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目的:非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）影响着全球约四分之一的人口。目前仍未有FDA批准的治疗药物,临床上主要以改变饮食和生活方式作为治疗的主要手段,辅以药物治疗（包括胰岛素增敏剂、抗氧化剂、降脂药等）,但西药作用靶点单一、副作用较多,长期安全性和有效性仍存在争议。二黄祛脂方（Er Huang Qu Zhi recipe,Er H）是新疆兵团国医大师袁今奇教授根据中医理论和临床经验得出治疗NAFLD的经验方,临床治疗效果显著,目前对于该复方治疗NAFLD的作用机制尚不明确,不利于临床疗效提升及相关新药研究。本课题拟从小鼠体内模型评价Er H治疗NAFLD的药效学特点,结合超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析和系统药理学方法筛选成药分子及预测相关靶标通路,在体外模型上初步探讨Er H中代表活性成分刺甘草查尔酮（Echinatin,Ech）对游离脂肪酸（Free fatty acids,FFA）诱导Hep G2细胞凋亡的对抗作用,从中药复方药理学角度研究Er H治疗NAFLD的机理并提供初步理论依据。方法:1.Er H方剂组成与成药性分子靶标预测:综合2020版《中国药典》、多数据库及UHPLCMS/MS分析Er H中药物归经、活性成分、作用靶标以及疾病相关靶标信息,预测关键成药性分子靶标并进行富集分析;2.小鼠体内NAFLD模型建立:蛋氨酸-胆碱缺乏（Methionine and Choline-Deficient,MCD）饮食喂养C57BL/6J小鼠4周成功建立体内NAFLD模型,综合组织外观观察、肝功检测以及病理切片染色等结果分析Er H对于小鼠脂质代谢、炎症以及纤维化发展的影响;3.FFA诱导NAFLD体外模型建立:不同浓度FFA诱导Hep G2细胞,结合细胞活力测定、油红O染色和Nile Red染色判断脂质积累情况以及观察细胞形态变化确立FFA用于诱导Hep G2细胞建立体外NAFLD模型的适宜浓度;4.代表成分药效学研究:基于荧光探针染色、透射电子显微镜观察、细胞流式术等技术探究Er H中的关键活性成分Ech对于体外NAFLD模型的作用;5.Er H及代表成分的分子机制研究:借助IHC染色、RCR技术、分子对接技术以及Western blotting实验检测Er H及其关键活性成分对炎症、纤维化和凋亡关键通路的蛋白表达量的影响。结果:1.系统药理学分析得Er H治疗NAFLD主要参与炎症反应、细胞凋亡和纤维化反应等生物过程,与MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路等信号通路密切相关,提示Er H在NAFLD病程的多个阶段发挥作用;2.MCD饮食喂养C57BL/6J小鼠4周成功建立NAFLD模型。体内药效学结果显示,Er H干预改善了MCD饮食诱导的小鼠肝脏状态,显著降低了肝脏甘油三酯（TG）水平,油红O染色结果示Er H减轻了脂质积累,综合HE染色NAS评分以及Masson染色结果,Er H缓解了MCD饮食诱导的炎症和纤维化的发展;3.Er H的治疗降低了MCD饮食诱导的小鼠肝脏组织SREBP-1c和FATP2的m RNA表达量,降低了炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的m RNA表达量以及NF-κB p65和i NOS的蛋白表达量,同时F4/80 IHC染色的阳性表达减少。与MCD组相比,Er H降低了α-SMA的在肝脏组织中的阳性表达,同时降低SMAD2/3的蛋白表达量,缓解了纤维化的发展。Er H降低了BAX的蛋白表达量和Caspase3的活性,并增加了BCL-2蛋白表达量,主要是与抑制了ASK1-JNK信号通路有关;4.确定0.75 m M FFA诱导Hep G2细胞48 h建立体外NAFLD模型;基于该模型,发现Ech可减少FFA诱导后Hep G2细胞脂质积累,增加细胞线粒体膜电位以及改善线粒体超微结构的损伤。DCFH-DA以及CMF-DA荧光染色结果示Ech可缓解FFA诱导细胞内的氧化应激水平。细胞流式术以及Hoechst 33258染色结果中Ech可以显著减少FFA诱导Hep G2细胞的凋亡;Ech可降低FFA诱导后Hep G2细胞内NF-κB p65、BAX的蛋白表达量,主要是通过降低了ASK1的蛋白表达量和JNK磷酸化。结论:综上所述,本课题结合系统药理学技术以及体内验证,首次阐明了Er H治疗NAFLD的作用机理。Er H通过对MCD诱导的NAFLD小鼠中ASK1-JNK信号通路的抑制,抑制ASK1和JNK的磷酸化,减轻了小鼠肝脏的凋亡,进一步影响NF-κB通路,缓解了小鼠炎症情况,同时提示Er H至少部分通过抑制肝星状细胞的激活以及Smad 3通路缓解肝脏纤维化进程;Er H中的关键活性成分Ech可改善FFA诱导的体外NAFLD模型的脂肪变性、线粒体功能障碍、氧化应激以及凋亡,对NAFLD的保护作用与ASK1-JNK信号通路的抑制相关。