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【摘 要】目的：研究六味地黄汤（煎剂）及其加味枸杞子、六味地黄丸对生精障碍大鼠的精子与相关生殖激素的影响。方法：以醋酸棉酚建造生精障碍模型大鼠，以六味地黄汤及其加味方枸杞子、六味地黄丸灌胃治疗，考察实验组大鼠的精子数量、质量、血清T、FSH、LH水平。结果：实验组大鼠的精子数量与模型组比较有显著性差异（P<0.01），精子爬高与模型组比较有显著性差异（P<0.05），实验组T、FSH、LH水平与模型组比较有显著性差异（P<0.01，P<0.05）。结论：六味地黄汤及其加味枸杞子可显著促进生精障碍大鼠睾丸精子的发生、提高精子的质量；同时提高模型组大鼠血清的T、LH水平、降低FSH水平。
【关键词】六味地黄汤；枸杞子；大鼠；精子；生殖激素
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0575—02
男性不育症是现代社会男性一种重要的身心疾患，它给男性带来了沉重的心理枷锁，不仅影响到婚姻、家庭、社会的稳定，而且也影响我们人类社会自身的生存繁衍和发展。
六味地黄汤（丸）（简称LW）是滋阴补肾的经典名方，其功效是滋阴补肾，兼益肝阴，主治肾阴不足等。据《仁术便览》载：“六味地黄丸（汤），男妇俱宜服。东垣治妇人阴血不足无子者，服之能使胎孕。” 现代临床实践表明六味地黄丸（汤）治疗少、弱精子的男性不育症疗效显著，但对其机理尚未明了[1-5]。枸杞子滋补肝肾，主治虚劳精亏，血虚萎黄，是治疗男性不育的主要中药之一。本研究建造生精障碍模型大鼠，研究六味地黄汤及其加味枸杞子对生精障碍大鼠的精子及生殖内分泌激素的影响，报道如下。
1材料与方法
1.1药品、试剂与仪器
促黄体生成激素（LH）、促卵泡刺激素（FSH）、睾酮（Testosterone）放射免疫检测试剂盒：天津德普生物技术和医学产品有限公司；氯化钾、果糖、磷酸二氢钾、苦味酸、等，AR级，均为国产。
市售六味地黄丸：河南宛西制药厂生产，浓缩丸，每8丸含生药3g；醋酸棉酚（Gossypol acetate）：国产，纯度99.9%（HPLC法）；枸杞子等药材购自中药饮片有限公司，符合《中国药典》规定。
Olympus光学显微镜、Olympus BX60F5型摄影显微镜：均为日本Olympus Optical Co.Ltd生产；SN-695B型智能放免测量仪：上海原子核研究所日环仪器一厂。
1.2 实验动物
Wistar雄性大鼠50只，清洁级，体质量140～160g。
1.3 实验方法
1.3.1 实验药剂的制备
LW煎剂：按LW复方，取各药材粉碎过30目筛，准确称取各药材，加5～7倍量去离子水，沸水合煎60min，共3次，合并上清，55～60℃浓缩，制备成1.0g生药/ml。冷藏，备用。LW加味枸杞子方煎剂的制备同上。
LW丸溶解液：LW丸加3～4倍量去离子水，充分溶解，制成1.0g生药/ml。冷藏，备用。
实验中使用的Bouins液、精子营养液等参照有关文献配制。
1. 3.2 生精障碍大鼠模型的建造与治疗
Wistar雄性大鼠适应性饲养2天后随机分为正常对照组（10只）和建造模型组（40只）。
以醋酸棉酚按50mg/kg体质量灌胃，隔日一次，连续2周，建造大鼠生精障碍模型。
将40只生精障碍模型大鼠再随机分为模型组、LW煎剂组、LW丸剂组、LW加枸杞子组，每组10只。实验组按10.0g生药/kg体质量，分别给以相应的药物灌胃；正常对照组、模型组给以等量的生理盐水灌胃；每日一次，连续3周。
1.3.3 实验大鼠的处理及相关检测
各组大鼠于末次给药2h后，眼眶取血于洁净的玻璃试管中，静置，待血液凝固，离心，取血清，冷藏，待测。立即处死大鼠，剖腹取出睾丸、附睾，剔除脂肪和结缔组织，吸干血液、组织液，电子天平称重。
