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[摘要]目的观察表没食子儿茶素没食子酸脂（Epigallocatech in Gallate，EGCG）对中脑原代培养细胞的作用。 方法采用大鼠胚胎中脑原代细胞培养法，培养中脑神经细胞，再将细胞 分为空白对照组、阳性对照组、实验组，给予EGCG和神经生长因子（nerve growth factor ，NGF）进行配组干预，然后观察细胞生长状况，同时运用四唑盐（MTT）比色法检测神经细 胞活性；用抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）对多巴胺能神经元（dopaminerg ic neurons，DA）行免疫荧光染色，比较各组阳性神经元数目及突起的变化情况。 结果实验组（EGCG组）培养细胞生长旺盛，轴突延长，相互交错。MTT法 测得细胞吸光度值（A值）及免疫细胞化学TH阳性细胞数实验组与空白对照组比较差异有统计 学意义（P<005），实验组与阳性对照组（NGF组）比较二者差异均无统计学意义（ P>005）。 结论EGCG对中脑原代培养细胞及DA神经元有一定的保护作用。
[关键词]表没食子儿茶素没食子酸脂；中脑原代培养细胞；酪氨酸 羟化酶
中图分类号：R338文献标识码：A文章编号：1009_816X （2013）02_0114_03
流行病学研究显示，长期饮用绿茶可使帕金森病（Parkinson's disease，PD）的患病率下降 [1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）是从绿茶中 提取的主要活性成分，是重要的天然抗氧化剂，具有明显的抗氧化作用。有研究显示，EGCG 能 透过血脑屏障，减少氧自由基所致神经细胞损伤，具有对抗氧化应激因素诱导的PC12细胞和 SH_SY5Y细胞凋亡的作用，可抑制帕金森病小鼠模型诱导型一氧化氮合酶的表达[2，3 ]，保护神经细胞，具有潜在治疗神经退行性疾病的价值[4]。然而，EGCG对原代 培养的中脑神经细胞 是否具有保护作用，目前尚未见报道。本实验旨在通过观察EGCG对胚胎大鼠中脑原代细胞及 多巴胺能神经元（dopaminergic neurons，DA）的作用，进一步探讨EGCG防治PD的可能性。
1材料和方法
12方法：
121中脑原代神经细胞的培养：将孕15d SD大鼠脱颈致死，75%乙醇浸泡消毒，超净 台内 无菌分层解剖取出子宫，用D_hanks液洗净，置于盛有D_hanks液的平皿中，剪开子宫，取出 胚胎，在解剖显微镜下轻轻剥出完整的脑组织，将腹侧面朝上，沿视神经根下沿和脑干部横 切两刀，精细解剖镊分出中脑黑质部，剔除残留脑膜及血管，将所取组织块剪碎后加入01 25%胰蛋白酶（Trypsin 1：250），于37℃ 5% CO2培养箱中温育25min，然后在完全培养液 中 放置10min，终止胰蛋白酶作用。800转/分离心5min，吸弃上悬液，加培养液。用火焰刨光 的直头滴管吹打10次，静置沉淀大的组织块，吸取上悬液，调整细胞浓度，按照2×105、 1×105细胞/孔分种于涂有多聚赖氨酸的24孔和96孔塑料培养板内，置37℃，5% CO2培 养箱内 培养。
122药物处理：培养的标本随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，接种3天后， 细胞 更换新鲜培养液继续培养，接种第6天再换液一次，实验组换液时培养液中加终浓度为10umo l/L的EGCG，阳性对照组加入NGF（终浓度50μg/L），空白对照组加入正常培养液。
123四唑盐（MTT）比色法：培养第7天，给同一批培养在96孔的细胞中加10μL/孔MT T（ 5g/L），继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加100μL二甲基亚砜 （DMSO）溶液，终止MTT反应，振荡10分钟，使MTT反应的蓝色结晶充分溶解，然后放在Bio_ RAD680型酶标仪上测细胞吸光值（A值），采用检测波长570nm，参考波长630nm，每组各观 察25孔。
124抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫荧光染色：用95%酒精固定 培养 细胞20min，001mol/L PBS洗3×5min/次，边洗边振荡。然后滴加抗体稀释液稀释的小鼠 抗 大鼠TH抗体（1∶3000稀释），置37℃湿盒中30min，PBS洗3×5min/次，除去非特异性吸附 的抗体，减少背景染色。滴加荧光标记的羊抗小鼠IgG_FITC，置37℃湿盒中30min，PBS洗3 ×5min/次。揩干玻片周围水分，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞数，每组随机选取40个 视野。
13统计学处理：采用SPSS100版统计软件，测定值用（x-±s）表示，进行单因素方差分析。P<005为差异有统计学意 义。
2结果
