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摘要：
条斑紫菜是红藻门的代表性物种之一，具有重要的经济价值。但近年来，随着条斑紫菜栽培规模的持续扩大，病害发生的频率、规模和危害程度也逐年增加。本研究对紫菜腐霉的生长特性进行研究，发现其在温度28℃，盐度为20‰时生长速度最快。此外，对感染的叶片进行了病原学的研究。对条斑紫菜病害进行病原学和致病条件的研究，不仅可以为制定病害防治措施提供依据，而且也将为抗病品系的筛选提供条件。
关键词： 条斑紫菜；赤腐病；紫菜腐霉
【分类号】：S968.4
一、 背景介绍
条斑紫菜是一些独特的海洋藻类，且易通过它们的丝状体或叶状体被辨别。主要分布于南半球和北半球寒冷的北方海岸[1，2]。条斑紫菜的人工栽培产业是世界上商业价值最重要的海藻栽培产业，其中紫菜年总产值近20亿美元，中国、韩国和日本每年紫菜栽培产业的总产值已经达到14亿美元以上[3]。近年来， 我国条斑紫菜产业发展迅猛， 栽培产量逐年增加， 居世界第一位。随着养殖规模的扩大紫菜病害每年都有不同程度的发生，这些病害对紫菜产值造成严重影响。
赤腐病是严重危害条斑紫菜的一种病害，1947年日本的新崎盛德首先报导了赤腐病[4，5]，1970年由高桥实等鉴定病原菌为腐霉属新种-紫菜腐霉（Pythium porphyrae）[6]。目前关于赤腐病的研究热点主要集中在抗紫菜腐霉蛋白的分离纯化[7]。
本实验研究赤腐病的致病机理以及发病过程，对条斑紫菜病害进行病原学和致病条件的研究，不仅可以为制定病害防治措施提供依据，而且也将为抗病品系的筛选提供条件，对高产抗病品系的筛选有着不容忽视的应用价值。
二、 材料与方法
（一） 材料来源
健康的条斑紫菜叶片来自于实验室自由丝状体培养而成的，叶状体培养
条件为：温度15℃，盐度28‰-29‰，光照强度58.1μmol/m2·s-62.5μmol/m2·s，光暗周期12L：12D，每五天换一次培养基并充气培养。
紫菜腐霉菌株购自于日本生物资源库。
（二） 紫菜腐霉的培养
紫菜腐霉在玉米粉琼脂固体培养基[7]上进行划线培养，温度20℃。菌丝扩大培养时，刮取-一小块经纯化的腐霉菌丝块置于谷氨酸钠液体培养基[8]中，20℃，100 r . min-1。
（三） 不同培养条件对紫菜腐霉菌丝体生长的影响
将在固体培养基上生长5天的菌丝接种到液体培养基中，置于4℃-36℃（pH=7.5，盐度为18‰，每隔4℃设一个梯度）和盐度为5‰-50‰（pH=7.5，温度为20℃，每隔5‰设一个梯度）的恒温培养箱中，每个实验组梯度设置3个平行，每组最初起始重量为1mg（湿重）。一周后測量每个实验组的菌丝体重量。
（四） 人工感染实验及观察
将在液体培养基中生长5天的菌丝体用灭菌海水冲洗三次，并用消毒的卫生纸稍微把水吸干。称取2g菌丝（湿重）置于装有200ml灭菌海水的锥形瓶中，制成终浓度为1g/100ml 的菌丝体悬液，每组锥形瓶中放入5片健康的紫菜叶片，同时设置3个重复。此外设置一组无添加菌丝的作为对照，同时设置3个重复。将对照组和实验组置于光照培养箱中，温度15℃，盐度29‰，光照强度58.1μmol/m2·s-62.5μmol/m2·s，光暗周期12L：12D。
将对照组和实验组患病的叶片，切取正常的和患病部位叶片组织，利用Olympus CX31型显微镜观察病斑部位并做记录。
三、 结果
（一） 不同培养条件对紫菜腐霉菌丝体生长的影响
由表1可知，在液体培养基中生长一周后，紫菜腐霉菌丝体在16-36℃的温度范围内生长良好，菌丝体最适生长温度为28℃，重量达到了346.6mg，其次是24℃，重量为256.9 mg。经统计学方差分析，20℃和36℃之间的菌丝体重量有显著性差异（P<0.05），其余各组间均有极显著性差异（P<0.01）。因此，温度对紫菜腐霉菌丝体的生长有着重要的作用。由此也可推断，养殖海区的高温是紫菜腐霉大量繁殖的一个诱发因素。图1显示的是不同的温度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率。
表1 不同培养条件下紫菜腐霉菌丝体的生长
