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摘要[目的]研究乳制品中芽孢杆菌的生物学特性，为控制当地乳制品生产中芽孢杆菌所引起的质量问题提供理论依据。[方法]以内蒙古牧场的乳制品为原料，分离纯化了40株芽孢杆菌，对其进行了菌落和菌体的形态学鉴定并研究其生物学特性。[结果]试验发现，芽孢杆菌菌株革兰氏染色反应为阳性，大部分有荚膜菌体呈杆状，两端钝圆，长 1.5～6.5 μm，宽 0.5～3.5 μm，芽孢椭圆形，中生、近中生或偏端，孢囊大多数明显膨大，少数不明显膨大或不膨大。最高生长温度为60℃，最低为10 ℃，大部分为需氧菌，少数为厌氧菌， NaCl浓度大于10%将抑制其生长，pH在5.7时部分不发生反应，部分糖分有益于芽孢的生长。[结论]研究证明了营养物质、氧气、pH 的控制将有效抑制芽孢杆菌的生长，从而提高乳制品的质量。
关键词原料乳；芽孢杆菌；形态特性；生理生化
中图分类号S879文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04426-02
On Biological Characteristics of Bacillus in Raw Milk
LI Xiaokun et al（School of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）
Abstract[Objective] To study biological characteristics of Bacillus in raw milk， and provide theoretical reference for controlling quality problems caused by Bacillus. [Method] With dairy products from Inner Mongolia as raw material， 40 strains of Bacillus were isolated and purified， the morphology of colony and mycelia was identified， the biological characteristics were studied. [Result] The experiment showed that Gram staining reaction of Bacillus is positive， the length is 1.5-6.5 μm， width 0.5-3.5 μm. The highest growth temperature is 60 ℃，the lowest temperature is 10 ℃， the majority is aerobic bacteria and the minority is anaerobic bacteria. >10% NaCl could inhibit the growth， no reaction when pH is 5.7. [Conclusion] It was proved that the control of nutrients， oxygen and pH can effectively inhibit the growth of Bacillus， so as to improve quality of dairy products.
Key wordsRaw milk； Bacillus； Morphological characteristics； Physiological and biochemical characteristics
随着我国经济水平迅猛提升，人们更加注重饮食的质量及其对身体的影响。牛乳作为健康营养食品，广受消费者青睐。虽然牛乳是很好的营养产品，但同时也是培养微生物的温床。牛乳中的细菌能够分解、利用乳制品中营养物质，最终使乳制品腐败变质[1-3]。其中芽孢杆菌污染最为严重，在生乳中检出率最高[4]。细菌中芽孢杆菌的大量繁殖，使得其即使在高温下，依然产生酸味和腐败味，不但影响口感，更加影响健康。如何有效抑制耐热芽孢杆菌的繁殖，减少其产生，是目前乳制品行业亟需解决的关键问题。笔者将产自内蒙古地区的从原料乳到成品乳中各个过程的乳品进行调查取样，对其中芽孢杆菌的部分生物学特性进行研究，试图发现当地乳品中芽孢杆菌的特性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源。供试乳品样本采集于原料乳和乳品企业的低温存储原料乳、巴士杀毒前、巴士杀毒后和超高温灭菌后4个主要生产环节。
