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研究目的:糖尿病视网膜病（diabeticretinopathy,DR）是常见且严重危害生活质量的糖尿病慢性并发症之一,其早期特征性病理改变为高血糖引起的视网膜微血管周细胞（pericytes,PCs）凋亡。研究显示血清促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）水平与DR存在关联,并可能是DR的独立危险因素之一,然而这一观点尚未得到一致认可,且其潜在作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨TSH水平是否与糖尿病患者DR患病率相关,以及TSH在DR中的作用,并初步阐明其潜在作用机制。研究方法:为探讨TSH与DR的相关关系及其作用机制,本研究拟从整体、细胞及分子三个层面展开。第一部分临床研究1.研究对象:本研究中的研究人群为2018.01至2019.07于北京医院内分泌与代谢病科住院治疗的成年2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者。2.资料收集:我们收集整理了 1,121例患者的临床资料,包括患者性别、年龄、糖尿病病程、用药史等,及身体质量指数（body mass index,BMI）、血压、血脂、血糖、甲状腺功能、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin Alc,HbA1c）、眼底成像等相关辅助检查结果。根据纳入标准进行严格筛选后,共纳入符合研究标准的365例DR患者及633例非DR患者。3.统计分析:3.1以是否患DR进行分组,采用非正态Mann-Whitney u检验比较两组之间基线临床资料中连续变量及分类变量之间的差异;采用卡方检验比较两组间二分类变量之间的差异。双侧检验p<0.05可认为组间差异具有统计学意义。3.2所纳入的患者游离三碘甲状腺原氨酸及游离甲状腺素均在正常参考值范围内,以血清TSH水平进行分层,将研究对象分为4组,即TSH 0-0.35μIU/ml;TSH 0.35-2.49 μ IU/ml;TSH 2.49-5.55 μ IU/ml 以及 TSH>5.55 μ IU/ml 组。采用卡方检验分析各组TSH水平与DR患病率及DR严重程度是否存在差异。双侧检验p<0.05可认为组间差异具有统计学意义。3.3采用单因素及多因素Logistic回归分析探讨血清TSH水平与DR的相关关系。第二部分体外研究1.为验证葡萄糖刺激对人视网膜微血管PCs的影响,我们体外培养人视网膜微血管周细胞HRMVPC-immortalized细胞系,给予不同浓度葡萄糖（0、10、20、30 mM）刺激24 h,观察不同葡萄糖浓度孵育对该细胞系细胞凋亡的影响。1.1 western blot观察Bcl-2家族蛋白Bcl-2及Bax表达水平。1.2以30 mM葡萄糖作为后续实验处理浓度,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测及TUNEL染色检测细胞凋亡率。1.3 MitoSOXTM Red染色观察细胞线粒体内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）簇集水平。1.4 JC-1染色,共聚焦显微镜下观察线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）水平。1.5丙二醛（malondialdehyde,MDA）检测试剂盒检测细胞脂质过氧化损伤水平。1.6化学发光法检测细胞ATP合成水平。1.7 western blot观察高葡萄糖刺激后线粒体凋亡关键蛋白cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3,以及促凋亡蛋白P53、PDCD 5的表达水平。2.为探讨TSH对高葡萄糖诱导的PCs凋亡的影响,我们在高葡萄糖刺激的基础上,给予不同浓度（0、1、2、4μM）的牛TSH（bovine TSH,bTSH）刺激24 h,采用上述检测方法检测bTSH对高葡萄糖刺激所诱导的细胞凋亡及线粒体凋亡通路的影响。3.TSH需与细胞膜表面的特异性受体结合方能发挥其生物学效应。为验证PCs是否表达TSH受体（TSH-receptor,TSHR）,我们以人甲状腺滤泡上皮细胞系（Nthy-ori 3-1）作为阳性对照,采用western blot从蛋白水平检测TSHR表达,采用免疫荧光观察其在细胞中的定位,采用PCR从mRNA转录水平检测其表达。4.