温度（℃） 菌丝重量（mg） 盐度（‰） 菌丝重量（mg）
4 2.9±0.28 5 35.5±0.96
8 6.9±0.14 10 51.1±1.83
12 14.3±0.31 15 80.4±1.48
16 31.7±0.22 20 129±1.17
20 127.1±0.20 25 92.4±1.89
24 256.9±0.25 30 75.3±2.68
28 346.6±1.10 35 71.8±1.39
32 242±1.57 40 57.2±1.99
36 125.2±1.51 45 31.7±1.43
50 21.2±1.14
图1 不同温度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率
表1可知在不同的盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的生长情况，腐霉菌丝体在10-40‰的盐度范围内生长状况良好，菌丝体最适生长盐度为20‰， 重量达到了129mg，其次是25‰，重量达到了92.4mg。经统计学方差分析，5‰和45‰之间，15‰和30‰之间以及30‰和35‰之间的菌丝体重量有显著性差异（P<0.05），其余各组间均有极显著性差异（P<0.01）。图2显示的是不同的盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率。
图2 不同盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率 （二） 人工感染实验
浓度为1g/100ml的菌丝体悬液加到紫菜培养液后，2天后出现病症。肉眼观察可以发现，病斑在藻体上出现的位置不定，叶状体的梢部、中部和基部都可以看到病斑的存在，梢部出现的病斑稍微多些。初期病斑仅为一个小锈红色斑点，病斑形状多为亚圆形或圆形，大小不同，大的可达2厘米以上，小的可到1毫米之下。多数斑点开始时仅为肉眼依稀可辨的大小，之后相互愈合连成一片。随着病情的加重，锈红色斑点逐渐变为黄绿色或淡黄色（图3-A），边缘有时稍带红色。之后大大小小的的斑点相互愈合连成一片，最后叶片颜色基本全变为绿色（图3-B），并开始出现烂洞现象，直至最后腐烂流失，从病症出现到整个叶片腐烂流失仅需要5-7天。
图3 感染赤腐病的紫菜叶片
（三） 发病进程的显微观察
光学显微镜下观察发现，出现病症的叶片出现大小不同的病斑（图4-A，图4-B），病斑处的紫菜细胞被菌丝体贯穿，这是赤腐病最显著的特征。在紫菜细胞被感染过程中，开始只有1个细胞被菌丝体穿透，和正常紫菜细胞（图4-C）比较，发生病害的细胞已经萎缩，颜色也加深，并且菌丝体继续伸长侵染临近的细胞，菌丝体会慢慢的形成分枝，这时细胞就会被两条甚至是几条菌丝体所穿透（图4-D），紫菜细胞颜色呈深红色。随着病情的加重，被菌丝体穿透的细胞周围有桃红色藻红素析出（图4-E），颜色也由深红色逐渐变为最终的黄绿色或绿色（图4-F）。最后，细胞内容物消解，只剩下一个细胞残骸。
图4 紫菜腐霉对叶状体侵染过程的观察
四、 讨论
本研究中人工感染实验可看到赤腐病呈现锈红色斑点，病斑在藻体上出现的位置不定，叶状体的梢部、中部和基部都可以看到病斑的存在，病斑颜色也随着病情的进展，从正常的紫褐色变为深红色乃至最后变为黄绿色。显微镜下观察可看到病斑处的紫菜细胞被菌丝穿透，以上这些症状与丁怀宇[9]等人的描述是一致的。
11月中旬到12月下旬期間是赤腐病的第一个高潮期。期间天气较好且水温连续几天超过18℃以上，紫菜筏架上就会出现赤腐病的病斑。病情蔓延很快，一周之内就会席卷整个养殖海区。在1-2月份期间，低温使菌丝体生长变慢，同时也使赤腐病的蔓延受到抑制。海上情况一旦合适，2-3月份气温回暖的时候病害又会蔓延开来[10]。目前紫菜养殖海区的盐度一般在25‰-33‰之间浮动，一旦有连续几天降雨，那盐度就会稍微下降，将可能会导致赤腐病的发生。本研究在紫菜腐霉菌丝体生长特性的实验结果得出菌丝体最佳生长温度为28℃， 盐度为20‰。据此可以判断，高温和低盐是诱导赤腐病发生的两个重要因素。这与Kato[11]和Sasaki[12]的研究结果是相符合的。除了高温和低盐这两个因素之外，干出不充分以及潮流不畅也是赤腐病发生的重要因素[13]。紫菜的病烂和环境条件有着密切的关系，受自然条件的左右。如气候的变化可导致一些病害的发生和蔓延。另外，养殖技术及养殖方式的不利，造成环境条件恶化，也会导致病害的发生与发展[14]。
