铜(copper，Cu)是生物体必需的微量元素，直接参与生物体造血发生、神经发育、骨骼形成以及机体免疫等过程。在体内过量会导致鱼类幼鱼运动能力下调，还与多种神经退行性疾病的发生相关，但其调控神经发育的潜在分子机制至今仍鲜有报道。本研究以模式动物斑马鱼(Danio rerio )作为研究对象，通过基因芯片(microarray)技术发现铜胁迫导致幼鱼髓鞘和轴突导向基因表达下调。而髓鞘和轴突是神经元与肌肉等靶器官通讯的基础，且髓鞘和轴突损伤是多种神经退行性疾病的共同病理特征。因此本研究通过转录组分析、整体原位杂交(whole mount in situ hybridization，WISH)以及荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)技术对铜诱导斑马鱼幼鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子表型进行了详细的鉴定。随后，结合转录组测序和胚胎全基因组甲基化测序结果分析，鉴定了铜诱导髓鞘和轴突发育缺陷的关键调控因子，并利用CRISPR/Cas9敲除技术，Morpholinos(MO)敲降技术以及过表达实验，对上述关键调控因子的功能进行了深入的研究，最后借助铜转运突变体，阐明了它们在铜诱导髓鞘和轴突发育中的功能，揭示了铜胁迫导致斑马鱼中枢神经系统(central nervous system，CNS)髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机理。本文主要研究结果如下：
　　1、铜胁迫导致斑马鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷
　　通过表型观察及整体原位杂交检测发现，铜胁迫会导致胚胎孵化率降低、运动能力降低，神经标记基因表达量下调。基因芯片进一步分析发现，铜胁迫造成斑马鱼髓鞘与胶质细胞、轴突导向等神经系统相关的基因表达量下调。接着对髓鞘和轴突的超微结构进行电镜观察发现铜胁迫会导致脊髓处髓鞘变薄甚至是脱失，轴突直径变小。整体原位杂交以及髓鞘和轴突转基因鱼的实时观察结果显示铜胁迫导致脊索处髓鞘和轴突发育缺陷。上述结果表明，铜胁迫导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。
　　2、铜通过抑制Wnt/Notch-hoxb5b信号通路抑制CNS髓鞘和轴突的发育
　　通过基因芯片和整体原位杂交对其调控机理进一步分析时发现转录因子hoxb5b在铜胁迫胚胎中显著性下调。利用Morpholinos(MO)敲降hoxb5b后胚胎呈现与铜胁迫胚胎类似的表型。此外，通过CRISPR/Cas9技术构建hoxb5b突变体，hoxb5b基因敲降和敲除的幼鱼都呈现铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷。并且hoxb5b过表达后可以拯救铜胁迫导致的孵化率降低以及CNS髓鞘和轴突发育缺陷，表明铜通过抑制hoxb5b诱导CNS髓鞘和轴突发育缺陷。此外，铜胁迫导致Wnt和Notch信号通路相关基因表达下调，而Wnt和Notch信号通路激活后可以拯救铜胁迫导致的hoxb5b及CNS髓鞘和轴突发育缺陷。综上所述，铜通过Wnt和Notch信号通路抑制hoxb5b的表达进而导致斑马鱼幼鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷。
　　3、铜诱导的fam168等基因的高甲基化及其转录水平降低促进CNS髓鞘和轴突发育缺陷的产生
　　全基因组甲基化分析结果显示，在铜胁迫胚胎中，26个基因甲基化水平显著性上调，其中pou3f1、pou3f2和fam168b与髓鞘和轴突的发育相关，而这些基因以及fam168b的同源基因fam168a的转录水平在铜胁迫组中显著性下调。整体原位杂交结果显示fam168a和fam168b的基因表达模式相似，且与pou3f1的表达也类似。通过转录组测序分析发现，fam168a和fam168b基因敲降胚胎都呈现pou3f1基因敲除胚胎类似的神经和突触发育缺陷。通过整体原位杂交和qRT-PCR进一步的探究发现，fam168a和fam168b功能缺失幼鱼都呈现出CNS髓鞘发育缺陷，与pou3f1基因敲除以及铜胁迫的幼鱼有类似的表型。此外，fam168a，fam168b和pou3f1过表达后可以部分拯救铜胁迫导致的CNS髓鞘和轴突发育缺陷，表明铜胁迫导致的fam168b、pou3f1和pou3f2的高甲基化调控及其转录水平的下调促进CNS髓鞘发育缺陷的产生。
　　4、铜诱导的fam168b基因的高甲基化与其转录水平下降之间的调控关系
　　fam168b启动子高甲基化区域5’缺失片段活性分析结果显示fam168b高甲基化区域的缺失导致fam168的表达降低，表明铜胁迫胚胎中上述基因的高甲基化调控其转录表达。但铜胁迫后fam168b转录水平的下调先于甲基化水平的上调，表明区域甲基化可能是转录复合物和染色体DNA结构变化的次要结果。
　　5、Hoxb5b信号因子与fam168a/fam168b/pou3f1等高甲基化基因之间的调控关系
　　整体原位杂交和qRT-PCR结果显示，hoxb5b功能缺失胚胎中fam168a、fam168b和pou3f1的表达显著性上调，而fam168a、fam168b和pou3f1功能缺失的胚胎hoxb5b转录水平显著上调。而fam168a、fam168b、pou3f1和hoxb5b的转录同时被抑制时会导致铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷，表明fam168a/fam168b/pou3f1与Wnt&Notch-hoxb5b信号在铜胁迫胚胎中发挥互为跷跷板的功能，且两条途径共同作用导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。
　　6、铜通过cox17/atp7b调控Wnt/Notch-hoxb5b及fam168a/fam168b/pou3f表观因子共同诱导髓鞘和轴突发育缺陷
　　通过整体原位杂交和qRT-PCR检测不同铜转运突变体幼鱼铜胁迫后髓鞘基因的表达，结果显示，在cox17-/-突变体中，fam168a、fam168b和pou3f1表达量下调，而在atp7b-/-突变体中，pou3f1表达量下调，而fam168a和fam168b的表达量没有显著性差异，此外，hoxb5b在atp7b-/-突变体中表达下调，在cox17-/-突变体中表达不变，表明胚胎铜胁迫后可能导致ROS进而影响Wnt&Notch-hoxb5b信号对髓鞘和轴突发育造成影响，但不影响pou3f1/fam168a/fam168b的甲基化和转录调控。因此，cox17缺失后，铜可能通过影响染色质结构调控表观因子pou3f1/fam168a/fam168b导致髓鞘和轴突发育缺陷。同样的，在atp7b-/-突变体中，铜可以通过抑制Wnt&Notch-hoxb5b导致髓鞘和轴突发育缺陷。