1.1.2主要材料[5-7]。主要化学药品：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、溴甲酚紫、苯酚、无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、琼脂粉、脱脂乳粉。主要试剂：酵母膏，糖或醇类，溴甲酚紫酒精液，琼脂，硝酸盐还原试验A、B液（A液对氨基苯磺酸 0.5 g、10%稀醋酸 150 ml，B液 a萘胺 0.1%、蒸馏水 20 ml、10%稀醋酸150 ml）等。主要培养基：糖发酵培养基，脱脂乳培养基，营养琼脂平板，斜面培养基等。
1.2方法
1.2.1菌株的分离纯化。工艺流程如下：无菌方法采集乳样→划线接种琼脂培养基→恒温培养→挑取单个菌落→涂片→革兰氏染色→镜检（革兰氏染色阳性、产芽孢的菌）→平板划线纯分离。
1.2.2芽孢杆菌的鉴定方法。
1.2.2.1形态鉴定。菌落形態鉴定：待鉴定细菌→琼脂培养基→平板划线→观察培养→大小、表面、形状、边缘等特性。菌体形态鉴定：菌体→普通染色→革兰氏染色→芽孢染色→观察→形状、菌体中的位置、孢囊是否膨大等特性。 1.2.2.2生理生化特性。发育温度试验方法：将培养的幼龄菌接种到普通肉汤培养基中，分别置于不同温度下培养，观察菌株的生长状况。需氧性测定试验：在37和 50 ℃的恒温下，将接种到普通琼脂斜面上的幼龄菌置于厌氧罐培养。观察菌的生长状况，不生长为需氧菌，生长为厌氧菌。耐盐性试验方法：在37和 50 ℃的恒温下，将配制不同浓度NaCl普通肉汤培养基接入到等量的待鉴定菌悬液中观察并与未接菌的空白作对照。耐酸性试验方法：将菌悬液接种于pH 5.7和7.2的营养肉汤中，适温培养后观察菌体的生长情况。糖发酵试验：将接种在培养基中幼龄菌适温培养1、2、4、7、14 d后观察，指示剂由紫变黄，表示糖类发酵产酸；如有气泡，则表示糖类发酵产气。硝酸盐还原试验：将接种于硝酸盐液体培养基中菌株培养2 d后取空试管倒入A液、B液各1滴。在不接种的对照管中同样加入A液、B 液各1滴，观察培养液的颜色。
2结果与分析
2.1形态特征通过以上方法进行试验分离并选取了40株芽孢杆菌进行观察，菌株革兰氏染色反应为阳性，大部分有荚膜菌体呈杆状，两端钝圆，长 1.5～6.5 μm，宽 0.5～3.5 μm，芽孢椭圆形，中生、近中生或偏端，孢囊大多数明显膨大，少数不明显膨大或不膨大。其中部分芽孢杆菌的菌落、菌体形态及培养特征见表1。
2.2生理生化特性通过对芽孢杆菌的发育温度、耐盐性
3结论与讨论
根据对4个阶段的40株芽孢杆菌的分析观察，其中革兰氏反应均为阳性，形态为芽孢为椭圆形或圆形，芽孢在中生或近中生，周围有鞭毛，符合了芽孢杆菌的形态特性和生理特征，应当确定为芽孢杆菌属。
影响芽孢形成的因素繁多，而根据该试验可知最主要的几个因素有：①营养物质。外源营养物的缺乏有助于芽孢的形成，如果补充葡萄糖或某些氨基酸等物质，增加碳源、氮源或磷酸盐等可有效抑制芽孢形成。②氧气。试验结果表明，有些芽孢在有氧条件下形成有些却在无氧条件下形成，控制溶氧量将对芽孢的形成产生重要影响。③pH。经测试，当地乳品中pH为6.6～6.8，最适芽孢生长，超过这个pH将有效抑制芽孢形成。
该试验通过在内蒙古地区选取从原料乳、巴士杀毒前、巴士杀毒后和超高温灭菌后4个阶段的40株芽孢杆菌作为研究菌株，对其菌落和菌体的形态进行了研究，并对其生理生化特征进行了鉴定，找出内蒙古地区乳品中芽孢杆菌特性，并得出抑制芽孢形成的因素。希望通过进一步的研究，找出解决当地乳品工业中由芽孢杆菌导致的质量问题，以期为今后的研究提供理论依据，从而提高乳制品质量。
参考文献
[1] 骆承序.喝牛奶还是喝巴氏杀菌奶比较好[J].中国乳业，2003，15（3）：26-28.
[2] 谢继志.液态乳制品科学与技术[M].北京：中国轻工业出版社，1999.
[3] 陆东林.谈谈巴氏杀菌奶和超高温灭菌奶[J].新疆畜牧业，2003（4）：11.
