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【摘要】 目的：探讨百里醌抑制体外骨肉瘤细胞转移的作用及其机制。方法：本研究应用不同浓度百里醌作用人骨肉瘤SaOS-2细胞后，观察百里醌对体外骨肉瘤SaOS-2细胞迁移和侵袭的作用；Western blotting检测骨肉瘤细胞中MMP-2和MMP-9表达的变化。结果：百里醌可呈浓度依赖性抑制体外人骨肉瘤骨肉瘤SaOS-2细胞迁移和侵袭，同时百里醌可下调骨肉瘤SaOS-2细胞中MMP-2和MMP-9的表达。结论：百里醌可抑制体外骨肉瘤细胞转移，该作用可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达而实现。
【关键词】 骨肉瘤； 百里醌； 转移
【Abstract】 Objective：To investigate the anti-metastasis effect and its mechanism of thymoquinone on the osteosarcoma SaOS-2 cell line in vitro.Method：In the study，after application of different concentrations of thymoquinone in the role of human osteosarcoma SaOS-2 cells，the effects of thymoquinone on the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells were examined by using wound assay and matrigel counting.Western blotting was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in SaOS-2 cells.Result：Thymoquinone significantly suppressed the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells in a concentration depended manner.The expression of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated in osteosarcoma SaOS-2 cells after treatment of thymoquinone.Conclusion：Thymoquinone exerts anti-metastatic activity in SaOS-2 cells in vitro，which may be achieved by down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.
【Key words】 Osteosarcoma； Thymoquinone； Metastasis
First-author’s address：The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.007
百里醌（Oridonin）是从唇形科（Labtea）香茶菜属（Rabdosia）植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类（ent-kaurene diterpenoid）天然有机化合物，目前研究结果表明，百里醌能够抑制如前列腺癌、宫颈癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞增殖，并对细胞转移有一定抑制作用[1-6]。但目前尚未有百里醌对骨肉瘤转移的抑制作用的研究报道，为此本研究将观察百里醌对体外人骨肉瘤细胞转移的作用，并初步探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要药品和试剂 胰酶、胎牛血清和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗体购自美国Epitomics公司；Transwell小室购自美国Corning公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和结晶紫染色试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；人工重组基底膜（matrigel）和百里醌购自美国Sigma公司，百里醌用含30%DMSO的灭菌三蒸水配成5 mmol/L母液，置-20 ℃保存，应用时加RPMI-1640培养基稀释成目标浓度（DMSO的终浓度<0.1%，该浓度对细胞无明显毒副作用。
1.2 细胞株及细胞培养 人骨肉瘤细胞株SaOS-2购自ATCC，培养在含l0%胎牛血清、质量浓度1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。
1.3 细胞迁移实验 将对数生长期的SaOS-2细胞制成单细胞悬液，不同浓度百里醌（10、20、
40 μmol/L）作用2 h后，在培养皿上用200 μL枪头小心刮出2 mm×2 cm 刮痕，经PBS冲洗2次，在显微镜下见刮痕内无细胞残留后放置培养箱继续培养24 h，置于倒置显微镜下观察细胞划痕并计算各组细胞的划痕修复率，实验重复3次，取平均值。划痕修复率（%）=[（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度]×100%。
1.4 细胞侵袭实验 不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用骨肉瘤细胞2 h后，用无血清RPMI-1640培养基将细胞制成单细胞悬液，取1×104个细胞置于Transwell小室的上室，下层加500 μL含20%胎牛血清的培养基，放置细胞培养箱中培养24 h后取出滤膜，用棉签小心擦去小室内膜上未穿过膜的细胞，细胞固定后用结晶紫染色，置于倒置显微镜下观察染色后的细胞并计数，随机计数20个视野，计算平均值。
【关键词】 骨肉瘤； 百里醌； 转移
【Abstract】 Objective：To investigate the anti-metastasis effect and its mechanism of thymoquinone on the osteosarcoma SaOS-2 cell line in vitro.Method：In the study，after application of different concentrations of thymoquinone in the role of human osteosarcoma SaOS-2 cells，the effects of thymoquinone on the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells were examined by using wound assay and matrigel counting.Western blotting was used to detect the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in SaOS-2 cells.Result：Thymoquinone significantly suppressed the migration and invasion of osteosarcoma SaOS-2 cells in a concentration depended manner.The expression of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated in osteosarcoma SaOS-2 cells after treatment of thymoquinone.Conclusion：Thymoquinone exerts anti-metastatic activity in SaOS-2 cells in vitro，which may be achieved by down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.
【Key words】 Osteosarcoma； Thymoquinone； Metastasis
First-author’s address：The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.007
百里醌（Oridonin）是从唇形科（Labtea）香茶菜属（Rabdosia）植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类（ent-kaurene diterpenoid）天然有机化合物，目前研究结果表明，百里醌能够抑制如前列腺癌、宫颈癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞增殖，并对细胞转移有一定抑制作用[1-6]。但目前尚未有百里醌对骨肉瘤转移的抑制作用的研究报道，为此本研究将观察百里醌对体外人骨肉瘤细胞转移的作用，并初步探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要药品和试剂 胰酶、胎牛血清和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；MMP-2、MMP-9和β-actin抗体购自美国Epitomics公司；Transwell小室购自美国Corning公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和结晶紫染色试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；人工重组基底膜（matrigel）和百里醌购自美国Sigma公司，百里醌用含30%DMSO的灭菌三蒸水配成5 mmol/L母液，置-20 ℃保存，应用时加RPMI-1640培养基稀释成目标浓度（DMSO的终浓度<0.1%，该浓度对细胞无明显毒副作用。
1.2 细胞株及细胞培养 人骨肉瘤细胞株SaOS-2购自ATCC，培养在含l0%胎牛血清、质量浓度1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。
1.3 细胞迁移实验 将对数生长期的SaOS-2细胞制成单细胞悬液，不同浓度百里醌（10、20、
40 μmol/L）作用2 h后，在培养皿上用200 μL枪头小心刮出2 mm×2 cm 刮痕，经PBS冲洗2次，在显微镜下见刮痕内无细胞残留后放置培养箱继续培养24 h，置于倒置显微镜下观察细胞划痕并计算各组细胞的划痕修复率，实验重复3次，取平均值。划痕修复率（%）=[（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度]×100%。
1.4 细胞侵袭实验 不同浓度百里醌（10、20、40 μmol/L）作用骨肉瘤细胞2 h后，用无血清RPMI-1640培养基将细胞制成单细胞悬液，取1×104个细胞置于Transwell小室的上室，下层加500 μL含20%胎牛血清的培养基，放置细胞培养箱中培养24 h后取出滤膜，用棉签小心擦去小室内膜上未穿过膜的细胞，细胞固定后用结晶紫染色，置于倒置显微镜下观察染色后的细胞并计数，随机计数20个视野，计算平均值。