDD野生型，。
待检样品在混合液A检测Ct值≤38，混合液B检测为阴性，判断待检样品为HBVYMDD变异型，如图1。
如果检测Ct值在38～40之间，重复检测1次，如果检测Ct值仍在38～40之间，则判为阴性。
结 果
82例患者血清中13例发生变异，占15．86%，变异类型与年龄和性别无明显相关性。将结果分为YMDD野生型组和YMDD变异型组，回顾性分析两组治疗前的HBVDNA拷贝数（取对数值）差异无统计学意义（t=0．521，P>0．05）
拉米夫定用药12个月后，其YMDD 变异型组与YMDD野生型组相比，HBV DNA阴转率明显不同，<5．0×102拷贝数/ml（对数值为2．69）为阴性，结果显示：变异后HBV DNA含量反跳，无1例阴转。而野生型在用药12个月后，HBV DNA阴转率明显增加，阴转率达82．60%，二者的HBVDNA拷贝数（取对数值）经统计，两组相比差异具有统计学意义（t=24．9，P<0．01）。
讨 论
拉米夫定具有强力地抑制乙肝病毒复制的作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水平。该作用主要是通过抑制HBV多聚酶活性，阻断HBV DNA合成而实现的。拉米夫定为胞嘧啶核苷类似物，在体内以三磷酸化形式与HBV多聚酶结合后，竞争性抑制了多聚酶活性，造成HBV DNA链合成终止，从而抑制病毒复制。位于多聚酶活性结构区域Ｃ的YMDD基因序列是其结合位点，编码多聚酶的Ｐ基因的个别核苷酸的变异可改变该结合位点的构象，使HBV可逃避拉米夫定的作用而产生耐药株。
目前检测YMDD变异的分子生物学方法主要有直接测序法、限制性片断多态性分析（RFLP）[2]、5'-核酸酶检测法、基因芯片法、荧光定量PCR熔解曲线法、焦磷酸测序技术、高效变性液相色谱法等。测序法是目前专家共认的金标准，但需配置测序仪，一次性投入资金较大，测序周期较长，费用较高；PCR-ELISA在进行PCR扩增后，需要预杂交、杂交、显色等开放性试验，容易造成标本的交叉污染以及影响实验室的质量控制操作繁琐，费时，不适合当天出检测报告；基因芯片需要开放式杂交，会造成一定的交叉污染需要配置芯片仪，一次性投入资金较大，且芯片成本较高，这些方法对技术和设备要求很高或者操作繁琐，耗时费力，不利于大范围的普及与推广。
参考文献
1 中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志,2000,8:324-329.
2 Sun J,Hou J L,Xiao L,et al.Analysis of three lamivudine resistant HBV mutants with the method of restriction enzyme digestion and its application.Zhonghua Shi Yan he Lin Chang Bing Du Xue Za Zhi,2003,17(1):18-20.
关键词 荧光定量PCR 联合检测 拉米夫定 HBVDNAYMDD变异
材料与方法
2006年6月～2008年4月用拉米夫定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者82例，治疗时间≥1年，年龄14～62岁（平均35．1±3．8岁），男58例，女24例。
采清晨空腹静脉血4ml，不添加抗凝剂，分离血清，于-20℃保存，不反复冻融。标本、对照品的处理和加样血清标本、试剂盒内阳性对照、阴性对照、YVDD对照各取50μl，分别加入50μl核酸提取液，振荡10秒，99℃干浴或水浴10分钟，13000rpm离心10分钟，保留上清备用。处理后的样品应在3小时内使用，或在-200～-800℃最长保存1个月，HBV DNA标准品进行10、100、1000倍梯度稀释。
取（N+1）×36μl混合液A与（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混匀（N为反应管数），3000rpm离心数秒；取（N+1）×36μl混合液 B与（N+1）×0．4μl酶（Taq+UNG）混匀，3000rpm离心数秒；
分别取上述加酶后的混合液A和混合液B各36．4μl置于不同两个薄壁PCR反应管中，然后将样品、阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照处理上清液和梯度稀释的HBV DNA标准品各4μl分别加入PCR反应管中置于Line-Gene FQD-33A荧光定量PCR检测系统上。
循环条件设置：37℃×2分钟；94℃×2分钟；再按93℃×15秒→62℃×60秒，循环40次；荧光检测在62℃荧光通道选择FAM，立即进行扩增反应。
YMDD变异检测：HBVYMDD弱阳性对照混合液A和混合液B的荧光检测Ct值均应≤38，HBVYVDD血清对照、HBVYIDD血清对照混合液A检测所得Ct值应≤38，混合液B检测为阴性，否則试验视为无效。
根据工作曲线计算，仪器自动显示待检样品DNA定量值。待检样品混合液A和混合液B的荧光检测Ct值≤38，判断待检样品为HBVYMDD野生型，。
待检样品在混合液A检测Ct值≤38，混合液B检测为阴性，判断待检样品为HBVYMDD变异型，如图1。
如果检测Ct值在38～40之间，重复检测1次，如果检测Ct值仍在38～40之间，则判为阴性。
结 果
82例患者血清中13例发生变异，占15．86%，变异类型与年龄和性别无明显相关性。将结果分为YMDD野生型组和YMDD变异型组，回顾性分析两组治疗前的HBVDNA拷贝数（取对数值）差异无统计学意义（t=0．521，P>0．05）
拉米夫定用药12个月后，其YMDD 变异型组与YMDD野生型组相比，HBV DNA阴转率明显不同，<5．0×102拷贝数/ml（对数值为2．69）为阴性，结果显示：变异后HBV DNA含量反跳，无1例阴转。而野生型在用药12个月后，HBV DNA阴转率明显增加，阴转率达82．60%，二者的HBVDNA拷贝数（取对数值）经统计，两组相比差异具有统计学意义（t=24．9，P<0．01）。
讨 论
拉米夫定具有强力地抑制乙肝病毒复制的作用，可迅速降低患者血清HBV DNA水平。该作用主要是通过抑制HBV多聚酶活性，阻断HBV DNA合成而实现的。拉米夫定为胞嘧啶核苷类似物，在体内以三磷酸化形式与HBV多聚酶结合后，竞争性抑制了多聚酶活性，造成HBV DNA链合成终止，从而抑制病毒复制。位于多聚酶活性结构区域Ｃ的YMDD基因序列是其结合位点，编码多聚酶的Ｐ基因的个别核苷酸的变异可改变该结合位点的构象，使HBV可逃避拉米夫定的作用而产生耐药株。
目前检测YMDD变异的分子生物学方法主要有直接测序法、限制性片断多态性分析（RFLP）[2]、5'-核酸酶检测法、基因芯片法、荧光定量PCR熔解曲线法、焦磷酸测序技术、高效变性液相色谱法等。测序法是目前专家共认的金标准，但需配置测序仪，一次性投入资金较大，测序周期较长，费用较高；PCR-ELISA在进行PCR扩增后，需要预杂交、杂交、显色等开放性试验，容易造成标本的交叉污染以及影响实验室的质量控制操作繁琐，费时，不适合当天出检测报告；基因芯片需要开放式杂交，会造成一定的交叉污染需要配置芯片仪，一次性投入资金较大，且芯片成本较高，这些方法对技术和设备要求很高或者操作繁琐，耗时费力，不利于大范围的普及与推广。
参考文献
1 中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志,2000,8:324-329.
2 Sun J,Hou J L,Xiao L,et al.Analysis of three lamivudine resistant HBV mutants with the method of restriction enzyme digestion and its application.Zhonghua Shi Yan he Lin Chang Bing Du Xue Za Zhi,2003,17(1):18-20.