21细胞形态学观察：细胞接种后，每天用Olympus倒置显微镜观察各组神经细胞的数目 及 形态变化，并拍照记录。培养的神经细胞多在接种后24h内贴壁，开始时细胞体积小，呈圆 点形，彼此分散，立体感较强。接种48h后，细胞分化呈双极、三极、多极等，形态多样， 并形成大小不等的团块。第二次换液后24h实验组及阳性对照组培养孔中细胞生长较空白对 照组旺盛，细胞胞体明显增大，细胞轴突向四周延伸，相互交错成网，进行TH免疫荧光染色 后可见TH阳性细胞呈黄绿色，TH阳性表达多在胞浆中。实验组和阳性对照组神经细胞胞体增 大呈梭形或多角形，部分呈圆形，突起延长、分支较多，TH阳性细胞数目较空白对照组多， 见图1。图1不同组别胚胎大鼠中脑原代培养细胞中TH阳性细 胞的表达22免疫细胞化学观察：培养至第7天时将标本进行TH免疫荧光染色，显示阳性反应的是 中脑DA能神经细胞，在显微镜下比较神经细胞的形态及反应程度，将各组随机选取8个孔， 每孔随机选5个视野（每个视野面积为045mm2），对标本进行TH阳性细胞记数并进行统 计学处理，发现实验组和阳性对照组TH阳性细胞数目均显著高于空白对照组，差异有统计学 意义（P<005）；实验组与阳性对照组比较，TH阳性细胞数差异无统计学意义（P >005），见表1。 23MTT比色试验法：培养至第7天，对同一批培养在96孔的细胞进行MTT比色试验，然后 用Bio_RAD680型酶标仪测细胞吸光度值（A值），采用检测波长570nm，参考波长630nm。结 果发现实验组和阳性对照组细胞A值明显高于空白对照组细胞，差异有统计学意义（P<0 05）；实验组与阳性对照组细胞A值比较差异无统计学意义（P>005），见表1。
因此，我们采用体外培养胚胎大鼠中脑原代细胞来观察EGC G的神经保护作用及对DA能神经元的作用。NGF是某些交感神经元和感觉神经元存活和发育所必须的生长因子，具有内源性神经保护和 修复功能，能够使PC12细胞的轴突延长[10]，因此，我们选用NGF为阳性对照药物 。本实验 结果显示：实验组和阳性对照组细胞生长旺盛，突起延长明显增多，部分交错成网。且两组 培养细胞数目明显多于空白对照组。MTT比色法检测细胞活性（A值）及TH阳性细胞计数， 实验组均显著高于空白对照组，而与阳性对照组比较无统计学意义。本实验结果提示EGCG可 提高体外培养的胚胎大鼠中脑原代细胞的活性，并能促进DA能神经细胞生长，对抗其凋亡。
参考文献
[1]Andrade JP， Assunco M.Protective effects of chronic green tea consumption on age_related neurodegeneration[J]. Curr Pharm Des，2012，18（1）：4 -14.
[2]Hou RR， Chen JZ， Chen H， et al. Neuroprotective effects of epigallocatechin _3_gallate （EGCG） on paraquat_induced apoptosis in PC12 cells[J]. Cell Biol I nt，2008，32（1）：22-30.
[3]Kim JS， Kim JM， O JJ， et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression and cell death by epigallocatechin_3_gallate， a green tea catechin， in the 1_methyl_4_phenyl_1，2，3，6_tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's d isease[J]. J Clin Neurosci，2010，17（9）：1165-1168.
[4]Hügel HM， Jackson N. Redox chemistry of green tea polyphenols： therapeuti c benefits in neurodegenerative diseases[J]. Mini Rev Med Chem，2012，12（5）：380 -387.
[5]Qin XY， Cheng Y， Yu LC. Potential protection of green tea polyphenols agai nst intracellular amyloid beta_induced toxicity on primary cultured prefrontal c ortical neurons of rats[J]. Neurosci Lett，2012，513（2）：170-173.
[6]Itoh T， Imano M， Nishida S， et al， （-）_Epigallocatechin_3_gallate increases the number of neural stem cells around the damaged area after rat traumatic bra in injury[J]. J Neural Transm，2012，119（8）：877-890.
[7]厚荣荣，陈建宗，陈宏，等.绿茶多酚主要成分对百草枯诱导PC12细胞损伤的保护作用[ J].神经解剖学杂志，2007，23（1）：83-87.
[8]Cho HS， Kim S， Lee SY， et al， Protective effect of the green tea component， L_theanine on environmental toxins_induced neuronal cell death[J]. Neurotoxic ology，2008，29（4）：656-662.