取附睾尾部，计数精子并观察其活力情况；同时做精子爬高试验，记录精子30分鐘的爬高距离，以考察精子的质量。
放射免疫测定法（Radioimmunoassay，RIA）测定大鼠血清生殖激素T、FSH、LH。以t检验比较各实验组与模型组之间的差异。
2结果与分析
2.1 对实验大鼠的性器官、精子的影响
2.1.1 对实验大鼠生殖器官重量的影响
LW及其加味枸杞子方均能使实验组大鼠睾丸、附睾重量增加，不同组增幅不同，详见表1。
2.1.2 对实验大鼠精子的数量和质量的影响
Wistar大鼠以醋酸棉酚建造成生精障碍后，经LW不同剂型及其加味方治疗，实验各组的精子数量和质量均有显著改变，详见表2。
实验表明：模型组的精子数量显著低于正常对照组和LW各组，有非常显著性差异（P<0.01）；模型组精子30分钟爬高距离显著低于正常对照组和LW各组，差异有显著性（P<0.01， P<0.05）；模型组的精子指数与正常对照组、LW各组比较，有非常显著性差异（P<0.01），而LW加味枸杞子组对精子数和精子指数作用与LW不同剂型组比较亦有显著差异（P<0.01）。实验表明模型组大鼠睾丸的生精能力最差，而经LW各组治疗后，生精功能明显增强，以LW加味枸杞子方组最为显著。
精子活力观察：在精子计数之前在显微镜下观察精子的活力，模型组精子活力很差，a级精子很少，绝大多数精子原地缓慢移动；而正常对照组、LW不同剂型组和LW加味枸杞子组的精子活力明显优于模型组，精子活跃，多数直线运动，a级精子明显增多。
2.2 LW及其加味枸杞子对雄性大鼠生殖激素的影响 LW不同剂型及其加味枸杞子可显著影响实验各组大鼠的生殖内分泌激素水平，详见表3。
模型组大鼠血清的睾酮（T）水平显著低于正常对照组、LW煎剂和LW加味枸杞子组（P<0.01），LW煎剂组和LW加味组组间无显著性差异（P>0.05）。表明LW煎剂及其加味枸杞子可显著地提高生精障碍大鼠血清的睾酮水平。
模型组大鼠血清的促黄体生成素（LH）水平低于正常对照组和LW治疗后各实验组，有显著性差异（P<0.01）。LW不同剂型组和LW加味枸杞子组组间无显著性差异（P>0.05）。表明LW不同剂型及其加味枸杞子均可显著地提高生精障碍大鼠血清的LH水平。
模型组大鼠血清的促卵泡刺激素（FSH）水平高于正常对照组、LW煎剂和LW加味枸杞子治疗组（P<0.01，P<0.05），表明LW煎剂及其加味枸杞子可显著地降低生精障碍大鼠血清的FSH水平。
实验表明，LW丸剂对实验雄性大鼠生殖内分泌激素调节作用明显低于LW煎剂和LW加味枸杞子煎剂。
3讨论
棉酚的雄性抗生育作用主要是其能抑制精子的发生[6]。本实验模型组的精子数量、质量与正常对照组比较，均有显著性差异（P<0.01，P<0.05），表明用醋酸棉酚建造的大鼠生精障碍模型获得成功。
3.1对实验大鼠的性器官、精子的影响
睾丸与附睾的重量、精子的数量是睾丸生精功能的直接反映，本实验精子计数结果：模型组大鼠的精子数量最少，显著低于各LW给药实验组，有非常显著性差异（P<0.01），说明大鼠生精障碍大鼠经各LW给药组治疗后，睾丸的生精功能明显改善。
精子活力是精子质量的重要表现，显微镜下观察精子的活力情况，结果表明：模型组的精子较少，活动情况很差，大多数精子仅有缓慢的蠕动。各给药实验组的精子数量明显多于模型组，活力也明显优于模型组，大多数精子活跃地运动，a、b级精子显著增多。
精子爬高试验是评价精子活力（质量）的有效的方法[7]。实验结果表明：正常对照组和LW给药实验各组精子30分钟爬高均高于模型组，与模型组比较有显著性差异（P<0.01，P<0.05），LW各剂型及LW加味枸杞子组之间无显著差异。表明LW各剂型及其加味枸杞子均可显著提高实验大鼠精子的数量和质量。