[4] 任俊琦，贺稚非，赵季，等.乳品中芽孢杆菌[J].肉类研究，2009（7）：70-73.
[5] R·E 布坎南.伯杰氏细菌鉴定手册[K].8版.北京：中国农业出版社，1995：256-268.
[6] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社，1995：101-118.
[7] 殷文政，孟和畢力格，李少英.食品微生物学实验指导[M].呼和浩特：内蒙古农业大学出版社，2003：24-38.
关键词原料乳；芽孢杆菌；形态特性；生理生化
中图分类号S879文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04426-02
On Biological Characteristics of Bacillus in Raw Milk
LI Xiaokun et al（School of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）
Abstract[Objective] To study biological characteristics of Bacillus in raw milk， and provide theoretical reference for controlling quality problems caused by Bacillus. [Method] With dairy products from Inner Mongolia as raw material， 40 strains of Bacillus were isolated and purified， the morphology of colony and mycelia was identified， the biological characteristics were studied. [Result] The experiment showed that Gram staining reaction of Bacillus is positive， the length is 1.5-6.5 μm， width 0.5-3.5 μm. The highest growth temperature is 60 ℃，the lowest temperature is 10 ℃， the majority is aerobic bacteria and the minority is anaerobic bacteria. >10% NaCl could inhibit the growth， no reaction when pH is 5.7. [Conclusion] It was proved that the control of nutrients， oxygen and pH can effectively inhibit the growth of Bacillus， so as to improve quality of dairy products.
Key wordsRaw milk； Bacillus； Morphological characteristics； Physiological and biochemical characteristics
随着我国经济水平迅猛提升，人们更加注重饮食的质量及其对身体的影响。牛乳作为健康营养食品，广受消费者青睐。虽然牛乳是很好的营养产品，但同时也是培养微生物的温床。牛乳中的细菌能够分解、利用乳制品中营养物质，最终使乳制品腐败变质[1-3]。其中芽孢杆菌污染最为严重，在生乳中检出率最高[4]。细菌中芽孢杆菌的大量繁殖，使得其即使在高温下，依然产生酸味和腐败味，不但影响口感，更加影响健康。如何有效抑制耐热芽孢杆菌的繁殖，减少其产生，是目前乳制品行业亟需解决的关键问题。笔者将产自内蒙古地区的从原料乳到成品乳中各个过程的乳品进行调查取样，对其中芽孢杆菌的部分生物学特性进行研究，试图发现当地乳品中芽孢杆菌的特性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源。供试乳品样本采集于原料乳和乳品企业的低温存储原料乳、巴士杀毒前、巴士杀毒后和超高温灭菌后4个主要生产环节。