[9]Iczkiewicz J， Broom L，Cooper JD， et al， The RGD_containing peptide fragmen t of osteopontin protects tyrosine hydroxylase positive cells against toxic insu lt in primary ventral mesencephaliccultures and in the rat substantia nigra[J] . J Neurochem，2010，114（6）：1792-1804.
[10]Forloni G， Bertani I， Calella AM， et al. Alpha_synuclein and Parkinson's d isease： selective neurodegenerative effect of alpha_synuclein fragment on dopa minergic neurons in vitro and in vivo[J]. Ann Neurol，2000，47（5）：632-640.
（收稿日期：2012_12_27）
[关键词]表没食子儿茶素没食子酸脂；中脑原代培养细胞；酪氨酸 羟化酶
中图分类号：R338文献标识码：A文章编号：1009_816X （2013）02_0114_03
流行病学研究显示，长期饮用绿茶可使帕金森病（Parkinson's disease，PD）的患病率下降 [1]。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）是从绿茶中 提取的主要活性成分，是重要的天然抗氧化剂，具有明显的抗氧化作用。有研究显示，EGCG 能 透过血脑屏障，减少氧自由基所致神经细胞损伤，具有对抗氧化应激因素诱导的PC12细胞和 SH_SY5Y细胞凋亡的作用，可抑制帕金森病小鼠模型诱导型一氧化氮合酶的表达[2，3 ]，保护神经细胞，具有潜在治疗神经退行性疾病的价值[4]。然而，EGCG对原代 培养的中脑神经细胞 是否具有保护作用，目前尚未见报道。本实验旨在通过观察EGCG对胚胎大鼠中脑原代细胞及 多巴胺能神经元（dopaminergic neurons，DA）的作用，进一步探讨EGCG防治PD的可能性。
1材料和方法
12方法：
121中脑原代神经细胞的培养：将孕15d SD大鼠脱颈致死，75%乙醇浸泡消毒，超净 台内 无菌分层解剖取出子宫，用D_hanks液洗净，置于盛有D_hanks液的平皿中，剪开子宫，取出 胚胎，在解剖显微镜下轻轻剥出完整的脑组织，将腹侧面朝上，沿视神经根下沿和脑干部横 切两刀，精细解剖镊分出中脑黑质部，剔除残留脑膜及血管，将所取组织块剪碎后加入01 25%胰蛋白酶（Trypsin 1：250），于37℃ 5% CO2培养箱中温育25min，然后在完全培养液 中 放置10min，终止胰蛋白酶作用。800转/分离心5min，吸弃上悬液，加培养液。用火焰刨光 的直头滴管吹打10次，静置沉淀大的组织块，吸取上悬液，调整细胞浓度，按照2×105、 1×105细胞/孔分种于涂有多聚赖氨酸的24孔和96孔塑料培养板内，置37℃，5% CO2培 养箱内 培养。
122药物处理：培养的标本随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组，接种3天后， 细胞 更换新鲜培养液继续培养，接种第6天再换液一次，实验组换液时培养液中加终浓度为10umo l/L的EGCG，阳性对照组加入NGF（终浓度50μg/L），空白对照组加入正常培养液。
123四唑盐（MTT）比色法：培养第7天，给同一批培养在96孔的细胞中加10μL/孔MT T（ 5g/L），继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加100μL二甲基亚砜 （DMSO）溶液，终止MTT反应，振荡10分钟，使MTT反应的蓝色结晶充分溶解，然后放在Bio_ RAD680型酶标仪上测细胞吸光值（A值），采用检测波长570nm，参考波长630nm，每组各观 察25孔。
124抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫荧光染色：用95%酒精固定 培养 细胞20min，001mol/L PBS洗3×5min/次，边洗边振荡。然后滴加抗体稀释液稀释的小鼠 抗 大鼠TH抗体（1∶3000稀释），置37℃湿盒中30min，PBS洗3×5min/次，除去非特异性吸附 的抗体，减少背景染色。滴加荧光标记的羊抗小鼠IgG_FITC，置37℃湿盒中30min，PBS洗3 ×5min/次。揩干玻片周围水分，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞数，每组随机选取40个 视野。
13统计学处理：采用SPSS100版统计软件，测定值用（x-±s）表示，进行单因素方差分析。P<005为差异有统计学意 义。
2结果
21细胞形态学观察：细胞接种后，每天用Olympus倒置显微镜观察各组神经细胞的数目 及 形态变化，并拍照记录。培养的神经细胞多在接种后24h内贴壁，开始时细胞体积小，呈圆 点形，彼此分散，立体感较强。接种48h后，细胞分化呈双极、三极、多极等，形态多样， 并形成大小不等的团块。第二次换液后24h实验组及阳性对照组培养孔中细胞生长较空白对 照组旺盛，细胞胞体明显增大，细胞轴突向四周延伸，相互交错成网，进行TH免疫荧光染色 后可见TH阳性细胞呈黄绿色，TH阳性表达多在胞浆中。实验组和阳性对照组神经细胞胞体增 大呈梭形或多角形，部分呈圆形，突起延长、分支较多，TH阳性细胞数目较空白对照组多， 见图1。图1不同组别胚胎大鼠中脑原代培养细胞中TH阳性细 胞的表达22免疫细胞化学观察：培养至第7天时将标本进行TH免疫荧光染色，显示阳性反应的是 中脑DA能神经细胞，在显微镜下比较神经细胞的形态及反应程度，将各组随机选取8个孔， 每孔随机选5个视野（每个视野面积为045mm2），对标本进行TH阳性细胞记数并进行统 计学处理，发现实验组和阳性对照组TH阳性细胞数目均显著高于空白对照组，差异有统计学 意义（P<005）；实验组与阳性对照组比较，TH阳性细胞数差异无统计学意义（P >005），见表1。 23MTT比色试验法：培养至第7天，对同一批培养在96孔的细胞进行MTT比色试验，然后 用Bio_RAD680型酶标仪测细胞吸光度值（A值），采用检测波长570nm，参考波长630nm。结 果发现实验组和阳性对照组细胞A值明显高于空白对照组细胞，差异有统计学意义（P<0 05）；实验组与阳性对照组细胞A值比较差异无统计学意义（P>005），见表1。