目前，关于大型经济海藻养殖病害的研究，还是停留在病症的肉眼观察、显微镜观察和致病菌的形态描述上[15]。对于大型经济海藻的养殖病害还没有有效预防措施，只能通过加强养殖过程中的管理和环境因子等的调控来减轻病害[18]。面对紫菜病害发造成的损失，我们要加大科技投入开发出更多的抗病品系来减轻紫菜病害对紫菜产业造成的损失。
参考文献
[1] Schneider CW， Wynne MJ. A synoptic review of the classification of red algal genera a half
century after Kylin's “Die Gattungen der Rhodophyceen”. Botanica Marina， 2007， 50： 197-249.
[2] Wiencke C， Clayton M. The life history of Porphyra endiviifolium from the South Shetland Islands， Antarctica. Polar biology， 1998， 19： 257-263.
[3] Yarish C and Pereira R. Mass production of marine macroalgae， In S.E. J?rgensen and B.D. Fath （eds.） Ecological Engineering. Vol. 3. Encyclopedia of Ecology. Elsevier， Oxford， 2008， 2236–2247.
[4] Arasaki S. Studies on the rot of Porphyra tenera by a Pythium . Bull Jpn S oc Sci Fish， 1947， 13（3）： 74-90
[5] Arasaki S， Akino K， Tomiyama Y. A comparison of some physiological aspects in marine Pythium on the host and on the artificial medium. Bull Misaki Mar Biol Inst Kyoto Univ， 1968， 12： 203-206
[6] Takahashi M. Identification of genus Pythium. Plant Prot， 1970， 24 （8）： 339-346
[7] Martin FN， Kistler HC. Species-specific banding patterns of restriction endonuclease-digeste -d mitochondrial-DNA from the genus Pythium. Exp Mycol， 1990， 14： 32- 46 [8] Fujita， Y. and B. Zenitani. Studies on pathogenic Pythium of laver red rot in Ariake Sea farm-IV. Serological differentiation of pathogenic Pythium strains. Bull .Jap. Soc. Sci. Fish . 1977 b， 43： 1313-1318
[9] Ding H， Ma J. Simultaneous infection by red rot and chytrid diseases in Porphyra yezoensis Ueda. Journal of Applied Phycology， 2005， 17（1）： 51-56.
