目的神经丝(NFs)是成熟神经元中主要的中间丝,是神经元主要的细胞骨架成分,它与轴突形态的维持、信号转导以及轴浆运输有密切关系。NFs主要由五种蛋白组成,即构成神经丝蛋白三组分的低分子量神经丝亚单位(NFL)、中分子量神经丝亚单位(NFM)和高分子量神经丝亚单位(NFH),此外还包括α-互联蛋白以及外周蛋白。其中NFM在维持NFs的形态上起关键作用,轴突的直径则是由其决定的。NFM代谢以及合成的改变与许多疾病相关,有望成为多种疾病的生物标志物,因此检测血液或脑脊液中NFM含量有助于为疾病的早期诊断及预后做出判断。目前虽然NFM的检测方法很多,但是尚缺乏一种较为理想的、能用于临床检测的方法,因此研究灵敏度高,特异性强的NFM检测方法十分必要。本研究拟制备抗NFM抗体及其标准品,并初步建立NFM ELISA检测方法。方法1.NFM单克隆抗体(McAb)及多克隆抗体(PcAb)的制备、鉴定、纯化及标记分析人、大鼠、小鼠NFM氨基酸序列,选择人NFM中的三段肽P1、P2、P3,人工合成并将其与匙孔槭血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫Balb/c小鼠,摘眼球取血,ELISA检测抗体效价,Western blot及免疫组化方法(IHC)检测各抗体与人、大鼠、小鼠脑组织中NFM的反应性。选择P1、P2两段多肽免疫新西兰大白兔以大量收获血清。本室已制备的抗P2、P3的两株杂交瘤细胞株通过体内诱生腹水法对McAb进行大量制备。亲和层析对血清及腹水中的抗体进行纯化,并对纯化后各抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)。2.NFM蛋白的表达及纯化从人脑胶质瘤中提取mRNA,逆转录为cDNA,PCR扩增NFM基因并与pMD19-T Simple连接构建克隆载体,将其转化至大肠杆菌DH5α,经蓝白斑及氨苄青霉素筛选,测序正确后酶切目的基因并与pET-30a连接构建表达载体,转化大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot对菌体所表达的蛋白进行鉴定。收集菌体超声破碎,并使用亲和层析纯化NFM上清并进行蛋白定量。3.NFM双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立应用双抗体夹心法筛选最佳抗体对,方阵法检测抗体的工作浓度,NFM蛋白梯度稀释作为标准品,初步建立ELISA检测方法。4.NFM双抗体夹心ELISA的灵敏度和特异性检测建立起的检测方法通过稀释法检测方法的检测限,并应用其他蛋白如BSA检测特异性。结果1.NFMMcAb及PcAb的制备、鉴定、纯化及标记成功制备抗NFM抗体。IHC结果显示,P1、P2、P3三种抗体均能够与人脑组织胶质瘤、大鼠和小鼠脑组织中的NFM反应,Wesnternblot结果显示,抗P1PcAb可与人脑胶质瘤、大鼠和小鼠脑组织中NFM反应,其余抗体不反应。兔血清及小鼠腹水抗体效价均大于128000,成功纯化抗P1 PcAb、抗P2 PcAb、抗P2 McAb及抗P3 McAb并成功标记。2.NFM蛋白的表达及纯化成功构建pMD19-T-NFM克隆载体及pET30a-NFM表达载体,SDS-PAGE及Western blot结果表明NFM蛋白已成功表达,各抗NFM抗体及抗His抗体均能与NFM蛋白发生反应。NFM纯化后得到了较高纯度的NFM蛋白标准品。浓度为500mg/mL,经灰度分析纯度为90.9%。3.NFM双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立当捕获抗体为抗P3McAb,检测抗体为抗P2-HRPPcAb时,NFM浓度与吸光度之间有线性关系,且捕获抗体及检测抗体的最佳浓度分别为20μg/mL、1μg/mL。NFM浓度在3.9～62.5μg/mL时有较好线性关系,线性方程为Y=116.27X+16.895,R2=0.9934。4.NFM双抗体夹心ELISA的灵敏度和特异性检测方法检测限为3.9μg/mL,与BSA无反应,特异性较好。结论成功表达并纯化了NFM蛋白,制备了抗NFM McAb及PcAb,且用所制备的抗原抗体建立了NFM定量检测双抗体夹心ELISA方法,特异性高,但是本检测方法中部分条件还有待进一步优化。