【摘 要】
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目的 从CA-MILSA全基因组水平筛选出除域值感知(quorum sensing)基因系统以外对α-毒素表达有明显调节作用的基因,并研究其调节机制.方法 使用本实验室构建并已申请国家专利
【机 构】
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李敏,复旦大学附属华山医院中心实验室
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目的 从CA-MILSA全基因组水平筛选出除域值感知(quorum sensing)基因系统以外对α-毒素表达有明显调节作用的基因,并研究其调节机制.方法 使用本实验室构建并已申请国家专利的真核转座酶为基础的转座系统构建CA-MKSA转座子,并随机插入突变文库.通过用5%羊血平板筛选出与野生株相比溶血明显改变的克隆,接着用定量RT-PCR以及WB等实验筛选出α-毒素表达明显下降的突变菌株,运用随机引物反向PCB和测序等方法鉴定出突变基因.通过基因互补表达实验、小鼠菌血症与皮肤脓肿模型实验以及荧光定量RT-PCR等方法对目标基因以及其编码蛋白的功能进行研究.结果 在CA-MRSA中建立了一个库容量约为104个克隆的转座子随机插入突变库,最终筛选出25株α-毒素表达明显下降的突变菌株.CA-MRSA野生株溶血直径平均为212 mm,而其中AraC转录调节子突变株(AraC-)几乎无溶血,当将AraC基因互补回突变株(AraC-pT181araC)后,其溶血直径平均为197 mm,部分恢复到野生株溶血水平.荧光定量RT-PCR结果显示,与CA-MRSA野生株(PSMα为257.30±37.33,agr为115.60±0.81,α-毒素为3.23±0.21)相比,在AraC-中α-毒素、PSMα以及agr表达均明显下调(α-毒素1.09±0.01:t=10.18,P0.05和t=0.851,P>0.05).小鼠皮肤脓肿模型结果显示,CA-MRSA野生株接种的小鼠皮肤表面脓肿面积为(136.5±21.45)mm2,AraC-接种的小鼠皮肤表面脓肿面积(55.69±13.81)mm2,CA-MRSA野生株与AraC-小鼠皮肤脓肿模型实验存在显著差异(t=3.169,P
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