3.2对雄性大鼠生殖内分泌激素的影响
生殖内分泌功能在男性不育中发挥重要作用。精子的发生是在下丘脑—垂体—睾丸的内分泌系统调控下进行的。
实验结果显示模型组的T水平显著低于正常对照组（P<0.01），说明醋酸棉酚损害了睾丸Leydig细胞的功能。LW煎剂及其加味方可使生精障碍大鼠血清的LH、T水平显著升高（P<0.01），FSH降低，说明LW煎剂及其加味方可能是通过调节下丘脑—垂体—睾丸轴，调节垂体FSH、LH的释放，激活下丘脑—垂体—睾丸轴的调节功能，使T维持在较高的水平，从而使精母细胞的减数分裂和精子的产生有了内分泌激素的保障，进一步促进生精障碍大鼠睾丸内精子的发生[8]。
3.3 LW不同剂型及其加味枸杞子对实验性生精障碍大鼠的治疗效果
本实验结果表明LW不同剂型和LW加味枸杞子对实验性生精障碍大鼠治疗后的性器官、精子质量与数量、生殖内分泌激素等指标综合判断，LW煎剂和LW加味枸杞子煎剂的疗效优于LW丸剂，以LW加味枸杞子煎剂的疗效最佳。实验結果提示有进一步深入研究的意义。
参考文献：
[1] 靳风烁，方玉华，邓晓洪.克罗米芬和六味地黄丸治疗男性不育的临床观察[J].中西医结合杂志，1991，11（6）：368-369.
[2] 王玉仁，鲁守彬.六味地黄汤加减治疗男性不育症30例[J].湖北中医杂志，1996，2：24-25.
[3] 李文献，宋向华.液化生精丸治疗男性不育症[J].河南中医，2002，22（5）：67-68.
[4] 王瑞林，战为平.六味地黄丸系列及氯米酚治疗排卵障碍不孕25例疗效与B超观察[J].吉林中医药，2000，20（4）：34.
[5] 王书鸿.六味地黄丸和其衍生方在临床上的应用[J].广西医学院学报，1985，2（3）：70.
[6] 薛社普，梁德才，刘 裕.男用节育药棉酚的实验研究[M].北京：人民卫生出版社，1983，2-66.
[7] 方奉谁.精子爬高实验在常规检验中的地位[J].广西医学，1991，13（6）：393-395.
[8] 史小林主编.人类生殖学[M].北京：科学出版社，2002：347-362.
作者简介：
朱 瑞（1984- ），女，安徽寿县人，学士，助理实验师。
【关键词】六味地黄汤；枸杞子；大鼠；精子；生殖激素
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0575—02
男性不育症是现代社会男性一种重要的身心疾患，它给男性带来了沉重的心理枷锁，不仅影响到婚姻、家庭、社会的稳定，而且也影响我们人类社会自身的生存繁衍和发展。
六味地黄汤（丸）（简称LW）是滋阴补肾的经典名方，其功效是滋阴补肾，兼益肝阴，主治肾阴不足等。据《仁术便览》载：“六味地黄丸（汤），男妇俱宜服。东垣治妇人阴血不足无子者，服之能使胎孕。” 现代临床实践表明六味地黄丸（汤）治疗少、弱精子的男性不育症疗效显著，但对其机理尚未明了[1-5]。枸杞子滋补肝肾，主治虚劳精亏，血虚萎黄，是治疗男性不育的主要中药之一。本研究建造生精障碍模型大鼠，研究六味地黄汤及其加味枸杞子对生精障碍大鼠的精子及生殖内分泌激素的影响，报道如下。
1材料与方法
1.1药品、试剂与仪器
促黄体生成激素（LH）、促卵泡刺激素（FSH）、睾酮（Testosterone）放射免疫检测试剂盒：天津德普生物技术和医学产品有限公司；氯化钾、果糖、磷酸二氢钾、苦味酸、等，AR级，均为国产。
市售六味地黄丸：河南宛西制药厂生产，浓缩丸，每8丸含生药3g；醋酸棉酚（Gossypol acetate）：国产，纯度99.9%（HPLC法）；枸杞子等药材购自中药饮片有限公司，符合《中国药典》规定。