因此，我们采用体外培养胚胎大鼠中脑原代细胞来观察EGC G的神经保护作用及对DA能神经元的作用。NGF是某些交感神经元和感觉神经元存活和发育所必须的生长因子，具有内源性神经保护和 修复功能，能够使PC12细胞的轴突延长[10]，因此，我们选用NGF为阳性对照药物 。本实验 结果显示：实验组和阳性对照组细胞生长旺盛，突起延长明显增多，部分交错成网。且两组 培养细胞数目明显多于空白对照组。MTT比色法检测细胞活性（A值）及TH阳性细胞计数， 实验组均显著高于空白对照组，而与阳性对照组比较无统计学意义。本实验结果提示EGCG可 提高体外培养的胚胎大鼠中脑原代细胞的活性，并能促进DA能神经细胞生长，对抗其凋亡。
参考文献
[1]Andrade JP， Assunco M.Protective effects of chronic green tea consumption on age_related neurodegeneration[J]. Curr Pharm Des，2012，18（1）：4 -14.
[2]Hou RR， Chen JZ， Chen H， et al. Neuroprotective effects of epigallocatechin _3_gallate （EGCG） on paraquat_induced apoptosis in PC12 cells[J]. Cell Biol I nt，2008，32（1）：22-30.
[3]Kim JS， Kim JM， O JJ， et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression and cell death by epigallocatechin_3_gallate， a green tea catechin， in the 1_methyl_4_phenyl_1，2，3，6_tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's d isease[J]. J Clin Neurosci，2010，17（9）：1165-1168.
[4]Hügel HM， Jackson N. Redox chemistry of green tea polyphenols： therapeuti c benefits in neurodegenerative diseases[J]. Mini Rev Med Chem，2012，12（5）：380 -387.
[5]Qin XY， Cheng Y， Yu LC. Potential protection of green tea polyphenols agai nst intracellular amyloid beta_induced toxicity on primary cultured prefrontal c ortical neurons of rats[J]. Neurosci Lett，2012，513（2）：170-173.
[6]Itoh T， Imano M， Nishida S， et al， （-）_Epigallocatechin_3_gallate increases the number of neural stem cells around the damaged area after rat traumatic bra in injury[J]. J Neural Transm，2012，119（8）：877-890.
[7]厚荣荣，陈建宗，陈宏，等.绿茶多酚主要成分对百草枯诱导PC12细胞损伤的保护作用[ J].神经解剖学杂志，2007，23（1）：83-87.
[8]Cho HS， Kim S， Lee SY， et al， Protective effect of the green tea component， L_theanine on environmental toxins_induced neuronal cell death[J]. Neurotoxic ology，2008，29（4）：656-662.
[9]Iczkiewicz J， Broom L，Cooper JD， et al， The RGD_containing peptide fragmen t of osteopontin protects tyrosine hydroxylase positive cells against toxic insu lt in primary ventral mesencephaliccultures and in the rat substantia nigra[J] . J Neurochem，2010，114（6）：1792-1804.
[10]Forloni G， Bertani I， Calella AM， et al. Alpha_synuclein and Parkinson's d isease： selective neurodegenerative effect of alpha_synuclein fragment on dopa minergic neurons in vitro and in vivo[J]. Ann Neurol，2000，47（5）：632-640.
（收稿日期：2012_12_27）