[10] 馬家海. 条斑紫菜赤腐病的初步研究. 上海水产大学学报， 1996， 5（1）： 1-7
[11] Kato， S.， Watanabe， T.， and Sato， Y. Studies on the diseases of cultural Porphra– VII. A comparison of physiological properties among the different isolates of the causal fungus of the red wasting disease. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1973， 39： 859-865
[12] Sasaki， M.， and Sakurai， Y. Comparative observations on the growth among the five strains in Pythium porphyrae under the same cultural condition. Bull. Tohoku Reg. Fish. Res. Lab. 1972， 32： 83-87
[13] Correa J A. Infectious diseases of marine algae： current knowledge and approaches. Progress in phycological research， 1997， 12： 149-180
[14] 方文雅. 紫菜与藻际微生物互作研究平台的初步研究. 宁波大学， 2010
[15] 王希华， 秦松. 褐藻愈伤组织研究. 海洋科学， 1995， 3： 17-20
条斑紫菜是红藻门的代表性物种之一，具有重要的经济价值。但近年来，随着条斑紫菜栽培规模的持续扩大，病害发生的频率、规模和危害程度也逐年增加。本研究对紫菜腐霉的生长特性进行研究，发现其在温度28℃，盐度为20‰时生长速度最快。此外，对感染的叶片进行了病原学的研究。对条斑紫菜病害进行病原学和致病条件的研究，不仅可以为制定病害防治措施提供依据，而且也将为抗病品系的筛选提供条件。
关键词： 条斑紫菜；赤腐病；紫菜腐霉
【分类号】：S968.4
一、 背景介绍
条斑紫菜是一些独特的海洋藻类，且易通过它们的丝状体或叶状体被辨别。主要分布于南半球和北半球寒冷的北方海岸[1，2]。条斑紫菜的人工栽培产业是世界上商业价值最重要的海藻栽培产业，其中紫菜年总产值近20亿美元，中国、韩国和日本每年紫菜栽培产业的总产值已经达到14亿美元以上[3]。近年来， 我国条斑紫菜产业发展迅猛， 栽培产量逐年增加， 居世界第一位。随着养殖规模的扩大紫菜病害每年都有不同程度的发生，这些病害对紫菜产值造成严重影响。
赤腐病是严重危害条斑紫菜的一种病害，1947年日本的新崎盛德首先报导了赤腐病[4，5]，1970年由高桥实等鉴定病原菌为腐霉属新种-紫菜腐霉（Pythium porphyrae）[6]。目前关于赤腐病的研究热点主要集中在抗紫菜腐霉蛋白的分离纯化[7]。
本实验研究赤腐病的致病机理以及发病过程，对条斑紫菜病害进行病原学和致病条件的研究，不仅可以为制定病害防治措施提供依据，而且也将为抗病品系的筛选提供条件，对高产抗病品系的筛选有着不容忽视的应用价值。
二、 材料与方法
（一） 材料来源
健康的条斑紫菜叶片来自于实验室自由丝状体培养而成的，叶状体培养
条件为：温度15℃，盐度28‰-29‰，光照强度58.1μmol/m2·s-62.5μmol/m2·s，光暗周期12L：12D，每五天换一次培养基并充气培养。
紫菜腐霉菌株购自于日本生物资源库。
（二） 紫菜腐霉的培养
紫菜腐霉在玉米粉琼脂固体培养基[7]上进行划线培养，温度20℃。菌丝扩大培养时，刮取-一小块经纯化的腐霉菌丝块置于谷氨酸钠液体培养基[8]中，20℃，100 r . min-1。
（三） 不同培养条件对紫菜腐霉菌丝体生长的影响
将在固体培养基上生长5天的菌丝接种到液体培养基中，置于4℃-36℃（pH=7.5，盐度为18‰，每隔4℃设一个梯度）和盐度为5‰-50‰（pH=7.5，温度为20℃，每隔5‰设一个梯度）的恒温培养箱中，每个实验组梯度设置3个平行，每组最初起始重量为1mg（湿重）。一周后測量每个实验组的菌丝体重量。
（四） 人工感染实验及观察
将在液体培养基中生长5天的菌丝体用灭菌海水冲洗三次，并用消毒的卫生纸稍微把水吸干。称取2g菌丝（湿重）置于装有200ml灭菌海水的锥形瓶中，制成终浓度为1g/100ml 的菌丝体悬液，每组锥形瓶中放入5片健康的紫菜叶片，同时设置3个重复。此外设置一组无添加菌丝的作为对照，同时设置3个重复。将对照组和实验组置于光照培养箱中，温度15℃，盐度29‰，光照强度58.1μmol/m2·s-62.5μmol/m2·s，光暗周期12L：12D。
将对照组和实验组患病的叶片，切取正常的和患病部位叶片组织，利用Olympus CX31型显微镜观察病斑部位并做记录。
三、 结果
（一） 不同培养条件对紫菜腐霉菌丝体生长的影响