为进一步证实PCs所表达的TSHR为具有生物学活性的受体,我们以中国仓鼠卵巢癌细胞系（Chinese hamster ovarian cancer cell line,CHO）作为阴性对照（不表达TSHR）,给予细胞内源性磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤（isobutylmethylxanthine,IBMX）预处理30 min后,分别给予bTSH（2μM）及腺苷酸环化酶激活剂Forskolin（50μM）处理1h,采用酶联免疫吸附法检测刺激后细胞中cAMP水平。5.TSHR小干扰RNA（si-RNA）转染细胞后,western blot检测TSHR表达水平,明确转染效率。同时检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3,及促凋亡蛋白P53、PDCD 5的表达水平,明确TSHR是否参与TSH促凋亡过程。本研究结果如下:1.血清TSH水平为DR的独立危险因素:1.1与非DR组相比,DR组的女性患者比例更高（38.36%vs.31.12%,p=0.02）、年龄更大（61年vs.59年,p=0.001）。此外,我们观察到,DR组的糖尿病病程（16年 vs.10 年,p<0.001）、收缩压（134 mmHgvs.131 mmHg,p=0.001）、HbAlc水平（8.90%vs.8.60%,p=0.032）和 TSH 水平（2.54 IU/L vs.1.47 IU/L,p<0.001）均显着高于非DR组。而两组之间BMI,舒张压,血清脂质-脂蛋白水平,吸烟和饮酒史等无显著差异（p≥0.05）。1.2血清TSH水平不同层级之间DR患病率存在显著性差异（8.3%、25.5%、64.4%及95.8%,p<0.001）,提示TSH水平与DR发生风险相关。1.3在校正年龄、性别、糖尿病病程、血压及HbAlc等混杂因素的影响后,血清TSH水平仍与DR患病率呈正相关关系,OR=2.294,95%CI[1.925-2.733],p<0.001。1.4血清TSH水平分层间DR严重程度无显著差异（0%、5.1%、8.8%及4.3%,p=0.556）,本研究未发现TSH与DR严重程度之间存在相关性。2.葡萄糖刺激诱导细胞发生凋亡:western blot检测显示Bcl-2家族蛋白中Bcl-2表达下调、Bax表达上调,Bax/Bcl-2比值升高（p<0.05）,且呈剂量依赖性。同时,Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测及TUNEL染色均显示高葡萄糖（30 mM）组细胞凋亡率升高,证实葡萄糖刺激可呈剂量依赖性促进细胞凋亡的发生。3.高葡萄糖刺激激活线粒体凋亡通路:高葡萄糖刺激导致细胞线粒体内ROS簇集增加,MMP下降（p<0.05）。同时MDA水平升高,ATP合成下降（p<0.05）。证实高葡萄糖刺激可引起线粒体结构及功能损伤。同时,高葡萄糖刺激可上调线粒体凋亡相关蛋白cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3,及促凋亡蛋白 P53、PDCD 5 的表达水平（p<0.05）。4.bTSH通过激活线粒体凋亡通路加剧高葡萄糖诱导的细胞凋亡:在高葡萄糖刺激的基础上给予bTSH刺激24 h后,PCs中Bcl-2表达相比于高葡萄组下调、Bax表达上调,Bax/Bcl-2比值进一步升高（p<0.05）,且细胞凋亡率进一步升高,同时,bTSH刺激还可进一步加剧线粒体结构及功能损伤,并上调线粒体凋亡相关蛋白的表达水平（p<0.05）。表明bTSH可进一步加重高葡萄糖诱导的细胞线粒体凋亡。5.人视网膜微血管PCs表达具有生物学活性的TSHR:western blot及PCR分别从蛋白及mRNA转录水平证实PCs稳定表达TSHR。此外,Forskolin及bTSH刺激均可使PCs中cAMP水平较前显著升高（p<0.05）,在阴性对照细胞中,Forskolin刺激后,细胞中cAMP水平升高（p<0.05）,而bTSH刺激后细胞中cAMP水平较自身对照组无明显变化（p≥0.05）。表明PCs表达具有生物学效应的TSHR。6.TSHR参与调节TSH的促凋亡过程:采用si-RNA转染下调TSHR的表达后,细胞可对抗TSH的促凋亡作用。由此我们推断TSHR在TSH诱导的PCs线粒体凋亡中发挥不可或缺的作用,即TSH对PCs的促凋亡作用是TSHR依赖性的。结论:1.T2DM患者DM病程、HbAlc水平及血清TSH水平均为DR的独立危险因素。2.T2DM患者血清TSH水平与DR患病率呈正相关关系,而与PDR的患病率无明显相关关系,即TSH水平与DR的严重程度不相关。3.高葡萄糖刺激可诱导人视网膜微血管PCs发生线粒体凋亡。4.TSH可进一步加重高葡萄糖诱导的细胞凋亡。5.PCs稳定表达具有生物学效应的TSHR,而TSH可通过作用于TSHR激活PCs线粒体凋亡通路,即TSH可通过激活TSHR依赖的线粒体凋亡通路进一步加重高葡萄糖所诱导的PCs内源性细胞凋亡。