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目的:
1.研究开发亲环境、灵敏、快速的DNA银染方法;
2.为分子生物学研究人员提供便捷的DNA银染方法。
方法:
选用葡萄糖、维生素C等亲环境银离子还原剂,考察影响银染效果的各个因素,如银染液的组成、固定时间、显影时间、水洗时间、显影液组分的影响,建立亲环境、灵敏、快速的DNA银染方法。
结果:
1.优化了传统的DNA银氨染色法,灵敏度达1.5-3pg/band,消除了戊二醛、铬等有毒增敏剂的使用,灵敏度高于传统的DNA银氨染色法近30倍,操作时间由22h缩减到40min,其操作步骤如下:
(1)水洗:电泳后,凝胶用去离子水水洗10min:
(2)银染:凝胶放入50mL银氨染色液中染色5min,银氨染色液的组分为0.2%AgNO3,0.7%NH4OH,0.4%NaOH:
(3)水洗:凝胶用去离子水中水洗2min:
(4)显影:凝胶在50mL显影液中显影4-6min,显影液的组分为0.01%柠檬酸,0.005%HCHO;
(5)终止:凝胶放入5%醋酸(HAc)中2min终止显影.
2.用亲环境的银离子还原剂葡萄糖取代DNA银染中的有毒银离子还原剂甲醛,建立了亲环境的DNA葡萄糖-银染方法,灵敏度达5-10pg/band.
(1)固定:电泳后,凝胶在7.5%HAc中固定10min;
(2)水洗:凝胶用去离子水水洗3次,每次5min;
(3)银染:凝胶放入50mL银染液中染色5min,染色液的组分为0.2%AgNO3;
(4)水洗:凝胶在去离子水中水洗2次,每次20s;
(5)显影:凝胶在50mL显影液中显影4-8min,显影液的组分为8%葡萄糖,100mM硼酸,250mMNaOH;
(6)终止:凝胶放入1.5%EDTA中5min终止显影.
3.用亲环境的银离子还原剂维生素C取代DNA银染中的有毒银离子还原剂甲醛,建立了亲环境的DNA维生素C-银染方法,灵敏度达10pg/band.
(1)水洗:电泳后,凝胶用去离子水水洗10min:
(2)银染:凝胶放入50mL银氨染色液中染色5min,银氨染色液的组分为0.2%AgNO3,0.7%NH4OH,0.4%NaOH;
(3)水洗:凝胶用去离子水中水洗2次,每次30s;
(4)显影:凝胶在50mL显影液中显影2-3min,显影液的组分为0.2%硫代硫酸钠,0.00125%维生素C;
(5)终止:凝胶放入5%Tris中2min终止显影.
结论:
新建立的DNA银染方法灵敏、便捷、亲环境,较好的实现了对聚丙烯酰胺凝胶上的DNA进行检测,适合于当前分子生物学的研究的需求。