由表1可知，在液体培养基中生长一周后，紫菜腐霉菌丝体在16-36℃的温度范围内生长良好，菌丝体最适生长温度为28℃，重量达到了346.6mg，其次是24℃，重量为256.9 mg。经统计学方差分析，20℃和36℃之间的菌丝体重量有显著性差异（P<0.05），其余各组间均有极显著性差异（P<0.01）。因此，温度对紫菜腐霉菌丝体的生长有着重要的作用。由此也可推断，养殖海区的高温是紫菜腐霉大量繁殖的一个诱发因素。图1显示的是不同的温度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率。
表1 不同培养条件下紫菜腐霉菌丝体的生长
温度（℃） 菌丝重量（mg） 盐度（‰） 菌丝重量（mg）
4 2.9±0.28 5 35.5±0.96
8 6.9±0.14 10 51.1±1.83
12 14.3±0.31 15 80.4±1.48
16 31.7±0.22 20 129±1.17
20 127.1±0.20 25 92.4±1.89
24 256.9±0.25 30 75.3±2.68
28 346.6±1.10 35 71.8±1.39
32 242±1.57 40 57.2±1.99
36 125.2±1.51 45 31.7±1.43
50 21.2±1.14
图1 不同温度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率
表1可知在不同的盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的生长情况，腐霉菌丝体在10-40‰的盐度范围内生长状况良好，菌丝体最适生长盐度为20‰， 重量达到了129mg，其次是25‰，重量达到了92.4mg。经统计学方差分析，5‰和45‰之间，15‰和30‰之间以及30‰和35‰之间的菌丝体重量有显著性差异（P<0.05），其余各组间均有极显著性差异（P<0.01）。图2显示的是不同的盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率。
图2 不同盐度条件下紫菜腐霉菌丝体的日增长率 （二） 人工感染实验
浓度为1g/100ml的菌丝体悬液加到紫菜培养液后，2天后出现病症。肉眼观察可以发现，病斑在藻体上出现的位置不定，叶状体的梢部、中部和基部都可以看到病斑的存在，梢部出现的病斑稍微多些。初期病斑仅为一个小锈红色斑点，病斑形状多为亚圆形或圆形，大小不同，大的可达2厘米以上，小的可到1毫米之下。多数斑点开始时仅为肉眼依稀可辨的大小，之后相互愈合连成一片。随着病情的加重，锈红色斑点逐渐变为黄绿色或淡黄色（图3-A），边缘有时稍带红色。之后大大小小的的斑点相互愈合连成一片，最后叶片颜色基本全变为绿色（图3-B），并开始出现烂洞现象，直至最后腐烂流失，从病症出现到整个叶片腐烂流失仅需要5-7天。
图3 感染赤腐病的紫菜叶片
（三） 发病进程的显微观察
光学显微镜下观察发现，出现病症的叶片出现大小不同的病斑（图4-A，图4-B），病斑处的紫菜细胞被菌丝体贯穿，这是赤腐病最显著的特征。在紫菜细胞被感染过程中，开始只有1个细胞被菌丝体穿透，和正常紫菜细胞（图4-C）比较，发生病害的细胞已经萎缩，颜色也加深，并且菌丝体继续伸长侵染临近的细胞，菌丝体会慢慢的形成分枝，这时细胞就会被两条甚至是几条菌丝体所穿透（图4-D），紫菜细胞颜色呈深红色。随着病情的加重，被菌丝体穿透的细胞周围有桃红色藻红素析出（图4-E），颜色也由深红色逐渐变为最终的黄绿色或绿色（图4-F）。最后，细胞内容物消解，只剩下一个细胞残骸。
图4 紫菜腐霉对叶状体侵染过程的观察
四、 讨论
本研究中人工感染实验可看到赤腐病呈现锈红色斑点，病斑在藻体上出现的位置不定，叶状体的梢部、中部和基部都可以看到病斑的存在，病斑颜色也随着病情的进展，从正常的紫褐色变为深红色乃至最后变为黄绿色。显微镜下观察可看到病斑处的紫菜细胞被菌丝穿透，以上这些症状与丁怀宇[9]等人的描述是一致的。
11月中旬到12月下旬期間是赤腐病的第一个高潮期。期间天气较好且水温连续几天超过18℃以上，紫菜筏架上就会出现赤腐病的病斑。病情蔓延很快，一周之内就会席卷整个养殖海区。在1-2月份期间，低温使菌丝体生长变慢，同时也使赤腐病的蔓延受到抑制。海上情况一旦合适，2-3月份气温回暖的时候病害又会蔓延开来[10]。目前紫菜养殖海区的盐度一般在25‰-33‰之间浮动，一旦有连续几天降雨，那盐度就会稍微下降，将可能会导致赤腐病的发生。本研究在紫菜腐霉菌丝体生长特性的实验结果得出菌丝体最佳生长温度为28℃， 盐度为20‰。据此可以判断，高温和低盐是诱导赤腐病发生的两个重要因素。这与Kato[11]和Sasaki[12]的研究结果是相符合的。除了高温和低盐这两个因素之外，干出不充分以及潮流不畅也是赤腐病发生的重要因素[13]。紫菜的病烂和环境条件有着密切的关系，受自然条件的左右。如气候的变化可导致一些病害的发生和蔓延。另外，养殖技术及养殖方式的不利，造成环境条件恶化，也会导致病害的发生与发展[14]。
目前，关于大型经济海藻养殖病害的研究，还是停留在病症的肉眼观察、显微镜观察和致病菌的形态描述上[15]。对于大型经济海藻的养殖病害还没有有效预防措施，只能通过加强养殖过程中的管理和环境因子等的调控来减轻病害[18]。面对紫菜病害发造成的损失，我们要加大科技投入开发出更多的抗病品系来减轻紫菜病害对紫菜产业造成的损失。
