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摘要：潮霉素是基因转化过程中常用的筛选剂，为了探索不同小麦品种对潮霉素的抗性，本研究设置0、25、50、75、100、125、150 mg/L不同的潮霉素浓度，对K35、065657、扬麦158、Bobwhite和济引1号5个幼胚再生率高的小麦品种进行幼胚拯救并测试其对潮霉素的耐性。结果表明：K35和065657幼胚的最适筛选浓度是125 mg/L，扬麦158、Bobwhi和济引1号幼胚的最适筛选浓度是100 mg/L。
关键词：小麦；幼胚拯救；转基因；潮霉素耐受性
中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2011)02－0015－03
目前转基因植物中的标记基因主要分为选择基因和报告基因两大类。常用的选择基因有抗生素抗性基因(如潮霉素磷酸转移酶基因，hptⅡ)和抗除草剂基因(如草丁磷抗性基因，bar)，报告基因有荧光素酶基因(luc)和绿色荧光蛋白基因(gfp)等。有些基因具有报告和选择双重功能，如新霉素磷酸转移酶基因(npt)和氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。
hpt基因的表达产物可以抗潮霉素(Hygromy-tin B)，潮霉素对抗性愈伤组织的选择效率较高，而且也没有发现它能引起白化或影响结实性等问题。潮霉素进入非转化细胞，可与细胞内30S核糖体结合，使细胞中蛋白质合成受阻，细胞就逐渐褐化死亡。而hpt基因整合到细胞染色体上时，就可表达出潮霉素磷酸转移酶，将磷酸共价结合到潮霉素上，使进入转化细胞内的潮霉素失活。hpt基因是目前在单子叶植物转化研究中应用最广、最成功的筛选标记基因。研究表明，不同的小麦品种对潮霉素的敏感性不同。因此，在利用不同小麦品种作为转基因的受体品种、潮霉素作筛选标记时，选择合适的潮霉素浓度至关重要，浓度过低会产生很多假阳性，浓度过高，筛选过度，就会造成阳性苗的死亡。近年来，我们对200多个小麦品种幼胚的愈伤组织诱导和再生能力进行研究，筛选出K35、065657、扬麦158、Bobwhite和济引1号5个再生能力强的品种(实验结果另文发表)，这些品种是理想的小麦转基因受体品种。为了更好地将这些品种用作转基因的受体，我们对其生理特性和抗生素抗性进行了广泛的研究。本研究即报道了上述品种在不同潮霉素浓度下的生长情况，确定了它们作为转基因受体的最适潮霉素筛选浓度。
1 材料与方法
1.1 小麦材料
K35、065657是山东省农业科学院作物研究所自育品系，扬麦158来自江苏里下河农科所，Bobwhite和济引1号来自美国。上述品种分别于2009年秋和2010年春播种于山东省农业科学院试验农场，田间管理同大田。
1.2 幼胚的处理
取开花20 d、幼胚大小约2 min的未成熟种子，用75％的乙醇表面灭菌1 min，再用1％的次氯酸钠灭菌15 min，期间不停搅拌。用灭菌水冲洗3～4遍，在超净台上取出幼胚，将幼胚胚轴朝上放于1/2MS固体培养基上培养。
1.3 培养基配制
用于幼胚拯救的培养基为1/2MS，购自山东浩博生物技术有限公司，潮霉素购自罗氏公司。称取I/2MS培养基39.45 g，溶解于1L超纯水中，利用培养基专用制备器，121℃灭菌18 min，待培养基温度稳定到6022时，将抽滤灭菌后的潮霉素通过填料口加入培养基制备器中。利用自动分装泵，将培养基分到不同的一次性培养皿中，使用直径9 cm培养皿，每皿30ml。
1.4 不同小麦品种幼胚对潮霉素的敏感性筛选
设6个潮霉素质量浓度梯度，分别为0.25、50、75、100、125、150 mg/L。每个浓度梯度60个幼胚，分为3皿，每皿20个。将剥好的幼胚胚轴朝上分别放在含有不同潮霉素剂量的1/2MS固体培养基上于25℃培养，光照时间16 h。4周后统计发芽率、生根率、根系的最终长度、苗的最终长度和存活天数。
2 结果与分析
2.1 潮霉素筛选过程中小麦幼胚的生长动态