1.1.2主要材料[5-7]。主要化学药品：磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、溴甲酚紫、苯酚、无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、琼脂粉、脱脂乳粉。主要试剂：酵母膏，糖或醇类，溴甲酚紫酒精液，琼脂，硝酸盐还原试验A、B液（A液对氨基苯磺酸 0.5 g、10%稀醋酸 150 ml，B液 a萘胺 0.1%、蒸馏水 20 ml、10%稀醋酸150 ml）等。主要培养基：糖发酵培养基，脱脂乳培养基，营养琼脂平板，斜面培养基等。
1.2方法
1.2.1菌株的分离纯化。工艺流程如下：无菌方法采集乳样→划线接种琼脂培养基→恒温培养→挑取单个菌落→涂片→革兰氏染色→镜检（革兰氏染色阳性、产芽孢的菌）→平板划线纯分离。
1.2.2芽孢杆菌的鉴定方法。
1.2.2.1形态鉴定。菌落形態鉴定：待鉴定细菌→琼脂培养基→平板划线→观察培养→大小、表面、形状、边缘等特性。菌体形态鉴定：菌体→普通染色→革兰氏染色→芽孢染色→观察→形状、菌体中的位置、孢囊是否膨大等特性。 1.2.2.2生理生化特性。发育温度试验方法：将培养的幼龄菌接种到普通肉汤培养基中，分别置于不同温度下培养，观察菌株的生长状况。需氧性测定试验：在37和 50 ℃的恒温下，将接种到普通琼脂斜面上的幼龄菌置于厌氧罐培养。观察菌的生长状况，不生长为需氧菌，生长为厌氧菌。耐盐性试验方法：在37和 50 ℃的恒温下，将配制不同浓度NaCl普通肉汤培养基接入到等量的待鉴定菌悬液中观察并与未接菌的空白作对照。耐酸性试验方法：将菌悬液接种于pH 5.7和7.2的营养肉汤中，适温培养后观察菌体的生长情况。糖发酵试验：将接种在培养基中幼龄菌适温培养1、2、4、7、14 d后观察，指示剂由紫变黄，表示糖类发酵产酸；如有气泡，则表示糖类发酵产气。硝酸盐还原试验：将接种于硝酸盐液体培养基中菌株培养2 d后取空试管倒入A液、B液各1滴。在不接种的对照管中同样加入A液、B 液各1滴，观察培养液的颜色。
2结果与分析
2.1形态特征通过以上方法进行试验分离并选取了40株芽孢杆菌进行观察，菌株革兰氏染色反应为阳性，大部分有荚膜菌体呈杆状，两端钝圆，长 1.5～6.5 μm，宽 0.5～3.5 μm，芽孢椭圆形，中生、近中生或偏端，孢囊大多数明显膨大，少数不明显膨大或不膨大。其中部分芽孢杆菌的菌落、菌体形态及培养特征见表1。
2.2生理生化特性通过对芽孢杆菌的发育温度、耐盐性
3结论与讨论
根据对4个阶段的40株芽孢杆菌的分析观察，其中革兰氏反应均为阳性，形态为芽孢为椭圆形或圆形，芽孢在中生或近中生，周围有鞭毛，符合了芽孢杆菌的形态特性和生理特征，应当确定为芽孢杆菌属。
影响芽孢形成的因素繁多，而根据该试验可知最主要的几个因素有：①营养物质。外源营养物的缺乏有助于芽孢的形成，如果补充葡萄糖或某些氨基酸等物质，增加碳源、氮源或磷酸盐等可有效抑制芽孢形成。②氧气。试验结果表明，有些芽孢在有氧条件下形成有些却在无氧条件下形成，控制溶氧量将对芽孢的形成产生重要影响。③pH。经测试，当地乳品中pH为6.6～6.8，最适芽孢生长，超过这个pH将有效抑制芽孢形成。
该试验通过在内蒙古地区选取从原料乳、巴士杀毒前、巴士杀毒后和超高温灭菌后4个阶段的40株芽孢杆菌作为研究菌株，对其菌落和菌体的形态进行了研究，并对其生理生化特征进行了鉴定，找出内蒙古地区乳品中芽孢杆菌特性，并得出抑制芽孢形成的因素。希望通过进一步的研究，找出解决当地乳品工业中由芽孢杆菌导致的质量问题，以期为今后的研究提供理论依据，从而提高乳制品质量。
参考文献
[1] 骆承序.喝牛奶还是喝巴氏杀菌奶比较好[J].中国乳业，2003，15（3）：26-28.
[2] 谢继志.液态乳制品科学与技术[M].北京：中国轻工业出版社，1999.
[3] 陆东林.谈谈巴氏杀菌奶和超高温灭菌奶[J].新疆畜牧业，2003（4）：11.
[4] 任俊琦，贺稚非，赵季，等.乳品中芽孢杆菌[J].肉类研究，2009（7）：70-73.
[5] R·E 布坎南.伯杰氏细菌鉴定手册[K].8版.北京：中国农业出版社，1995：256-268.
[6] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社，1995：101-118.
[7] 殷文政，孟和畢力格，李少英.食品微生物学实验指导[M].呼和浩特：内蒙古农业大学出版社，2003：24-38.