Olympus光学显微镜、Olympus BX60F5型摄影显微镜：均为日本Olympus Optical Co.Ltd生产；SN-695B型智能放免测量仪：上海原子核研究所日环仪器一厂。
1.2 实验动物
Wistar雄性大鼠50只，清洁级，体质量140～160g。
1.3 实验方法
1.3.1 实验药剂的制备
LW煎剂：按LW复方，取各药材粉碎过30目筛，准确称取各药材，加5～7倍量去离子水，沸水合煎60min，共3次，合并上清，55～60℃浓缩，制备成1.0g生药/ml。冷藏，备用。LW加味枸杞子方煎剂的制备同上。
LW丸溶解液：LW丸加3～4倍量去离子水，充分溶解，制成1.0g生药/ml。冷藏，备用。
实验中使用的Bouins液、精子营养液等参照有关文献配制。
1. 3.2 生精障碍大鼠模型的建造与治疗
Wistar雄性大鼠适应性饲养2天后随机分为正常对照组（10只）和建造模型组（40只）。
以醋酸棉酚按50mg/kg体质量灌胃，隔日一次，连续2周，建造大鼠生精障碍模型。
将40只生精障碍模型大鼠再随机分为模型组、LW煎剂组、LW丸剂组、LW加枸杞子组，每组10只。实验组按10.0g生药/kg体质量，分别给以相应的药物灌胃；正常对照组、模型组给以等量的生理盐水灌胃；每日一次，连续3周。
1.3.3 实验大鼠的处理及相关检测
各组大鼠于末次给药2h后，眼眶取血于洁净的玻璃试管中，静置，待血液凝固，离心，取血清，冷藏，待测。立即处死大鼠，剖腹取出睾丸、附睾，剔除脂肪和结缔组织，吸干血液、组织液，电子天平称重。
取附睾尾部，计数精子并观察其活力情况；同时做精子爬高试验，记录精子30分鐘的爬高距离，以考察精子的质量。
放射免疫测定法（Radioimmunoassay，RIA）测定大鼠血清生殖激素T、FSH、LH。以t检验比较各实验组与模型组之间的差异。
2结果与分析
2.1 对实验大鼠的性器官、精子的影响
2.1.1 对实验大鼠生殖器官重量的影响
LW及其加味枸杞子方均能使实验组大鼠睾丸、附睾重量增加，不同组增幅不同，详见表1。
2.1.2 对实验大鼠精子的数量和质量的影响
Wistar大鼠以醋酸棉酚建造成生精障碍后，经LW不同剂型及其加味方治疗，实验各组的精子数量和质量均有显著改变，详见表2。
实验表明：模型组的精子数量显著低于正常对照组和LW各组，有非常显著性差异（P<0.01）；模型组精子30分钟爬高距离显著低于正常对照组和LW各组，差异有显著性（P<0.01， P<0.05）；模型组的精子指数与正常对照组、LW各组比较，有非常显著性差异（P<0.01），而LW加味枸杞子组对精子数和精子指数作用与LW不同剂型组比较亦有显著差异（P<0.01）。实验表明模型组大鼠睾丸的生精能力最差，而经LW各组治疗后，生精功能明显增强，以LW加味枸杞子方组最为显著。
精子活力观察：在精子计数之前在显微镜下观察精子的活力，模型组精子活力很差，a级精子很少，绝大多数精子原地缓慢移动；而正常对照组、LW不同剂型组和LW加味枸杞子组的精子活力明显优于模型组，精子活跃，多数直线运动，a级精子明显增多。
2.2 LW及其加味枸杞子对雄性大鼠生殖激素的影响 LW不同剂型及其加味枸杞子可显著影响实验各组大鼠的生殖内分泌激素水平，详见表3。
模型组大鼠血清的睾酮（T）水平显著低于正常对照组、LW煎剂和LW加味枸杞子组（P<0.01），LW煎剂组和LW加味组组间无显著性差异（P>0.05）。表明LW煎剂及其加味枸杞子可显著地提高生精障碍大鼠血清的睾酮水平。
模型组大鼠血清的促黄体生成素（LH）水平低于正常对照组和LW治疗后各实验组，有显著性差异（P<0.01）。LW不同剂型组和LW加味枸杞子组组间无显著性差异（P>0.05）。表明LW不同剂型及其加味枸杞子均可显著地提高生精障碍大鼠血清的LH水平。