幼胚接种后3天开始萌发，随着时间的推移，萌发的幼苗出现颜色的变化，在浓度为零时，各个品种都由嫩绿到深绿变化，而且整个过程中苗生长都很壮。各个品种在25、50、75、100 mg/L时的变化相同，都是由嫩绿到深绿，后部分幼苗芽尖先变白，然后整个苗慢慢变黄失绿，最后萎蔫死亡，但仍有部分苗存活，只是生长缓慢。125 mg/L时K35、065657和Bobwhite先长出淡黄色的芽，慢慢绝大部分芽变黄死亡；济引1号长出的芽为白色；扬麦158只生根而没有长芽。150mg/L时5个品种的幼胚都不能萌发，说明潮霉素的浓度已经过高。不同潮霉素浓度下各个品种的表现详见表1。
2.2 不同小麦品种对潮霉素敏感性的差异分析
幼胚接种后1周，统计不同品种在不同潮霉素浓度下幼胚萌发成苗率，每天观察幼苗的存活情况，统计其存活天数，生长4周后，统计幼苗的生根率、根长、苗长，具体结果见表2。K35、065657、扬麦158、B0bwhife和济引1号的发芽率、生根率、最终根长度、最终苗长度都与潮霉素质量浓度的增加呈负相关。K35、扬麦158、B0bwhite和济引1号对潮霉素较065657敏感，但是济引1号的发芽率和生根率较其他4个品种都要低。
3 讨论与结论
抗生素对不同植物的抑制作用程度不同，不同的植物材料，筛选剂对其生长和作用的浓度也不同。选择合适的筛选剂和最适的筛选剂浓度非常重要。但是如何确定使用筛选剂的质量浓度，没有明确的标准，实践中一般以能有效地抑制非转化细胞的生长，而转化细胞生长不受限制为宜。潮霉素的作用机理是抑制蛋白质的合成，如果转入了含有标记基因的转化质粒，在有这种抗生素情况下仍然能够正常生长，未转入的则不能正常生长，从而达到筛选的目的。本试验证明，不同小麦品种的幼胚使用潮霉素筛选的最适浓度不同，K35、065657在125 mg/L的潮霉素浓度下就能够达到很好的筛选效果，扬麦158、Bobwhite和济引1号在100 mg/L的潮霉素浓度下能够达到筛选的目的。
参考文献：
[1]侯文学，姜悦，郭勇，转基因植物中的标记基因[J]，生物学通报，1997，32(10)：19－21
[2]奚亚军，范学科，侯文胜，等，小麦遗传转化中潮霉素适宜筛选浓度的研究[J]，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2003，31(1)：39－42
[3]李淑芳，汤浩茹，贺永明，抗生素对“考密斯”梨叶片的不定梢诱导的影响[J]，北方园艺，2007，5：32－34
[4]孙璟晗，李滨胜，崔杰，两种抗生素对甜菜离体叶柄分化的影响[J]，中国甜菜糖业，2006，3：18－20
[5]王丽，张俊莲，王蒂，抗生素对根癌农杆菌的抑菌效果及对烟草叶片分化的影响[J]，中国烟草学报，2006，12(1)：32－37
[6]韦大器，时群，李枸，抗生素对尾巨桉愈伤组织诱导和植株再生的影响[J]，植物生理学通讯，2007，43(4)：719
[7]叶杨，刘欣，樊哲仁，等，不同抗生素种类和浓度对苦瓜培养的影响[J]，北方园艺，2008，10；18－21
关键词：小麦；幼胚拯救；转基因；潮霉素耐受性
中图分类号：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2011)02－0015－03
目前转基因植物中的标记基因主要分为选择基因和报告基因两大类。常用的选择基因有抗生素抗性基因(如潮霉素磷酸转移酶基因，hptⅡ)和抗除草剂基因(如草丁磷抗性基因，bar)，报告基因有荧光素酶基因(luc)和绿色荧光蛋白基因(gfp)等。有些基因具有报告和选择双重功能，如新霉素磷酸转移酶基因(npt)和氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。
hpt基因的表达产物可以抗潮霉素(Hygromy-tin B)，潮霉素对抗性愈伤组织的选择效率较高，而且也没有发现它能引起白化或影响结实性等问题。潮霉素进入非转化细胞，可与细胞内30S核糖体结合，使细胞中蛋白质合成受阻，细胞就逐渐褐化死亡。而hpt基因整合到细胞染色体上时，就可表达出潮霉素磷酸转移酶，将磷酸共价结合到潮霉素上，使进入转化细胞内的潮霉素失活。hpt基因是目前在单子叶植物转化研究中应用最广、最成功的筛选标记基因。研究表明，不同的小麦品种对潮霉素的敏感性不同。因此，在利用不同小麦品种作为转基因的受体品种、潮霉素作筛选标记时，选择合适的潮霉素浓度至关重要，浓度过低会产生很多假阳性，浓度过高，筛选过度，就会造成阳性苗的死亡。近年来，我们对200多个小麦品种幼胚的愈伤组织诱导和再生能力进行研究，筛选出K35、065657、扬麦158、Bobwhite和济引1号5个再生能力强的品种(实验结果另文发表)，这些品种是理想的小麦转基因受体品种。为了更好地将这些品种用作转基因的受体，我们对其生理特性和抗生素抗性进行了广泛的研究。本研究即报道了上述品种在不同潮霉素浓度下的生长情况，确定了它们作为转基因受体的最适潮霉素筛选浓度。