参考文献
[1] Schneider CW， Wynne MJ. A synoptic review of the classification of red algal genera a half
century after Kylin's “Die Gattungen der Rhodophyceen”. Botanica Marina， 2007， 50： 197-249.
[2] Wiencke C， Clayton M. The life history of Porphyra endiviifolium from the South Shetland Islands， Antarctica. Polar biology， 1998， 19： 257-263.
[3] Yarish C and Pereira R. Mass production of marine macroalgae， In S.E. J?rgensen and B.D. Fath （eds.） Ecological Engineering. Vol. 3. Encyclopedia of Ecology. Elsevier， Oxford， 2008， 2236–2247.
[4] Arasaki S. Studies on the rot of Porphyra tenera by a Pythium . Bull Jpn S oc Sci Fish， 1947， 13（3）： 74-90
[5] Arasaki S， Akino K， Tomiyama Y. A comparison of some physiological aspects in marine Pythium on the host and on the artificial medium. Bull Misaki Mar Biol Inst Kyoto Univ， 1968， 12： 203-206
[6] Takahashi M. Identification of genus Pythium. Plant Prot， 1970， 24 （8）： 339-346
[7] Martin FN， Kistler HC. Species-specific banding patterns of restriction endonuclease-digeste -d mitochondrial-DNA from the genus Pythium. Exp Mycol， 1990， 14： 32- 46 [8] Fujita， Y. and B. Zenitani. Studies on pathogenic Pythium of laver red rot in Ariake Sea farm-IV. Serological differentiation of pathogenic Pythium strains. Bull .Jap. Soc. Sci. Fish . 1977 b， 43： 1313-1318
[9] Ding H， Ma J. Simultaneous infection by red rot and chytrid diseases in Porphyra yezoensis Ueda. Journal of Applied Phycology， 2005， 17（1）： 51-56.
[10] 馬家海. 条斑紫菜赤腐病的初步研究. 上海水产大学学报， 1996， 5（1）： 1-7
[11] Kato， S.， Watanabe， T.， and Sato， Y. Studies on the diseases of cultural Porphra– VII. A comparison of physiological properties among the different isolates of the causal fungus of the red wasting disease. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1973， 39： 859-865
[12] Sasaki， M.， and Sakurai， Y. Comparative observations on the growth among the five strains in Pythium porphyrae under the same cultural condition. Bull. Tohoku Reg. Fish. Res. Lab. 1972， 32： 83-87
[13] Correa J A. Infectious diseases of marine algae： current knowledge and approaches. Progress in phycological research， 1997， 12： 149-180
[14] 方文雅. 紫菜与藻际微生物互作研究平台的初步研究. 宁波大学， 2010
[15] 王希华， 秦松. 褐藻愈伤组织研究. 海洋科学， 1995， 3： 17-20