模型组大鼠血清的促卵泡刺激素（FSH）水平高于正常对照组、LW煎剂和LW加味枸杞子治疗组（P<0.01，P<0.05），表明LW煎剂及其加味枸杞子可显著地降低生精障碍大鼠血清的FSH水平。
实验表明，LW丸剂对实验雄性大鼠生殖内分泌激素调节作用明显低于LW煎剂和LW加味枸杞子煎剂。
3讨论
棉酚的雄性抗生育作用主要是其能抑制精子的发生[6]。本实验模型组的精子数量、质量与正常对照组比较，均有显著性差异（P<0.01，P<0.05），表明用醋酸棉酚建造的大鼠生精障碍模型获得成功。
3.1对实验大鼠的性器官、精子的影响
睾丸与附睾的重量、精子的数量是睾丸生精功能的直接反映，本实验精子计数结果：模型组大鼠的精子数量最少，显著低于各LW给药实验组，有非常显著性差异（P<0.01），说明大鼠生精障碍大鼠经各LW给药组治疗后，睾丸的生精功能明显改善。
精子活力是精子质量的重要表现，显微镜下观察精子的活力情况，结果表明：模型组的精子较少，活动情况很差，大多数精子仅有缓慢的蠕动。各给药实验组的精子数量明显多于模型组，活力也明显优于模型组，大多数精子活跃地运动，a、b级精子显著增多。
精子爬高试验是评价精子活力（质量）的有效的方法[7]。实验结果表明：正常对照组和LW给药实验各组精子30分钟爬高均高于模型组，与模型组比较有显著性差异（P<0.01，P<0.05），LW各剂型及LW加味枸杞子组之间无显著差异。表明LW各剂型及其加味枸杞子均可显著提高实验大鼠精子的数量和质量。
3.2对雄性大鼠生殖内分泌激素的影响
生殖内分泌功能在男性不育中发挥重要作用。精子的发生是在下丘脑—垂体—睾丸的内分泌系统调控下进行的。
实验结果显示模型组的T水平显著低于正常对照组（P<0.01），说明醋酸棉酚损害了睾丸Leydig细胞的功能。LW煎剂及其加味方可使生精障碍大鼠血清的LH、T水平显著升高（P<0.01），FSH降低，说明LW煎剂及其加味方可能是通过调节下丘脑—垂体—睾丸轴，调节垂体FSH、LH的释放，激活下丘脑—垂体—睾丸轴的调节功能，使T维持在较高的水平，从而使精母细胞的减数分裂和精子的产生有了内分泌激素的保障，进一步促进生精障碍大鼠睾丸内精子的发生[8]。
3.3 LW不同剂型及其加味枸杞子对实验性生精障碍大鼠的治疗效果
本实验结果表明LW不同剂型和LW加味枸杞子对实验性生精障碍大鼠治疗后的性器官、精子质量与数量、生殖内分泌激素等指标综合判断，LW煎剂和LW加味枸杞子煎剂的疗效优于LW丸剂，以LW加味枸杞子煎剂的疗效最佳。实验結果提示有进一步深入研究的意义。
参考文献：
[1] 靳风烁，方玉华，邓晓洪.克罗米芬和六味地黄丸治疗男性不育的临床观察[J].中西医结合杂志，1991，11（6）：368-369.
[2] 王玉仁，鲁守彬.六味地黄汤加减治疗男性不育症30例[J].湖北中医杂志，1996，2：24-25.
[3] 李文献，宋向华.液化生精丸治疗男性不育症[J].河南中医，2002，22（5）：67-68.
[4] 王瑞林，战为平.六味地黄丸系列及氯米酚治疗排卵障碍不孕25例疗效与B超观察[J].吉林中医药，2000，20（4）：34.
[5] 王书鸿.六味地黄丸和其衍生方在临床上的应用[J].广西医学院学报，1985，2（3）：70.
[6] 薛社普，梁德才，刘 裕.男用节育药棉酚的实验研究[M].北京：人民卫生出版社，1983，2-66.
[7] 方奉谁.精子爬高实验在常规检验中的地位[J].广西医学，1991，13（6）：393-395.
[8] 史小林主编.人类生殖学[M].北京：科学出版社，2002：347-362.
作者简介：
朱 瑞（1984- ），女，安徽寿县人，学士，助理实验师。