1 材料与方法
1.1 小麦材料
K35、065657是山东省农业科学院作物研究所自育品系，扬麦158来自江苏里下河农科所，Bobwhite和济引1号来自美国。上述品种分别于2009年秋和2010年春播种于山东省农业科学院试验农场，田间管理同大田。
1.2 幼胚的处理
取开花20 d、幼胚大小约2 min的未成熟种子，用75％的乙醇表面灭菌1 min，再用1％的次氯酸钠灭菌15 min，期间不停搅拌。用灭菌水冲洗3～4遍，在超净台上取出幼胚，将幼胚胚轴朝上放于1/2MS固体培养基上培养。
1.3 培养基配制
用于幼胚拯救的培养基为1/2MS，购自山东浩博生物技术有限公司，潮霉素购自罗氏公司。称取I/2MS培养基39.45 g，溶解于1L超纯水中，利用培养基专用制备器，121℃灭菌18 min，待培养基温度稳定到6022时，将抽滤灭菌后的潮霉素通过填料口加入培养基制备器中。利用自动分装泵，将培养基分到不同的一次性培养皿中，使用直径9 cm培养皿，每皿30ml。
1.4 不同小麦品种幼胚对潮霉素的敏感性筛选
设6个潮霉素质量浓度梯度，分别为0.25、50、75、100、125、150 mg/L。每个浓度梯度60个幼胚，分为3皿，每皿20个。将剥好的幼胚胚轴朝上分别放在含有不同潮霉素剂量的1/2MS固体培养基上于25℃培养，光照时间16 h。4周后统计发芽率、生根率、根系的最终长度、苗的最终长度和存活天数。
2 结果与分析
2.1 潮霉素筛选过程中小麦幼胚的生长动态
幼胚接种后3天开始萌发，随着时间的推移，萌发的幼苗出现颜色的变化，在浓度为零时，各个品种都由嫩绿到深绿变化，而且整个过程中苗生长都很壮。各个品种在25、50、75、100 mg/L时的变化相同，都是由嫩绿到深绿，后部分幼苗芽尖先变白，然后整个苗慢慢变黄失绿，最后萎蔫死亡，但仍有部分苗存活，只是生长缓慢。125 mg/L时K35、065657和Bobwhite先长出淡黄色的芽，慢慢绝大部分芽变黄死亡；济引1号长出的芽为白色；扬麦158只生根而没有长芽。150mg/L时5个品种的幼胚都不能萌发，说明潮霉素的浓度已经过高。不同潮霉素浓度下各个品种的表现详见表1。
2.2 不同小麦品种对潮霉素敏感性的差异分析
幼胚接种后1周，统计不同品种在不同潮霉素浓度下幼胚萌发成苗率，每天观察幼苗的存活情况，统计其存活天数，生长4周后，统计幼苗的生根率、根长、苗长，具体结果见表2。K35、065657、扬麦158、B0bwhife和济引1号的发芽率、生根率、最终根长度、最终苗长度都与潮霉素质量浓度的增加呈负相关。K35、扬麦158、B0bwhite和济引1号对潮霉素较065657敏感，但是济引1号的发芽率和生根率较其他4个品种都要低。
3 讨论与结论
抗生素对不同植物的抑制作用程度不同，不同的植物材料，筛选剂对其生长和作用的浓度也不同。选择合适的筛选剂和最适的筛选剂浓度非常重要。但是如何确定使用筛选剂的质量浓度，没有明确的标准，实践中一般以能有效地抑制非转化细胞的生长，而转化细胞生长不受限制为宜。潮霉素的作用机理是抑制蛋白质的合成，如果转入了含有标记基因的转化质粒，在有这种抗生素情况下仍然能够正常生长，未转入的则不能正常生长，从而达到筛选的目的。本试验证明，不同小麦品种的幼胚使用潮霉素筛选的最适浓度不同，K35、065657在125 mg/L的潮霉素浓度下就能够达到很好的筛选效果，扬麦158、Bobwhite和济引1号在100 mg/L的潮霉素浓度下能够达到筛选的目的。
参考文献：
[1]侯文学，姜悦，郭勇，转基因植物中的标记基因[J]，生物学通报，1997，32(10)：19－21
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[7]叶杨，刘欣，樊哲仁，等，不同抗生素种类和浓度对苦瓜培养的影响[J]，北方园艺，2008，10；18－21